EB病毒中早期表达的癌基因—BARF1

BARF1是近期发现EB病毒编码的早期癌基因。对其认识还处于起步阶段，本文从BARF1的基因结构、体外对细胞的转化、肿瘤细胞中的表达及可能的作用机制方面的研究做一介绍。     

去甲斑蝥素通过caspase，MAPK和线粒体途径诱导HeLa细胞凋亡

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柯萨奇病毒B3通过caspase依赖途径诱导HeLa细胞凋亡

目的 评价柯萨奇病毒B3（CVB3）致HeLa细胞死亡的方式及分子机制。方法 用CVB3作用于HeLa细胞,在不同时间收集细胞,通过相差显微镜、电子显微镜、流式细胞仪以及分子生物学手段,HeLa细胞的病变及caspase-3基因mRNA和蛋白质的表达。结果 CVB3作用于HeLa细胞后,细胞很快发生变性和坏死,24h后较多细胞凋亡;caspase基因在病毒作用早期即被活化,表现在caspase-3 mRNA在病毒作用后6h内,迅速增高达峰值。在24h内,又降至接近病毒作用前的水平。caspase-3蛋白表达在42h内逐渐增高。结论CVB3可诱导HeLa细胞发生坏死和凋亡两种反应,坏死早于凋亡,细胞凋亡与caspase-3的表达密切相关。     

没食子酸通过活化线粒体通路诱导CNE-2鼻咽癌移植瘤细胞的凋亡

目的:观察不同浓度的没食子酸(gallic acid,GA)对鼻咽癌移植荷瘤裸鼠的影响,并探讨其可能的作用机制.方法:建立人鼻咽癌CNE-2细胞株荷瘤裸鼠移植性肿瘤模型,随机分为6组:正常对照组(control,con组),模型组(nasopharynx cancer,NPC组),没食子酸10,20,40 μg/kg组(GA-10μg/kg,GA-20 μg/kg,GA-40 μg/kg)和阳性对照组(顺铂,DDP组);经相应处理后,处死裸鼠,测量瘤体积,称量瘤体重量并计算抑瘤率;流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡率;Western印迹检测肿瘤细胞中cytochrome C(Cyt C)、cleaved-cas 9,cleaved-cas 3与cleaved-PARP的蛋白表达水平.结果:与NPC组相比,给予GA后瘤体体积与重量随其浓度升高而减小,抑瘤率与肿瘤细胞凋亡率增大;与NPC组相比,肿瘤细胞线粒体中Cyt C的蛋白表达随GA浓度增加而减少,胞质中Cyt C的蛋白表达则相反,细胞中cleaved-cas 9,cleaved-cas 3与cleaved-PARP的蛋白水平显著增加,与GA浓度呈正相关.结论:没食子酸可能通过调控线粒体通路诱导鼻咽癌移植瘤细胞的凋亡.     

沉默Apaf-1 基因对氧糖剥夺/ 复氧复糖PC12 细胞线粒体凋亡通路的影响

目的:探讨RNA干扰沉默Apaf-1基因对氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞线粒体凋亡通路的影响。方法:PC12细胞随机分为3组:正常组(Control)、模型组(Model)、Apaf-1基因沉默组(Apaf-1-siRNA)。正常组于CO2培养箱内正常培养,其余2组给予氧糖剥夺2 h、复氧复糖24 h处理,Apaf-1-siRNA组于造模前将化学合成的siRNA通过脂质体转染于PC12细胞靶向沉默Apaf-1基因。用荧光标记的siRNA检测Apaf-1转染效率,Western blot检测转染后PC12细胞Apaf-1蛋白表达,CCK-8检测细胞存活率,TUNEL染色检测细胞凋亡指数,流式细胞术检测细胞凋亡率,免疫荧光染色检测Bax/Bcl-2比值,Western blot检测线粒体凋亡通路关键蛋白Apaf-1、caspase-9、caspase-3表达。结果:Apaf-1-siRNA可有效沉默PC12细胞Apaf-1蛋白表达(P<0.05)。与Control组相比,Model组细胞存活率明显降低(P<0.05),细胞凋亡指数和凋亡率显著升高(P<0.05),Bax/Bcl-2比值升高(P<0.05),线粒体凋亡通路关键蛋白Apaf-1、caspase-9、caspase-3表达显著升高(P<0.05);与Model组相比,Apaf-1-siRNA组细胞存活率显著升高(P<0.05),细胞凋亡指数和凋亡率显著降低(P<0.05),Bax/Bcl-2比值降低(P<0.05),Apaf-1、caspase-9、caspase-3蛋白表达均明显降低(P<0.05)。结论:靶向沉默Apaf-1基因可有效降低氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞线粒体凋亡通路关键蛋白Apaf-1、caspase-9、caspase-3表达,抑制细胞凋亡,提高细胞存活率。     

