软骨细胞去分化研究进展

关节软骨修复一直是临床难题,软骨组织工程发展为软骨修复提供了新思路并取得了一定突破,然而体外培养软骨细胞去分化现象极大地限制了该技术进一步发展。多种机制参与软骨细胞去分化过程,包括软骨细胞自身老化及相关基因、信号转导通路等。该文就软骨细胞去分化及其相关机制研究进展作一综述。     

体外培养过程中去分化的人软骨细胞基因表达谱的变化

目的研究体外单层培养对人软骨细胞去分化的基因谱的影响,从而筛选出与人软骨细胞去分化的相关基因。方法取体外培养的第一代（P1）功能良好的人肋软骨细胞为对照组,而体外培养至第四代（P4）去分化的软骨细胞为实验组,取mRNA分别用Cy3,Cy5荧光标记,制作cDNA探针,采用BiostarH-80s含8300点的基因芯片表达谱分析P1及P4软骨细胞表达差异的基因,采用GenePixPro3.0软件分析,P1及P4人肋软骨细胞基因表达水平差异≥2倍时,被认为差异有统计学意义,重复3次。结果在8300点的相关基因中,P1及P4间存在差异的基因共140个,占总数的1.6%,其中在P4去分化软骨细胞中上升的基因56个,其中9条为与胞外基质降解及代谢相关基因,8条与应激、炎性反应相关基因,10条为生长抑制和细胞凋亡相关基因。而在P4中下调的基因84个,其中12条为蛋白质合成和能量代谢相关基因,16条为细胞周期和有丝分裂相关基因,12条为细胞骨架蛋白和信号传导相关基因。结论P4去分化细胞中基因表达特征为细胞外基质代谢失调,表现为基质合成相关基因表达下降,而降解酶类基因表达上升,应激与炎性反应亢进,凋亡蛋白合成增加,细胞分裂能力下降及离子转运能力下降,与软骨细胞去分化的病理生理特征相符。     

丹参酮ⅡA磺酸钠注射液对糖尿病患者血液流变学的影响

目的:观察丹参酮ⅡA磺酸钠注射液对糖尿病患者液流变学的影响.方法:60例糖尿病患者随机分为治疗组和对照组各30例,治疗组30例在对照组基础上给予丹参酮ⅡA磺酸钠注射液,治疗前后分别检测两组患者血液流变学参数.结果:治疗组治疗后各项血液流变学指标与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:丹参酮ⅡA磺酸钠注射液能有效改善糖尿病患者血液流变学异常的作用.     

丹参酮ⅡA对肾成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

目的研究丹参酮ⅡA（TSN）对结缔组织生长因子（CTGF）诱导肾间质成纤维细胞增殖及胶原合成的作用,探讨TSN抗肾纤维化的可能机制。方法体外培养大鼠肾成纤维细胞株NRK／49F,分别以2．5、5．0、10ng／ml CTGF刺激细胞;或先用不同浓度（10^-6、10^-5、10^-4mol／L）TSN预处理再以5ng／ml CTGF刺激细胞。四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞增殖情况,酶联免疫吸附法（ELISA）测定细胞培养液中Ⅰ、Ⅳ型胶原含量。结果CTGF在一定范围内以剂量依赖方式诱导NRK／49F细胞增殖及胶原合成。不同浓度TSN预处理的作用强度有所不同：10^-6mol／LTSN预处理后,细胞增殖和Ⅰ、Ⅳ型胶原合成几乎不受影响;10^-5和10^-4mol／LTSN预处理后,细胞增殖率分别降低31．82％、40．91％,Ⅰ型胶原含量下降36．10％、54．13％,Ⅳ型胶原含量下降29．73％、49．15％。结论TSN抗肾纤维化作用可能与其抑制CTGF诱导的肾间质成纤维细胞增殖和细胞外基质（ECM）的合成有关。     

