迁移侵袭抑制蛋白MIIP的GST融合蛋白表达及生物学活性鉴定

目的构建人MIIP蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达及生物学活性鉴定。方法 RT-PCR扩增得到人MIIP基因全长编码序列,采用重组DNA技术将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建获得重组原核表达载体pGEX-4T-1-MIIP,经酶切鉴定及测序验证完全正确后,将其转化至大肠杆菌BL21细胞中,用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经纯化获得目的蛋白,用Western blot鉴定所得融合蛋白。结果构建了pGEX-4T-1-MIIP原核表达载体,在大肠杆菌中表达获得了GST-MIIP融合蛋白,经Glutathione Agarose纯化和Western blot检测,证实所得GST-MIIP融合蛋白具有生物学活性。结论成功获得了有生物学活性的GST-MIIP融合蛋白。     

多功能转录因子CTCF重组质粒构建及其表达鉴定

目的 构建人CTCF cDNA全长及N端、Zn指、C端3个片段的原核融合表达载体,纯化融合蛋白并进行鉴定.方法 以编码CTCF全长序列的质粒为PCR模板,分别构建GST融合表达重组质粒pGEX-4T-2-CTCF,pGEX-4T-2-CTCF-N,pGEX-4T-2-CTCF-Zn,pGEX-4T-2-CTCF-C,转化大肠杆菌BL21,酶切、测序鉴定;优化IPTG诱导表达条件,并对亲和层析纯化的GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF进行Far-West-ern blot鉴定.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实构建成功.GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C均在大肠杆菌中成功诱导表达,融合蛋白经亲和层析纯化获得纯化蛋白.各纯化蛋白经SDS-PAGE和Far-Western blot鉴定,均为诱导表达蛋白质.结论 成功构建了GST融合表达CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C的重组质粒,对融合蛋白表达条件进行了优化.获得了高效表达的GST融合蛋白.     

迁移侵袭抑制蛋白 MIIP 基因 K167E 位点突变体的构建和表达

目的构建人迁移侵袭抑制蛋白（MIIP）蛋白K167E突变体的原核表达载体pGEX-4T-1-MIIP（K167E）并进行表达和纯化,为MIIP的后续功能研究提供有效工具。方法以pGEX-4T-1-MIIP重组质粒为模板,PCR扩增得到人MIIP基因（K167E）突变体的eDNA全长,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建获得pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体,经酶切鉴定及测序验证完全正确后,将其转化至大肠杆菌B121细胞中诱导表达,纯化获得GST—MIIP（K167E）融合蛋白。结果酶切鉴定和测序结果显示,pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体表达载体构建成功。经诱导表达及纯化后,成功获得的GST—MIIP（K167E）融合蛋白。结论成功构建了pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体表达载体,并获得了GST—MIIP（K167E）融合蛋白。     

GST-CTCF融合蛋白原核表达载体的构建及表达

目的构建人CCCTC结合因子(CCCTC-binding factor,CTCF)与谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase,GST)重组蛋白的原核表达载体,并进行诱导表达。方法以pEASY-T1-SIMPLE-CTCF为模板,设计引入限制性酶切位点的CTCF引物,PCR方法扩增目的片段,产物经限制性内切酶酶切后与原核表达载体pGEX-4T-1连接,构建成pGEX-4T-1-CTCF原核表达载体,转化至大肠埃希菌BL21中,经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)进行诱导,Western blot检测GST-CTCF融合蛋白的表达情况。结果经菌液PCR、质粒双酶切分析、基因测序分析证实重组表达质粒pGEX-4T-1-CTCF构建成功,GST-CTCF融合蛋白产物经Western blot鉴定为特异性表达。结论成功构建了pGEX-4T-1-CTCF原核表达质粒,获得特异性的GST-CTCF融合蛋白,为进一步研究转录因子CTCF的功能奠定了基础。更多还原     

