黄芪、板蓝根对猪细小病毒体外抑制作用研究

为研究中草药黄芪、板蓝根作为抗病毒药物的效果及初步机理，利用细胞病变（CPE）抑制实验测定黄芪、板蓝根单独使用及1：1联合使用在PK-15单层细胞上对猪细小病毒（PPV）的抑制作用。结果表明：板蓝根单独使用时体外对PPV有明显的抑制作用，其对PPV的最小直接杀灭浓度为0．62mg／mL，最小阻断浓度为0．31mg／mL；而黄芪单独使用时对PPV无明显的抑制作用。板蓝根、黄芪1：1联合使用时对PPV的抑制作用显著增强，其对PPV的最小直接杀灭浓度提高为0．31mg／mL，最小阻断浓度提高为0．075mg／mL。     

黄芪、金银花提取物体外抗禽流感病毒的试验研究

选用黄芪、金银花作为抗病毒药物,利用细胞病变(CPE)抑制实验测出黄芪、金银花提取物单独使用及1:1联合使用在鸡胚成纤维细胞(CEF)上培养对禽流感病毒AIV(H9N2亚型)的最小直接杀灭浓度和最小阻断浓度.结果表明:黄芪、金银花提取物对CEF的无毒浓度分别为62.5mg/ml、31.25mg/ml.金银花提取物体外对AIV有抑制作用,其对AIV的直接杀灭浓度为7.81mg/ml;最小阻断浓度为3.90mg/ml;黄芪提取物单独使用对AIV的抑制作用不显著.金银花与黄芪提取物联合使用,其抑制作用增强,对AIV的直接杀灭浓度为0.98mg/ml,最小阻断浓度提高1.95mg/ml.     

3种中药及其提取物体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒作用的研究

为研究板蓝根、黄芪和青蒿及其提取物体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的作用,本试验在研究板蓝根、黄芪和青蒿及其提取物对Marc-145细胞最大安全浓度的基础上,研究3种中药提取物体外抗PRRSV的作用。结果显示,板蓝根多糖、黄芪多糖和青蒿素3种中药提取物对Marc-145细胞安全浓度分别为为0.03、0.03和0.06 mg/mL,板蓝根、黄芪和青蒿3种中药单方的安全浓度分别为6.25、6.25和3.13 mg/mL。在体外抗PRRSV作用的试验中,3种中药单方中黄芪的阻断作用最强,能达到100%的保护率,中药提取物中板蓝根多糖对PRRSV的阻断作用最强,在浓度为0.031 mg/mL时对细胞保护率能达到48.03%,青蒿素最差,在0.16 mg/mL时就已不具有阻断作用。板蓝根多糖对病毒不具有直接杀灭作用,黄芪多糖和青蒿素在浓度为0.32 mg/mL时,保护率都是20%左右;黄芪的直接杀灭作用保护率为100%,且非常稳定,青蒿在浓度较高时还有促进细胞生长的作用,但稳定性差,随浓度降低其保护率迅速下降。在对病毒的抑制作用试验中,3种中药提取物的作用相当,浓度为0.01 mg/mL时,板蓝根多糖、黄芪多糖和青蒿素多糖对细胞的保护率分别为24.57%、24.30%和26.20%;而3种中药单方的细胞保护率都能达到100%甚至以上。综合3种作用方式可知,3种中药提取物中,黄芪多糖的抗PRRSV作用最好,青蒿素次之,板蓝根多糖最差;3种中药单方中黄芪的效果最好,青蒿最差。因此,可知黄芪及其提取物具有非常强的抗PRRSV作用,可对其进行进一步研究,以供临床上使用。     

黄芪、金银花体外对伪狂犬病病毒作用研究

选用黄芪、金银花作为抗病毒药物，利用CPE抑制实验测定出黄芪、金银花单独使用及1：1联合使用在PK15培养上对PRV的最小直接杀灭浓度和最小阻断浓度。结果表明：黄芪、金银花对PK15的无毒浓度分别为62.5mg/ml，15.62mg/ml，金银花体外对PRV有抑作用，其对PRV的直接杀灭浓度为3．90mg/ml；最小阻断浓度为1．95mg/ml。与黄芪联合使用，其抑制作用增强，对PRV的直接杀灭浓度为1．95mg/ml，最小阻断浓度提高0．93mg/ml。黄芪单独使用对PRV的抑制作用不显著，但与金银花合用可使其抑制作用增强。     