LMP1与细胞凋亡

LMP1为EBV编码的病毒瘤蛋白,具有促进细胞增殖、调控细胞凋亡等多种生物学效应。LMP1有可能成为EBV相关肿瘤治疗的分子靶标。     

幽门螺杆菌VacA N端片段通过线粒体途径诱导GES-1细胞凋亡

目的:本研究初步探讨幽门螺杆菌(H.pylori)空泡毒素单一毒力决定簇对GES-1胃黏膜上皮细胞凋亡的影响,为进一步研究H.pylori的致病机制奠定基础。方法:将本课题组已构建的pDsRed-Monomer-C1/VacA N端真核表达载体转染至GES-1细胞中,Western blot鉴定VacA蛋白在细胞中的表达;电子显微镜和中性红摄取试验检测GES-1细胞的空泡样变;Hoechst33342染色、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒以及电镜观察细胞凋亡情况,同时采用分光光度法检测细胞Caspase-9、Caspase-3的活化程度,Rho123检测细胞跨膜电位的变化,ELISA法检测细胞色素C的释放。结果:重组质粒pDsRed-Monomer-C1/VacA转染GES-1细胞24小时后,电镜下可明显观察到空泡样变及核固缩、染色质边聚等凋亡特征,重组质粒组部分细胞发生空泡样变;Hoechst 33342染色后镜下可见明显的核染色质浓缩,Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒检测发现重组质粒组细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05);Caspase-9和Caspase-3活化程度呈时间依赖性增加,分别在12小时和24小时达到峰值;Rho123染色发现线粒体跨膜电位明显降低;重组质粒转染组释放细胞色素C的浓度呈时间依赖性正相关,与空质粒组及对照组相比差异显著(P<0.05)。结论:VacA N端片段可诱导GES-1细胞凋亡及空泡样变,VacA蛋白可激活Caspase-9和Caspase-3,且可能主要通过线粒体途径诱导GES-1细胞凋亡。     

TRAIL诱导Hela细胞凋亡的线粒体信号通路

 目的 探讨 TRAIL 诱导人宫颈癌 Hela 细胞凋亡的线粒体通路。 方法 琼脂糖凝胶电泳判断细胞凋亡;激光共聚焦、Western blot、荧光免疫和 caspase-3 活性检测测定细胞线粒体膜电位 (∆Ψm) 、Bcl-2 蛋白、细胞色素 c (Cyt c) 和凋亡诱导因子 (AIF) 蛋白在细胞中的定位以及 caspase-3 活性。结果 TRAIL 能诱导 Hela 细胞凋亡,有凋亡细胞特有的 DNA 梯状条带。同时,TRAIL具有时间依赖性致 ∆Ψm 和 Bcl-2 蛋白含量明显下降,线粒体 Cyt c 蛋白释放,AIF 蛋白向细胞质、细胞核转移,caspase-3 活性增强。结论 TRAIL 诱导 Hela 细胞凋亡途径之一是通过线粒体信号通路进行的。     

EB病毒BHRF1基因的克隆及其表达产物抑制细胞凋亡的研究

目的ＥＢ病毒ＢＨＲＦ１基因克隆，其表达产物抑制ＣＨＯ细胞凋亡功能的研究。方法以Ｂ９５－８细胞株ＥＢＶＤＮＡ为模板设计一对引物，采用ＰＣＲ技术扩增ＢＨＲＦ１基因，用目的基因内的两个单酶切点ＢａｍＨⅠ、ＢｇｌⅠ进行酶切鉴定。用引物上所引入的两个酶切位点ＮｃｏⅠ、ＳｃｌⅠ酶切目的基因后定向连接到ｐＢＶ２２１载体上，转入宿主菌ＤＨ５α经质粒抽提，单、双酶切鉴定，从所获克隆中筛选重组质粒克隆。温控诱导目的基因表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及凝胶薄层扫描分析。采用缺血清培养方法建立ＣＨＯ细胞凋亡模型。结果所得扩增产物长５９２ｂｐ与预期大小一致；筛选出的９个重组质粒克隆经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和扫描表明重组蛋白表达量占菌体蛋白总量的２．５％。将含重组蛋白的菌体蛋白加入缺血清培养体系，通过与空白菌体蛋白对照表明，重组蛋白具有明显的抑制ＣＨＯ细胞凋亡的能力。结论ＢＨＲＦ１蛋白具有有效控制血清缺乏所诱导的ＣＨＯ细胞凋亡功能，这为ＢＨＲＦ１蛋白的广泛应用提供了依据。     