三维共培养体系促进去分化的软骨细胞再分化的实验研究

目的探讨海藻酸钠水凝胶三维共培养体系对去分化的软骨细胞再分化的影响。 方法将第1代(P1)软骨细胞及第4代(P4)软骨细胞分别与ATDC5按3 ∶1的比例在海藻酸钠水凝胶内进行三维共培养,即AP1组及AP4组。另建立单纯P1、P4及ATDC5的三维培养体系,即P1、P4及ATDC组,全部以软骨诱导液为培养基,提供外源性转化生长因子(TGF-β3)。培养28 d后,通过Q-PCR检测Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖基因的表达情况,组织学染色观察等手段,比较各组的Ⅱ型胶原及蛋白聚糖基因的表达水平,结果以Bonferroni检验法进行统计学分析。 结果AP4组中Ⅱ型胶原及蛋白聚糖基因的表达明显上调,且与P1、P4组的差异有统计学意义(Ⅱ型胶原：F＝38.41,P<0.01;蛋白聚糖：F＝5,P<0.01),且在组织学染色上也能观察到相关蛋白产物明显沉积。 结论三维共培养体系能让去分化的软骨细胞重新出现其特有的表型,其机制涉及细胞因子及细胞直接接触等方面。     

Cathepsin K基因抑制后对软骨细胞功能的影响研究

目的研究应用RNA干扰技术早期抑制人CathepsinK（CTSK）基因的表达对延缓软骨细胞的去分化过程及维持软骨细胞表型的影响。方法pGCsilencer TMH1／Nco／GFP／CTsKRNAi质粒体外转染人软骨细胞,并用G418筛选3周．再通过RT—PCR检测CTSK、Ⅱ型胶原和AggrecancDNA转录的表达,Western-Blot、免疫荧光检测转染后软骨细胞的CTSK、Ⅱ型胶原和Aggrecan在蛋白水平的表达。结果装入质粒载体转染第1代的软骨细胞,在体外通过细胞形态观察可发现,抑制CTSK基因后3周软骨细胞仍大多数保持多角形,而对照组则向成纤维样细胞形态变化。RT—PCR结果显示,在mRNA水平抑制了CTSK的表达,而不影响对软骨细胞Ⅱ型胶原和Aggrecan的mRNA表达。免疫荧光和Wesfem—blot的结果证实了在早期抑制了软骨细胞CTSK基因表达并维持3周左右。软骨细胞的特异性基质Ⅱ型胶原和Aggrecan在蛋白水平明显增加。结论早期抑制了软骨细胞CTSK基因的表达,可使软骨细胞去分化过程中其软骨特异性基质Ⅱ型胶原和Aggrecan增加,说明可以维持软骨细胞的表型。     

Wnt对软骨细胞分化的调控

该研究以鸡胚肢芽为实验对象,通过原位杂交、逆转录病毒感染和微团培养等技术,探讨了Wnt的不同亚型在体内外调控软骨形成过程中的信号传导途径及其对肢体发育影响的调节机制。结果发现,Wnt5b和Wntll的表达限于增殖前的软骨细胞内,Wnt5a的表达位于关节区和软骨膜区,Wnt4在发育中的软骨和关节内皆有表达,并且Wnt5b、Wntll在表达时间和区域方面,与     

丹参酮ⅡA对兔胆管成纤维细胞的影响

目的:观察丹参有效单体成分丹参酮ⅡA对兔胆管成纤维细胞增殖活性及胶原代谢的影响。方法:分离培养日本大耳白兔胆管成纤维细胞。将成纤维细胞随机分为对照组和丹参酮ⅡA组,用MTT法检测不同浓度丹参酮IIA溶液作用24、48、72h对其增殖活力的影响;应用Elisa法检测丹参酮ⅡA作用48h后其I型胶原分泌量的变化,采用RT-PCR方法检测丹参酮IIA对其基质金属蛋白酶(MMP)-9mRNA表达的影响。结果:与对照组相比,0.1、0.5、2.5μg/mL浓度的丹参酮IIA对兔胆管成纤维细胞增殖无明显影响(P0.05),10μg/mL浓度的丹参酮IIA作用72h可抑制胆管成纤维细胞增殖(P0.05),25μg/mL浓度的丹参酮IIA,24h即表现出对兔胆管成纤维细胞增殖明显的抑制作用(P0.05),且随着药物作用时间的延长,抑制作用增强。丹参酮ⅡA组成纤维细胞Ⅰ型胶原分泌水平较对照组显著降低(P0.01)。其MMP-9mRNA的表达较对照组明显升高(P0.05)。结论:丹参酮ⅡA能够抑制良性狭窄胆管成纤维细胞增殖及胶原的分泌,能诱导MMP-9mRNA的表达而促进胶原降解,从而抑制胆道瘢痕的形成。     