H9N2亚型禽流感病毒ns1基因克隆

目的克隆A／Duck／Shantou／2088／01（H9N2）亚型禽流感病毒ns1基因，构建重组融合表达载体。方法采用常规PCR方法扩增ns1基因cDNA，将扩增产物克隆入GST融合表达载体pGEX-4T-3中，构建重组质粒pGEX-4T-3／ns1，转化BL21（DE3）宿主菌；采用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切和序列分析鉴定插入的ns1，基因；并用IPTG诱导工程菌，SDS—PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达。结果双酶切鉴定表明，ns1基因已正确克隆到GST融合表达载体中，测序结果证实ns1基因序列与目的基因序列完全一致。SDS—PAGE电泳显示，融合蛋白在BL21（DE3）工程菌中以可溶形式表达，重组融合蛋白GST—NS1的表达量占菌体总蛋白的20％左右。经Western blotting分析证实，重组融合蛋白可以被GST特异性抗体所识别。结论本实验成功克隆了H9N2亚型禽流感病毒ns1基因，构建了融合表达载体，并进行了融合蛋白的诱导表达，为进一步研究NS1蛋白在流感流行中的作用打下基础。     

pGEX-5X-1-hLMO4原核质粒构建及重组蛋白表达

目的:构建hLMO4的原核表达载体并诱导、纯化和鉴定其表达。方法:hLMO4全长编码基因经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)在BL21大肠杆菌中诱导GST-hLMO4融合蛋白表达,利用Glutathione Sepharose 4B纯化诱导的融合蛋白,并经Western blot鉴定结果。结果:hLMO4编码序列克隆至pGEX-5X-1载体中,双酶切鉴定片段大小为500 bp,在E.coli BL21中IPTG诱导融合蛋白的表达,分子质量约为49 000 Da,成功纯化出GST及GST-hLMO4蛋白,Western blot检测到蛋白表达。结论:构建了hLMO4基因原核表达载体,鉴定了GST-hLMO4融合蛋白表达。     

表皮生长因子受体胞外区的原核表达和鉴定

目的 克隆表皮生长因子受体(EGFR)胞外区段基因序列(EGFR ECD),构建重组融合表达载体.方法 采用常规PCR方法 扩增EGFR的胞外区DNA序列,并将扩增产物克隆入GST融合表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-4T-1/EGFRECD,转化BL21(DE3)宿主菌;采用Sal Ⅰ和Not Ⅰ双酶切和序列分析鉴定插入序列的正确性:并用IPTG诱导工程菌,SDS-PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达.结果 双酶切鉴定表明,EGFR胞外区序列已经正确克隆到GST融合表达载体中,测序结果证实插入DNA序列与EGFR胞外区序列完全一致.SDS-PAGE电泳显示,融合蛋白在BL21(DE3)中以包涵体形式表达,重组融合蛋白GST-EGFRECD的表达量占菌体总蛋白的12%左右.经Western blotting分析证实,重组融合蛋白可以被EGFR特异性抗体所识别.结论 本试验成功克隆了EGFR胞外区DNA序列,构建了融合表达载体,并进行了融合蛋白的诱导表达和鉴定,可进一步用于EGFR功能及免疫学研究.     

小鼠PRL-3原核表达载体的构建

目的:构建小鼠PRL-3基因的原核表达载体,并在感受态细菌BL21中表达。方法:提取小鼠黑色素瘤B16F10细胞的总RNA,经RT-PCR扩增小鼠PRL-3基因,并将其克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中,阳性克隆经限制性内切酶BamHI、EcoRI酶解及测序鉴定后,转化感受态细菌BL21,经IPTG诱导表达GST-mPRL-3融合蛋白。结果:获得全长为522bp的小鼠PRL-3基因片段,构建重组质粒pGEX-4T-1-mPRL-3,转化感受态细菌BL21后,经IPTG诱导,表达出分子质量约为46KD的GST-mPRL-3蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以可溶性形式存在于E.coli BL21的胞质中。结论:成功地构建了原核表达载体pGEX-4T-1-mPRL-3,为抗体的制备筛选和肿瘤的相关研究奠定了实验基础。     

GST/RIPX融合蛋白表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

目的 构建GST/RIPX融合蛋白基因表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达.方法 以质粒pcDNA3.1.RIPX为模板,通过BamH1和Xho1酶切位点将RIPX定向插入pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-RIPX,并转化E.coil DH5а,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入化E.eoli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达.鉴定.结果 酶切及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-4T-2-RIPX,并用SDS-PAGE方法证实了GST/RIPX融合蛋白的表达.结论 成功构建了RIPX原核表达载体,并证实了融合蛋白的表达,为进一步纯化RIPX蛋白和研究RIPX的生物学功能奠定了基础.     