独蒜兰乙酸乙酯萃取物通过内源性线粒体通路诱导白血病K562细胞和HL-60细胞凋亡

目的:探讨独蒜兰乙酸乙酯萃取物对人慢性粒细胞白血病K562细胞和急性髓性白血病HL-60细胞增殖及凋亡的影响以及诱导凋亡的途径。方法:采用XTT法、台盼蓝拒染法、Annexin V-FITC/PI双染法、PI染色法、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色和Western blot法研究不同浓度独蒜兰乙酸乙酯萃取物对上述2种白血病细胞增殖、凋亡、细胞周期和凋亡相关蛋白表达等方面的影响。结果:独蒜兰正丁醇萃取物对K562细胞活力几乎没有抑制作用,而乙酸乙酯萃取物能显著抑制K562和HL-60细胞的活力和增殖。乙酸乙酯萃取物对于HL-60细胞作用24 h的半数抑制浓度(IC_(50))为(42.14±2.54)mg/L,对于K562细胞的IC_(50)为(51.28±3.12)mg/L。Annexin V-FITC/PI和DAPI染色结果显示,乙酸乙酯萃取物呈剂量依赖性诱导2种细胞凋亡,且50 mg/L的乙酸乙酯萃取物作用后K562细胞的凋亡率为33.1%,而HL-60细胞的凋亡率为63.1%,说明HL-60细胞对乙酸乙酯萃取物更加敏感,伴有典型的细胞核凋亡形态学改变。PI染色结果显示HL-60细胞和K562细胞都被阻滞于G_2期。Western blot结果显示,随着药物浓度的升高,细胞凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达降低,而促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3和活化的多腺苷二磷酸核糖聚合酶的表达逐渐升高,内源性线粒体凋亡的特征胞浆中细胞色素C和凋亡诱导因子表达也逐渐升高。结论:独蒜兰乙酸乙酯萃取物能显著抑制K562和HL-60细胞增殖,并通过触发内源性线粒体凋亡通路诱导这2种细胞凋亡。     

DEK表达下调通过抑制胃癌SGC-7901细胞中NF-κB信号途径诱导细胞凋亡

目的:研究DEK表达下调对胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响,并分析其与NF-κB信号途径及凋亡相关蛋白表达的关系。方法:将DEK siRNA和对照siRNA转染胃癌SGC-7901细胞,并将SGC-7901细胞分为未处理组、对照siRNA组及DEK siRNA组。采用实时荧光定量PCR和Western blot检测3组胃癌SGC-7901细胞中DEK mRNA和蛋白的表达;流式细胞术检测3组SGC-7901细胞凋亡的变化;Caspase-Glo-3/9试剂盒检测3组SGC-7901细胞中caspase-3和caspase-9的活性;Western blot技术检测3组SGC-7901细胞中NF-κB信号途径关键调控蛋白p65及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达。结果:与未处理组和对照siRNA组相比,DEK siRNA组SGC-7901细胞中DEK的mRNA和蛋白表达水平显著下调(P0.05)。DEK siRNA组SGC-7901细胞的早期凋亡率和总凋亡率均显著高于未处理组和对照siRNA组(P0.05)。最为显著的是,DEK siRNA转染细胞后,p65和Bcl-2蛋白表达下调,Bax蛋白表达上调,并伴随caspase-3和caspase-9活性上升。结论:DEK表达下调介导的SGC-7901细胞凋亡可能与NF-κB信号途径密切相关。     

EB病毒对人胃癌细胞系HSC-39感染的研究

目的 探讨EB病毒（EBV）对胃癌细胞系的感染作用。方法 用Akata和P3HR－1 EBV毒株感染人胃癌印戒细胞系（HSC－39），有限稀释法对感染细胞进行克隆。结果 EBV感染细胞中可检测到EBV编码的核抗原（EBNA)，2种EBV毒株感染的细胞克隆表现有不同的形态学特征及生长方式。EBV感染的亲代细胞及大部分克隆表达EBNA1，但不表达EBNA2、潜伏期膜蛋白（LMP）1和LMP2A；亲代细胞及所有细胞克隆未观察到裂解感染，EBNA启动子Qp表达阳性，而启动子Cp和Wp未见表达。结论 HSC－39对2种EBV毒株均易感，EBV感染可改变HSC－39的细胞表型，且不同EBV毒株对其影响不同，提示印戒细胞癌细胞系可用作EBV感染的靶细胞。     