丹参酮Ⅱ A对生长期大鼠骨密度及骨形态计量学影响的研究

目的研究丹参酮ⅡA对生长期大鼠骨密度及骨形态的影响,并探讨其可能的机制,对其预防与治疗骨质疏松症的疗效作出初步判断。方法 1月龄雌性Wistar大鼠30只,随机分为丹参酮ⅡA组[11 mg/(kg·d),n=10]、淫羊藿苷组[阳性对照,25 mg/(kg·d);n=10]和正常对照组(相同体积蒸馏水,n=10)。每两周称取一次体重,每月用双能X射线骨密度仪检测全身骨密度;若组间全身骨密度差异有统计学意义,处死所有实验动物。测定椎骨和右侧股骨的离体骨密度;品红-苦味酸染色(van-gieson,VG)进行骨形态分析;ELISA法检测血清抗酒石酸性磷酸酶5b(TRACP 5b)和骨钙素(osteocalcin,OC)的水平。结果大鼠的体重比较差异无统计学意义(P0.05);第1个月全身骨密度无明显差异(P0.05),第2个月给药组全身骨密度均显著高于对照组,与对照组相比,丹参酮ⅡA组和淫羊藿苷组大鼠全身骨密度、椎骨骨密度、股骨骨密度、骨小梁数目、骨小梁厚度、骨小梁面积和血清OC均有所增加,差异均有统计学意义(P0.05);而骨小梁间隙和血清TRACP 5b均减小,差异具有统计学意义(P0.05)。丹参酮ⅡA组和淫羊藿苷组差异没有统计学意义(P0.05)。结论丹参酮ⅡA可通过提高大鼠骨密度及骨质量来预防与治疗OP,对探索抗骨质疏松中药单体新药有非常重要的意义。     

丹参酮ⅡA磺酸钠注射液对胃肠外科手术切口愈合的影响研究

目的分析并探讨丹参酮ⅡA磺酸钠注射液促进胃肠外科手术切口愈合的临床效果,从而为临床治疗方案的选择提供依据。 方法选择2014年1月至2015年6月收治的胃肠手术患者120例为研究对象,采用随机数字表的方法分为观察组与对照组,各60例。对照组患者给予常规应用抗生素及其他对症药物,观察组则在对照组的基础上加用丹参酮ⅡA磺酸钠注射液,比较两组患者切口愈合时间、不良情况发生率,术前及术后1、3、5 d的C反应蛋白（CRP）及全血黏度水平。 结果观察组平均切口愈合时间为（7.06±0.71）d,对照组为（9.27±0.82）d,观察组切口愈合时间明显短于对照组（t=15.782,P<0.01）。对照组的切口感染率为10.00%（6/60）,切口液化率为13.33%（8/60）;观察组未发生切口感染病例,切口液化率为1.67%（1/60）,经比较均高于对照组（χ²=6.316、5.886,P=0.012、0.015）。两组患者术前CRP、全血黏度指标差异无统计学意义,术后观察组恢复更加明显（P<0.05）。 结论丹参酮ⅡA磺酸钠注射液对于胃肠外科手术切口的愈合具有一定的促进作用,可有效地控制切口脂肪液化,加快患者切口一期愈合时间。     

丹参酮ⅡA磺酸钠治疗不稳定型心绞痛疗效观察

目的观察丹参酮ⅡA磺酸钠治疗不稳定型心绞痛的疗效。方法将117例患者随机分为两组,对照组予以常规抗心绞痛治疗;治疗组同时加用丹参酮HA磺酸钠50mg＋5％葡萄糖或0．9％氯化钠100～250mL静滴,1次／d,疗程14d。结果治疗组总有效率明显高于对照组（P〈0．05）;全血粘度（高切、低切）、血浆粘度、红细胞聚集指数、总胆固醇、甘油三脂均明显下降,差异有统计学意义（P〈0．05）。治疗期问无不良反应。结论丹参酮ⅡA磺酸钠注射液治疗心绞痛疗效满意。     