人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体胞外区的克隆表达和鉴定

目的 构建含表皮生长因子(EGF)受体Ⅲ型突变体胞外区基因(vⅢECD)的重组质粒并进行表达和鉴定.方法 应用PCR方法扩增EGFRvⅢECD片段,将其T-A克隆和测序.再将目的基因插入GST融合表达载体pGEX-4T-1中进行表达.采用双酶切鉴定插入序列的正确性,用SDS-PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达.结果 测序结果证实插入DNA序列与EGFR胞外区序列完全一致;双酶切鉴定表明,EGFRvⅢ ECD序列已经正确克隆到GST融合表达载体中.SDS-PAGE电泳显示融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达.重组融合蛋白GST-vⅢ ECD的表达量占菌体总蛋白的15%以上.Western blotting分析证实重组融合蛋白可以被EGFR特异性抗体所识别.结论 成功构建了融合表达载体(pGEX-4T-1/vⅢECD),并进行了融合蛋白的诱导表达和鉴定,可进一步用于EGFRvⅢ功能及免疫学研究.     

人胰高血糖素样肽-1 cDNA的克隆与表达

目的：克隆人胰高血糖素样肽-1（hGLP-1)cDNA,构建原核表达质粒pGEX-4T-3/hGLP-1cDNA,并诱导表达谷胱甘肽疏基转移酶-hGLP-1(GST-hGLP-1)融合蛋白。方法：采用亚磷酸二酯法合成6个hGLP-1cDNA的寡核苷酸片段,拼接成完整的hGLP-1cDNA,克隆至pBSSK( /-)载体中,经双酶切鉴定和测序后把hGLP-1cDNA定向插入融合基因表达体pGEX-4T-3的多克隆位点上,构建重组质粒pGEX-4T-3/hGLP-1cDNA,并转化大肠杆菌TG1。结果：经限制性内切酶合蛋白GST-hGLP-1,为进一步获得大量可供实验研究和临床应用的重组hGLP-1创造条件。     

NNMT基因重组表达质粒的构建以及在大肠杆菌中的表达

目的利用p GEX—4T-2表达系统表达制备尼克酰胺N-甲基转移酶（NNMT）抗原。方法根据NCBI核苷酸数据库编码为gi：12652950人NNMT cDNA序列，设计合成编码NNMT的DNA引物，并分别在5’端和3’端设计BamHI和XhoI位点，利用RT-PCR从人肝组织中克隆NNMT基因，经T—A克隆、亚克隆至p GEx-4T-2表达载体，重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR（DE3），经异丙基-β—D-硫代乳糖苷诱导表达，Glutathione Sepharose 4B亲和层析制备融合蛋白（GST-NNMT）。通过DNA测序来证实质粒p GEX-4T-2／NNMT的正确性，SDS—PAGE电泳以及Western—blot判断GST-NNMT蛋白的准确性。结果限制性内切酶和DNA测序结果表明，编码NNMT蛋白的DNA序列准确插入到 p GEX-4T-2多克隆位点，成功构建表达质粒p GEX-4T-2，NNMT。菌液超声破碎后，融合蛋白主要存在于裂解上清液中，表达量约占菌体总蛋白表达量的20％，每升菌液可表达融合蛋白约4．5mg。Western-blot证实制备的蛋白为GST-NNMT。结论成功地利用基因重组技术制备了NNMT，为制备抗NNMT单克隆抗体和ELISA试剂盒打下基础。     