干扰HDAC1通过调控STAT3信号通路影响皮肤鳞癌细胞凋亡

目的:探讨干扰组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)对皮肤鳞癌细胞凋亡的影响。方法:皮肤鳞癌细胞A431分别转染HDAC1小干扰RNA(HDAC1 si RNA)和小干扰RNA阴性对照(si RNA NC),RT-PCR和Western blot检测转染后细胞中HDAC1的表达水平,MTT检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测信号转导及转录激活因子3(STAT3)、磷酸化STAT3(p-STAT3)和cleaved caspase-3的蛋白水平。同时用STAT3信号通路抑制剂作用于转染HDAC1 si RNA的A431细胞,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测STAT3、p-STAT3和cleaved caspase-3的蛋白水平。结果:HDAC1 si RNA能够抑制A431细胞中HDAC1的m RNA和蛋白表达。干扰HDAC1表达后细胞活力和细胞中p-STAT3水平下降,而细胞凋亡率和细胞中cleaved caspase-3水平升高。STAT3信号通路抑制剂作用后,转染HDAC1 si RNA的A431细胞活力及p-STAT3水平下降,细胞凋亡率及细胞中cleaved caspase-3水平升高。结论:干扰HDAC1表达可能通过调控STAT3信号通路抑制皮肤鳞癌细胞活力,促进皮肤鳞癌细胞凋亡。     

雷公藤红素通过ROS/JNK途径诱导Saos-2细胞发生caspase依赖的凋亡

目的:探讨雷公藤红素对人骨肉瘤细胞Saos-2的杀伤作用及相关机制。方法:将人骨肉瘤细胞Saos-2用各种不同的浓度的雷公藤红素治疗后,采用MTT法检测雷公藤红素对Saos-2细胞活力的抑制作用;采用流式细胞术检测用雷公藤红素处理后Saos-2细胞的凋亡及活性氧簇(ROS)的产生;Western blot检测雷公藤红素处理后Saos-2细胞cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和磷酸化JNK的表达水平。结果:雷公藤红素有显著的体外抗骨肉瘤作用,能显著抑制Saos-2细胞的活力。雷公藤红素可显著诱导Saos-2细胞发生凋亡,产生ROS。雷公藤红素处理后Saos-2细胞cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和磷酸化JNK的表达水平均显著上升。结论:雷公藤红素通过ROS/JNK途径诱导人骨肉瘤Saos-2细胞发生caspase依赖的凋亡。     

槲皮素诱导MCF-7细胞凋亡及其与Fas/FasL通路的相关性研究

目的:了解槲皮素诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的作用及其与Fas/Fas L通路的相关性。方法:建立槲皮素诱导的MCF-7细胞凋亡模型。采用透射电镜观察细胞核形态变化,Annexin V-FITC/PI和JC-1荧光标记流式细胞术检测细胞凋亡率、线粒体膜电位(Δψm)及Fas L中和抗体对细胞凋亡的阻断作用。采用免疫荧光法和流式细胞术检测细胞Fas/Fas L的表达。流式细胞术观察p38 MAPK抑制剂SB203580对细胞Fas/Fas L表达的影响。Western blot检测p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白水平的变化。结果:80.0μmol/L槲皮素处理MCF-7细胞48h,透射电镜可见染色质浓缩及边缘化现象;处理24 h、48 h和72 h,Δψm分别下降17.4%、44.3%和68.9%,细胞凋亡率分别为(10.2±3.3)%、(28.9±7.5)%和(39.2±8.9)%。Fas L中和抗体预处理细胞后,24 h、48 h和72 h的细胞凋亡率则分别为(8.2±2.8)%、(19.2±5.3)%和(22.5±6.9)%,细胞凋亡阻断率分别为19.6%、33.6%和42.6%。Fas/Fas L表达率随处理时间增加而升高,SB203580可显著抑制细胞Fas/Fas L的表达率。p38 MAPK的蛋白水平变化不大,而p-p38 MAPK的蛋白水平在48 h和72 h显著增高。结论:槲皮素可上调MCF-7细胞的Fas/Fas L表达,并经膜Fas/Fas L途径诱导MCF-7细胞凋亡,p-p38 MAPK可能是上调Fas/Fas L表达的重要信号分子。