板蓝根、黄芪等中药活性提取物对猪繁殖与呼吸综合征病毒体外作用的研究

本试验利用Marc-145细胞体外培养系统，通过观察细胞病变效应（CPE）来评价板蓝根、黄芪等中药活性提取物成分体外抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）对细胞的感染作用，并通过改变加药方式（先加药物后接种病毒、先接种病毒后加药物、病毒和药物感作后同时加入），初步探讨中药活性提取物的抗病毒机制。结果表明。在安全浓度范围内，板蓝根水提物体外对PRRSV具有显著的直接杀灭作用；连翘、黄芪水提物和黄芪多糖体外对PRRSV均具有明显的阻断和抑制作用，为筛选抗PRRSV中药制剂提供了理论依据。     

浒苔多糖体外抗猪传染性胃肠炎病毒研究

为研究浒苔多糖体外抗猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的效果,用水煮醇沉法从浒苔中提取浒苔多糖粗品,细胞维持液倍比稀释后,以猪睾丸细胞(ST)为细胞模型,采用细胞病变效应(CPE)试验,通过直接杀灭、抑制病毒复制和阻断病毒吸附3个方面进行研究。结果表明,浒苔多糖对ST细胞最大安全浓度为1.57mg/mL;浒苔多糖在体外对TGEV作用2h的最小杀灭浓度为0.2mg/mL,作用4h的最小杀灭浓度为0.1mg/mL;浒苔多糖浓度越高对TGEV复制的抑制作用越明显,TGEV感染细胞时间越长,对TGEV复制的抑制作用越低,抑制TGEV复制的最小浓度为1.57mg/mL;浒苔多糖对TGEV吸附ST细胞阻断作用的最小浓度与浒苔多糖作用于ST细胞的时间有关,2h为0.393mg/mL,4h为0.2mg/mL。浒苔多糖在体外对TGEV具有直接杀灭和阻断吸附的作用,为浒苔多糖抗病毒功能提供了理论依据。     

10种中药体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用研究

为了研究穿心连、夏枯草、黄柏、黄芩、板蓝根、黄芪、黄连、连翘、芦根、青蒿共10种中药体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的作用,试验采用MTT法对病毒分别进行阻断、抑制、直接杀灭3种作用方式的测定。结果表明:10种中药体外应用3种作用方式均有不同程度的抗PRRSV作用,其中阻断作用明显的有板蓝根、黄芪、青蒿;除了黄柏、黄芩外,其余8种中药均有明显的抑制病毒作用;直接杀灭病毒作用明显的有青蒿、连翘,而芦根、板蓝根、黄芪、黄芩、穿心莲次之。综合比较3种作用方式,板蓝根、黄芪、青蒿和芦根4种中药具有明显抗PRRSV作用,其次是连翘、穿心莲和夏枯草。     

硫酸化茯苓多糖对PRRSV体外感染Marc-145细胞作用的影响

用稀碱法从茯苓中提取茯苓多糖,应用氯磺酸-吡啶法得到硫酸化茯苓多糖。通过观察细胞病变(CPE)效应来评价不同浓度硫酸化茯苓多糖和不同作用方式对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染Marc-145细胞的影响。结果表明,硫酸酯化茯苓多糖预作用于单层细胞12 h后感染104TCID50PRRSV,能明显阻断病毒感染细胞,其阻断病毒感染作用的最小浓度为100 mg/L;而硫酸化茯苓多糖预作用4 h后感染104TCID50的PRRSV阻断感染作用不明显,显示硫酸化茯苓多糖体外对PRRSV感染细胞的阻断感染作用呈一定的浓度和时间依赖性。感染剂量为104TCID50PRRSV后加入不同浓度硫酸化茯苓多糖,也能有效抑制病毒在细胞上的感染与增殖,其作用最小浓度为50 mg/L;而不同浓度多糖与104TCID50病毒在体外共同孵育12 h后加入到单层细胞,多糖直接杀灭PRRSV的最小浓度为100 mg/L。     