丹参酮ⅡA对鼠环孢素性牙龈增生及Bcl-2阳性表达影响的研究

目的：观察丹参酮ⅡA对大鼠环孢素A(CyclosporinA,CsA)性牙龈增生上皮内Bcl-2表达的影响。方法：30只7周龄雄性Wistar大鼠随机等分为3组(对照组、CsA组、CsA+TanⅡA组),每组再随机等分为2个亚组(10 d组和20 d组)。实验周期结束时取材并制作切片,选择相同部位分别行HE染色及免疫组化PV两步法,于显微镜下观察并测量各组大鼠颊侧牙龈上皮面积和最长钉突长度,计数最长钉突内Bcl-2蛋白阳性细胞表达数,行完全随机分组两因素析因设计的方差分析。结果：颊侧牙龈上皮面积、最长钉突长度、抗凋亡蛋白Bcl-2阳性细胞数,CsA组显著大于对照组和CsA+TanⅡA组(P<0.05);而CsA+TanⅡA组和对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论：在本试验周期内,TanⅡA能有效地预防CsA引起的大鼠牙龈上皮增厚,Tan ⅡA抑制大鼠CsA性牙龈增厚上皮内抗凋亡蛋白Bcl-2的表达可能是其机制之一。     

骨髓间质干细胞向软骨细胞表型定向诱导分化的实验研究

目的 研究体外培养的猪骨髓间质干细胞（Bone Marrow Stem Cells,MSCs)在特定培养液作用下向软骨细胞表型转化，探讨其作为组织工程化软骨的种子细胞的可行性。方法 取成年崇明长枫杂交猪髂骨骨髓5ml，在低糖DMEM完全培养液培养2周，传代后以高糖DMEM无血清特定培养液诱导（含胰岛素2mg/L、转铁蛋白3mg/L、丙酮酸100mg/L、地塞米松10^-7mol/L、TGF－β1 10ng/ml)，在相关显微镜和电镜下进行观察，免疫组化检测Ⅱ型胶原分泌，原位杂交检测Ⅱ型胶原mRNA表达。结果 细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形转变，透视电镜观察见大量扩张粗面内质网、高尔基体、线粒体。诱导培养后第7，14dⅡ型胶原免疫组化阳性，同时原位杂交检测Ⅱ型胶原mRNA表达呈阳性。结论 MSCs在特定培养液诱导下能向软骨细胞表型转化，并能分泌软膏特异性基质，有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源的应用前景。     

丹参酮ⅡA对人股骨头成骨细胞金属蛋白酶表达的影响

目的 通过观察丹参酮ⅡA对人股骨头成骨细胞金属蛋白酶及其抑制因子表达的影响,探讨其在治疗股骨头坏死方面的作用.方法 体外培养人股骨头成骨细胞,加入IL-1β促进成骨细胞表达MMP及TIMP,对照组用qPCR方法检测成骨细胞表达MMP和TIMP的类型及量,各3个样本,单个样本重复检测3次,实验组加入丹参酮ⅡA后亦行相同检测,并行比较.结果 qPCR未见MMP8,MMP12、MMP15及TIMP4扩增;qPCR检测实验组MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、MMP13、MMP14、MMP17、TIMP1及TIMP3表达较对照组有显著差异(P＜0.05),实验组MMP10、MMP11及TIMP2表达较对照组无显著差异(P＞0.05).结论 人股骨头成骨细胞未表达MMP8,MMP12、MMP15及TIMP4;丹参酮ⅡA能有效抑制人股骨头成骨细胞部分MMP分泌,并有效促进部分TIMP分泌,从而达到延缓股骨头坏死的作用.     

丹参酮ⅡA磺酸钠联合激素治疗肾病综合征临床观察

目的观察丹参酮ⅡA磺酸钠联合激素治疗肾病综合征的临床疗效。方法将48例肾病综合征患者随机分为两组,各24例。对照组采用足量强的松及常规治疗。治疗组在足量强的松及常规治疗基础上加用丹参酮ⅡA磺酸钠注射液静脉滴注,两组疗程均为2周。分别观察两组治疗前后尿常规、24h尿蛋白定量、血脂等指标变化。结果治疗后两组患者24h尿蛋白定量较治疗前均明显降低,治疗组总有效率为90.7%,对照组为78.0%（P〈0.05）。治疗组治疗后血脂、肾功能等指标较治疗前均有显著改善,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论丹参酮ⅡA磺酸钠注射液联合激素能显著提高治疗肾病综合征的疗效。     