家蝇幼虫Defensin成熟蛋白序列的克隆及在原核中的表达

目的 克隆家蝇幼虫defensin成熟蛋白编码序列并在大肠杆菌中表达，为进一步的研究该基因的功能奠定基础。方法 以家蝇幼虫cDNA文库为模板扩增出defensin基因的成熟蛋白全长编码序列，构建重组原核表达载体pGEX／MDEF，转化的克隆(质粒)通过筛选并测序鉴定。重组的pGEX／MDEF在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，SDS-PAGE鉴定其表达情况和分子质量并用抗鼠GST单抗作western blot杂交进一步鉴定融合蛋白的表达。结果 以家蝇幼虫cDNA文库扩增出一条长约为140bp的cDNA片段，经测序证实其为defensin基因成熟蛋白的编码序列，它编码含40个氨基酸的蛋白质，预测其分子质量单位为4kD。被成功克隆入pGEX-4T-1载体的家蝇幼虫defensin基因的cDNA，在重组大肠杆菌BL21(DE3)中诱导可大量生成相对分子质量30KD融合蛋白。结论 成功构建了家蝇幼虫defensin基因原核表达载体，且其成熟蛋白的编码序列在大肠杆菌高效表达。为下一步表达蛋白纯化，以及研究其生物活性提供了材料。     

抗凋亡蛋白Fortilin基因的克隆、表达与鉴定

目的在大肠杆菌中表达一种新近发现的抗凋亡蛋白Fortilin。方法用RT-PCR方法,从肺腺癌细胞中扩增出编码Fortilin蛋白的基因(GenBank中编码该蛋白的基因名为TPT1),克隆入pGEX-4T-1表达载体;重组质粒转入E.coliBL21(DE3),诱导表达Fortilin蛋白,并对表达产物进行免疫印迹鉴定。结果经双酶切及核酸序列分析鉴定,重组质粒pGEX-4T-1/TPT1成功构建,诱导后能高效表达可溶性Fortilin融合蛋白,SDS-PAGE及Western-blot验证该蛋白,表达的融合蛋白分子量为45000,与预期理论值相符。结论Fortilin蛋白在大肠杆菌中以融合蛋白形式进行表达,可提高其在宿主细胞中的稳定性和可溶性,且在大肠杆菌中获得高效表达,获得了充足的活性蛋白,这为进一步了解该蛋白的生物学功能,研究其抗凋亡机制奠定了基础。     

类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建pGEX-4T- 1/SUMO3重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达和纯化出类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白.方法:采用PCR技术利用pcDNA3.1-SUMO3质粒为模板,扩增出SUMO3全长编码序列(312 bp),并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1中,酶切、测...     

TTV病毒ORF1抗原的基因克隆及原核表达

目的 扩增和克隆TTV-ORF1 DNA,构建原核表达载体并在大肠杆菌表达.方法 从TTV病毒感染者外周血中提取DNA,用PCR从中扩增出TTV-ORF1 DNA,插入载体pGEM-T Easy中;测序正确后,克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达载体pGEX-4T-1-ORF1,转化大肠杆菌BL21株进行表达.结果 成功获得TTV-ORF1编码基因并构建原核表达载体,测序结果与GenBank收录序列相一致.诱导表达得到51kD的TTV-ORF1融合蛋白,占细菌总蛋白量的27.2%.Western blot证实为目的蛋白.结论 成功获得TTV-ORF1 DNA,构建得原核表达载体并获得高效表达.为TTV的ELISA检测和疫苗提供抗原.     