中药体外对Marc-145细胞的影响及抗PRRSV突变株的作用

将板蓝根、甘草和鱼腥草3种单味中药各含量为100mg/mL的中药粗提物作连续倍比稀释后,采用CPE和MTT法将其在Marc-145细胞上进行最大安全质量浓度和对细胞增殖的影响试验,同时采用体外细胞培养的方法在Marc-145细胞上进行抗猪繁殖与呼吸综合征病毒突变株(PRRSV PX株)作用试验。结果显示,3种中药粗提物最大安全作用质量浓度板蓝根和甘草均为3.125g/L、鱼腥草为1.563g/L;板蓝根、甘草、鱼腥草分别在3.125～0.049、3.125～0.195、1.563～0.391g/L时测得细胞D值大于细胞对照组,对细胞分裂增殖均有促进效果,最佳作用质量浓度均为1.563g/L;3种中药粗提物有不同程度的抗PRRSV PX株作用,板蓝根和甘草粗提物阻断、抑制PRRSV PX株感染及直接灭活PRRSV PX株效果最好的质量浓度;阻断为3.125、3.125g/L、抑制为1.563、0.391g/L:阻断、直接灭活为0.782、0.782g/L,鱼腥草粗提物在0.782g/L时阻断和抑制PRRSV PX株效果为好,但其对PRRSV PX株基本没有直接灭活作用。     

人参皂苷Rb1对PRRSV的体外抑制作用及对病毒N蛋白表达的影响

为了在感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的Marc-145细胞模型上,探讨人参皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1, GSR1)抑制PRRSV能力及其作用机制。采用MTT法测定GSR1在Marc-145细胞上的最大安全浓度(Maximum no-cytotoxic concentration, MNTC)和半数毒性浓度(50%Cytotoxic concentration, CC_(50))。建立PRRSV感染Marc-145细胞模型,设计阻断PRRSV复制和直接杀灭PRRSV试验,确定GSR1体外抗PRRSV的作用方式;利用FQ-PCR检测GSR1对病毒N基因的影响,间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)和Western Blot技术测定GSR1对PRRSVN蛋白表达的影响。结果表明,GSR1在直接杀灭PRRSV试验中最高抑制率为54.65%,在阻断PRRSV复制试验中前12 h起抗病毒作用,且最高抑制率达60.01%,推测GSR1主要通过直接使病毒灭活或干扰病毒的早中期复制来发挥其抗病毒作用。此外,在设定12～72 h试验时间内,阳性药物利巴韦林组,4 mg/mL、2 mg/mL GSR1组PRRSV N基因拷贝数显著低于病毒组(P0.05)。在对N蛋白含量影响试验中4 mg/mL GSR1和阳性药物可以减少N蛋白载量。表明GSR1可以通过抑制病毒N蛋白的表达来抑制病毒的复制,并可作为抗PRRSV的候选药物或先导物。     

板黄口服液在靶动物鸡中的安全性研究

本研究按板黄口服液临床推荐剂量的1（1%）、3（3%）、5（5%）、10（10%）倍连续给药21 d,对给药后靶动物鸡的临床血液学、血液生化学、脏器系数和组织病理学方面的数据与对照组进行比较,应用SPSS 17.0软件进行t检验,统计分析组间各指标的差异显著性,为其临床应用的安全性提供数据资料;试验结果显示与对照组相比,各板黄口服液剂量组靶动物鸡的临床血液学、血液生化学、增重和脏器系数等指标差异均不显著（P>0.05）。试验结果表明10倍推荐剂量（10%）板黄口服液对靶动物鸡是安全的。     

3个产地板蓝根多糖作用的比较研究

通过小鼠吞噬试验、脾淋巴细胞增殖试验和最低抑菌与最低杀菌浓度的检测,对不同产地板蓝根多糖功能进行比较研究。结果表明,3个产地板蓝根多糖均使小鼠吞噬能力增强,并协同促进淋巴细胞增殖,具有一定的杀菌和抑菌效果。     

夏枯草等14味中药对金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性

采用索氏提取,超声波和水煎煮方法提取夏枯草等14味中药的有效部位,应用二倍试管稀释法分别测定其提取物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）。结果显示,夏枯草、虎杖、何首乌、连翘、柴胡、穿心莲、地榆7味中药有效部位对金黄色葡萄球菌的抗菌活性最强,其MIC为1．953～3lI250g／L,MBC为3．90～31．25g／L;佛手、黄柏2味中药有效部位具有较强的体外抗菌活性,其MIC值为62．5g／L,MBC值为125．0g／L;大青叶、板蓝根、金银花、杜仲、白头翁5味中药有效部位的抗菌活性较差,其MIC值为125．0g／L,MBC值为250．0,≥250．0g／L。不同中药有效部位对金黄色葡萄球菌的抗菌活性有所差异,其中夏枯草、虎杖、何首乌、地榆和佛手有效部位对金黄色葡萄球菌具有较好的抗菌活性。     