丹参酮ⅡA对瘢痕成纤维细胞超微结构和自由基代谢平衡影响的实验研究

目的:探究丹参酮ⅡA磺酸钠(STS)对人增生性瘢痕(HS)的成纤维细胞(Fb)超微结构及自由基代谢平衡的影响,从抗氧化途径寻找一种新的治疗HS的有效方法。方法:收集术中7例HS组织进行Fb体外培养,取第3～6代传代细胞进行实验观察,设置实验组和对照组,实验组设置不同浓度组STS(0.05,0.075,0.10,0.125,0.15,0.20mg/ml)干预培养,对照组加入等量不含STS的DMEM培养液。①干预培养48h后应用倒置相差显微镜和透射电镜观察细胞形态及超微结构改变;②分别于培养12h,24h,48h后,应用化学比色法检测细胞内丙二醛(MDA)含量、黄嘌呤氧化酶(XOD)活力、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力变化。结果:①透射电镜见实验组细胞内线粒体肿胀及空泡样变性,粗面内质网扩张、囊泡变及脱颗粒,胶原纤维束减少,细胞坏死等现象;②与对照组比较,实验组MDA含量及XOD活力明显降低(P<0.05或P<0.01),且存在浓度-时间效应。与对照组比较,实验组T-SOD和GSH-Px活力水平有不同程度升高,其升高程度受药物浓度和作用时间影响。与对照组比较,药物作用12h时,高浓度组(0.15mg/ml和0.20mg/ml)T-SOD活力水平升高明显(P<0.05);24h时,0.125～0.20mg/ml组显著升高(P<0.05或P<0.01);48h时,0.05mg/ml～0.10mg/ml组显著升高(P<0.05或P<0.01),0.15mg/ml和0.20mg/ml组显著降低(P<0.01)。与对照组比较,药物作用12h时,0.075～0.15mg/ml组GSH-Px活力水平明显升高(P<0.05或P<0.01),24h和48h时0.05mg/ml和0.075mg/ml组明显升高(P<0.01),48h时0.20mg/ml组GSH-Px活力水平明显降低(P<0.01)。结论:STS可通过降低自由基产生及增强抗氧化酶活性调节瘢痕成纤维细胞自由基代谢平衡和生物学功能。     

丹参酮ⅡA通过下调KLF-4抑制骨肉瘤细胞增殖迁移

目的研究丹参酮ⅡA(TanⅡA)是否可以抑制骨肉瘤细胞株MG-63及其机制。方法用不同浓度的TanⅡA干预骨肉瘤细胞,Western blot检测各组中细胞增殖相关蛋白(p21、PCNA、ki-67)和细胞迁移相关蛋白(COL1A1、COL1A5、MMP-2、MMP-9)及KLF-4的表达情况;MTT法测细胞增殖情况、划痕试验观察细胞迁移情况;转染过表达KLF-4或空白对照质粒至离体培养的骨肉瘤细胞中,再用TanⅡA干预,检测骨肉瘤细胞表型转化情况。结果相比于对照组,TanⅡA组中骨肉瘤细胞增殖能力降低(P0.01),迁移减少(P0.01),p21表达增多(P0.05),PCNA、ki-67、COL1A1、COL1A5、MMP-2、MMP-9、KLF-4表达减少(P0.01)。转染KLF-4过表达质粒后,相比于对照组,转染KLF-4过表达质粒可以增加骨肉瘤细胞的增殖和迁移(P0.05),逆转TanⅡA对骨肉瘤细胞增殖迁移的抑制作用。结论 TanⅡA通过下调KLF-4抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移。     

丹参酮ⅡA磺酸钠联合中药灌肠治疗慢性肾衰竭

目的 观察丹参酮ⅡA磺酸钠注射液联合自拟中药方保留灌肠治疗慢性肾衰竭(CRF)的疗效,以探讨其可能机制.方法 将61例CRF患者,随机分为治疗组31例和对照组30例.在常规治疗的基础上,治疗组采用丹参酮ⅡA磺酸钠注射液联合自拟中药方保留灌肠治疗,而对照组仅采用中药方保留灌肠治疗.连续治疗8周.观察患者治疗前、后血肌酐(...