微囊化和基因修饰的肝细胞移植--人肝再生增强因子(hALR)的原核表达、纯化及生物活性研究

构建人肝再生增强因子原核融合表达载体，并对表达产物进行生物活性研究，从而为hALR基因修饰的肝细胞移植的细胞来源研究提供实验依据，并为人肝再生增强因子的临床应用奠定基础。方法：以pGEM-T-hALR为模板，应用PCR技术扩增出hALRcDNA，克隆入原核融合表达载体pGEX-4T-2，限制性内切酶酶切及测序证实序列正确；转化大肠杆菌JM109：桃取阳性克隆以IPTG诱导表达融合蛋白GST－hALR，融合蛋白通过谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析纯化后进行凝血酶酶切获得hALR单体；采用^3H-thymidine渗入法检测hALr单体的生物学活性。结果：以pGEM-T-hALR为模板，行PCR扩增后，产物于1．5％琼脂糖凝胶电泳分析，可见380bp特异性条带，符合hALRcDNA阅读框架的大小。构建融合蛋白GST－hALR的重组表达质粒pGEX-4T-2-hALR，经限制性内切酶酶切分析，与理论值相符，测序融合蛋白GST－hALR的重组表达质粒pGEX-4T-2-hALR，经限制性内切酶酶切分析，与理论值相符，测序证明序列正确，片段为正向插入。重组表达质粒转化人肠杆菌JM109。SDS－PAGE电泳分析显示重组菌在约41KD处出现一蛋白条带。纯化、酶切后融合蛋白前体谷胱甘肽S－转移酶约26KD，hALR约15KD。薄层扫描蛋白电泳结果表明，表达的融合蛋白占细菌可溶性蛋白总量的31％。纯化hALR加入原代鼠肝细胞、HepG2细胞培基，细胞DNA合成率较对照组均有显著提高（P＜0．01）。结论：成功构建融合蛋白GST－hALR的重组表达质粒pGEX-4T-2-hALR，限制性内切酶酶切及序列测定证明载体插入正确，并成功转化大肠杆菌JM109得阳性克隆。采用含融合蛋白GST的原核表达载体pGEX-4T-2表达hALR，其突出优点在于表达产率高；重组蛋白主要以可溶形式存在于胞质中，融合蛋白的分离纯化筛单易行。纯化分离后所得hALR能刺激体外培养的原代鼠肝细胞、HepG2细胞DNA合成，具有生物活性。     

骨桥蛋白融合蛋白的原核表达

目的：研究骨桥蛋白（Osteopontin ,OPN ）的作用及机制,探索可大量制备OPN的方法。方法利用重组DNA技术,将OPN 的cDNA片段插入到原核表达载体pGEX-4T-1中,转入大肠杆菌诱导表达GST-0PN融合蛋白。结果成功得到pGEX-4T-1-0PN表达载体且顺利获得大量融合蛋白。结论利用重组DNA技术,将OPN 的cDNA片段插入到原核表达载体pGEX-4T-1中可以制备大量OPN蛋白。     

A型流感病毒核蛋白原核表达载体的构建与表达

目的:构建A型流感病毒核蛋白(NP)的原核表达质粒,分析其在大肠杆菌中的表达状况.方法:采用逆转录聚合酶链式反应技术从A型流感病毒基因组中扩增出编码核蛋白的基因片段,克隆至pGEM-T Easy载体,PCR筛选阳性克隆并测序.经酶切后将目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL2(CDE3),PCR和酶切鉴定转化菌落.将阳性菌落经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析目的蛋白的表达.结果:RT-PCR扩增出NP基因序列,将其亚克隆至表达载体pGEX-4T-1构建成重组表达质粒,并在BL2(CDE3)中表达了NP融合蛋白.结论:成功构建A型流感病毒NP的重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达了NP融合蛋白.     

GST-hZimp10融合蛋白的重组及抗体制备

目的:构建pGEX-4T-1/hZimp10重组质粒,并在大肠杆菌中表达,纯化出GST-hZimp10融合蛋白,用以制备抗hZimp10抗体。方法:采用PCR技术以pcCDNA3.1-Flag-hZimp10为模板,扩增出hZimp10蛋白N端128个氨基酸对应DNA片段,并将其与谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1进行重组,酶切鉴定后获得重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达,获得GST-hZimp10融合蛋白,纯化后将其作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting法检测抗体特异性。结果:经BamHⅠ和XhoⅠ 双酶切鉴定,确定PGEX-4T-1/ hZimp10重组质粒中包含384bp的片段,与测序结果一致,表明pGEX-4T-1/hZimp10重组质粒构建成功。SDS-PAGE电泳,融合蛋白成功表达,蛋白相对分子质量大小与预期相符。间接ELISA法检测抗hZimp10抗体效价可达1:100 000以上。Western blotting法,hZimp10在LNCaP细胞中具有很高的特异性。结论:成功获得GST-hZimp10融合蛋白,且制备了抗hZimp10抗体。