中草药提取物对蜜蜂屎肠球菌(Enterococcus faecium)的抑制作用研究

为了观察中草药对蜜蜂屎肠球菌（Entorococcus faecium）的体外抑菌效果，选用14种中草药按常规法制备水提物，用纸片法和试管二倍稀释法检测中草药水提物对蜜蜂屎肠球菌的抑菌作用。试验结果表明，所选14种中草药中9种对蜜蜂屎肠球菌有中度以上抑菌作用，其中大青叶的抑菌作用最强，其次是黄连、金银花、黄芪、黄芩、大黄、板篮根、淫羊藿和青蒿。     

复方板蓝根提取工艺与靛玉红含量测定

通过正交试验优选出复方板蓝根最佳的提取工艺,并建立反相高效液相色谱法（Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography,RP-HPLC）测定该复方的靛玉红含量。含量测定采用外标法。结果表明不同工艺的提取方法中,加10倍水,煎煮1次,煎煮时间为2h的提取工艺,含量最高,达6.86μg/mL;HPLC法测定靛玉红,其线性范围在2.0～20.0μg/mL内靛玉红的含量与峰面积相应值呈良好的线性关系（r=0.972）,平均加样回收率为96.54%（n=6）,说明HPLC方法简便、准确、重复性好,可作为该产品质量控制方法。     

抗猪繁殖与呼吸综合征病毒转基因细胞系的建立

采用脂质体法将具有抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的shRNA质粒pEGFP-N1-shRNA导入PK-15细胞中,经G418药物筛选后,分离扩增绿色荧光蛋白阳性细胞,获得抗PRRSV转基因PK细胞系。通过对转染方法和条件的优化,确立最佳的转染及筛选步骤;对得到的阳性转基因细胞进行冷冻-解冻,并作PCR检测。结果表明,G418最佳筛选浓度为600μg/mL,脂质体与质粒的最佳转染比例为7∶2,最佳转染时间为24 h。本研究成功建立抗PRRSV转基因细胞系,为进一步的功能验证及体细胞核移植奠定了基础。     

Antiviral Effects of Three Chinese Herbal Medicine and Their Polysaccharides on Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) in vitro

In order to figure out the antiviral effects of Radix Isatidis,Astragalus herb,Artemisia annua and their polysaccharides on porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in vitro,the antiviral activity of the three Chinese herbal medicine and their polysaccharides,Isatis root polysaccharide (IRPS),Astragalus polysaccharides (APS) and artemisinin maximum were evaluated by adding to Marc-145 cell cultured with PRRSV respectively.The results showed that the safety concentrations of IRPS,APS and artemisinin to Marc-145 cells were 0.03,0.03 and 0.06 mg/mL;The safety concentrations of Radix Isatidis,Astragalus herb,Artemisia annua to Marc-145 cells were 6.25,6.25 and 3.13 mg/mL.Almost all the cells (about 100%) were protected from PRRSV when Astragalus herb were added early to PRRSV,while IRPS had the same effect on PRRSV among three extracts with 48.03% cells were protect and artemisinin could not protect cells when the concentration was lower than 0.16 mg/mL.IRPS had no effect on PRRSV while APS and artemisinin got a protection rate for cells at about 20% when simultaneously added with PRRSV,under the concentration of 0.32 mg/mL.In terms of simultaneously added with PRRSV,Chinese herb Astragalus could exterminate the virus directly with its protect cells coming to 100% and more.Artemisia annua could promote the growth of cells but its stability was weak.Its protection rate decreased as its concentration reducing.In the experiment of exploring the antivirus effect of infected cells,polysaccharides of these three herbs had nearly the same effect.When in a concentration of 0.01 mg/mL,IRPS,APS and artemisinin respectively protected 24.57%,24.30% and 26.20% cells.However,the protection rate to cells of the three herbs themselves was respectively up to 100% or more.In conclusion,in the extracts of the three herbs,APS had the best antiviral effect,followed by artemisinin and IRPS,and in the single herbal medicines,Astragalus was the best and Artemisia annua was worst.Therefore,Astragalus and APS had the best antiviral effect on PRRSV.It needed more research on Astragalus and APS,and try to use them as antiviral drug in clinical application.