大鼠骨髓间充质干细胞电生理特性的研究

目的 观察骨髓间充质干细胞(BMSC)的电生理特性,为临床干细胞移植的安全性提供参考.方法 分离并培养BMSC,应用全细胞膜片钳技术记录BMSC的电生理特性.结果 BMSC的静息膜电位为(-33.6±6.8)mV,平均细胞膜电容为(32.3±8.7)pF (n=30).电压钳实验显示,BMSC上可记录到KCa、Ito,IKSUS和IK1 4种通道电流,但未记录到INa和ICa通道电流.结论 BMSC上存在4种不同类型钾离子通道.     

骨髓间充质干细胞体外扩增和向心肌细胞分化的实验研究

①目的 探讨兔骨髓间充质干细胞的体外分离纯化、培养扩增和向心肌细胞诱导分化的条件。②方法 取兔股骨骨髓。利用密度为1．073s／mL的Percoll分离骨髓细胞，以含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基培养与扩增骨髓间质干细胞。取第二代和第三代的骨髓间质干细胞，以含有不同浓度的5-氮杂胞苷诱导培养基向心肌细胞诱导分化。③结果 诱导后的细胞呈现典型的心肌细胞样改变，免疫组化染色显示其α-横纹肌动蛋白阳性。④结论骨髓间质干细胞在体外具有向心肌细胞分化的潜能。     

骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞的鉴定指标

越来越多的研究发现,骨髓间充质干细胞(BMSCs)在一定的诱导条件下可以定向分化为心肌样细胞。该文对BMSCs定向分化为心肌样细胞的鉴定指标结蛋白、α肌动蛋白、肌钙蛋白、间隙连接蛋白43、肌细胞增强子2C、心脏转录因子GATA结合蛋白4、Csx/Nkx2.5、超极化激活的核酸环化酶门控的离子通道2/4、肌球蛋白重链等予以综述。     

骨髓间充质干细胞与心肌细胞再生和心脏修复

长期以来，心肌细胞被认为是不可能发生损伤修复的。但是，近年来随着干细胞移植的兴起，这一观念发生了改变，许多研究已证实心肌可通过多种途径发生再生和修复，缺血心肌的再生和修复已成为心血管病研究领域的一大热点。而骨髓问充质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）是存在于骨髓基质中的一种非造血系干细胞，它不但能够在体外扩增，而且具有多向分化的潜能，可通过诱导分化为心肌细胞，促进血管新生等多种途径参与心肌的再生和修复，虽然其作用机制还有待进一步探讨，但这也将为治疗心肌梗死等缺血性心脏病开辟一条新的途径。本将对BMSCs与缺血心肌细胞再生和修复的研究进展作一综述。     

小鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向心肌细胞分化的研究

目的探讨体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌细胞分化的方法。方法分离2周龄小鼠胫骨、股骨，冲洗出骨髓，利用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁培养的方法获得MSCs。取传2代细胞培养48h，分为4组：A组加入心肌组织块条件培养液、B组加10μmol／L 5-氮胞苷（5-aza）、C组为二者的混分液、D组不加任何诱导剂以作对照组。应用免疫细胞化学方法检测各组心肌特异性蛋白α-actin的表达。结果免疫细胞化学染色结果显示，A组细胞培养3周时可检测到α-actin阳性细胞，阳性细胞较多；B组培养1周可见弱阳性细胞，随时间延长，阳性着色增强且阳性细胞数增多，3周时呈强阳性表达；C组2周即可检测到细胞呈强阳性着色。对照组MSCs胞浆内未检测到α-actin的表达。4个组的阳性细胞率进行两两比较均有统计学意义（P〈0.05）。结论心肌组织块条件培养液和5-aza联合应用可促进MSCs体外分化为心肌样细胞。     

心肌细胞介导骨髓间充质干细胞的心肌样分化

目的探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在不同培养条件下定向分化过程中的生物学特性变化及其机制.方法贴壁法分离大鼠MSCs,培养至第6代.实验分3组:条件培养基组,用新生鼠心肌细胞培养上清液制成的条件培养基处理MSCs48 h 2次,其间间隔48 h;混合培养组,新生鼠心肌细胞和MSCs按1:1的比例混合培养1周;对照组,MSCs常规培养.检测各组MSCs中心肌细胞结构功能蛋白:心肌肌联蛋白(titin)、肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)、心肌组织缝隙连接的特异性组成蛋白质Connexin43(Cx43)的表达情况.结果①条件培养基可诱导MSCs心肌样分化,表达心肌细胞骨架蛋白titin的Z带及A带部分,Cx43大量表达,但在检测期内未观察到MHC的表达;②MSCs在混合培养中与心肌细胞形成连接,表达titin,部分细胞内可检测到类似肌小节的结构,Cx43集中分布于细胞相邻的界面;③对照组中的部分MSCs可少量表达Cx43及titin.结论源于心肌细胞的各种因素可促使MSCs心肌样分化,分化的程度取决于作用信号的性质.     

不同比例心肌细胞诱导骨髓间充质干细胞成心肌样分化的实验研究

目的观察不同细胞比例条件下,心肌细胞(CMs)间接接触对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样分化的诱导作用,以确定较高的诱导比例。方法分离培养大鼠BMSCs,与CMs分别以1:1、1:2、1:4、1:5、1:10的比例在体外共培养,14d后采用实时荧光定量聚合酶链反应(Q-PCR)检测各个比例下BMSCs中心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达情况。结果各比例组BMSCs中的cTnT均有一定表达,且表达量随着比例的升高而增加。结论在共培养条件下,不同比例条件下的CMs对BMSCs成心肌样分化的诱导作用不同,随着比例的增加而增强。     

丹酚酸B诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的:体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),并研究中药单体丹酚酸B诱导MSCs向心肌样细胞分化.方法:用贴壁培养法分离、培养、纯化MSCs,免疫荧光法检测细胞抗原CD44和CD34.分别用含5 μmol/L的5-氮胞苷(5-aza)和30 mg/L丹酚酸B的低糖DMEM培养液培养MSCs 24 h后,RT-PCR法检测培养1,7,14和21 d心肌特异性转录因子NKX2.5,GATA-4和心肌特异性蛋白α-actin mRNA的表达,用免疫荧光法检测诱导后α-actin的表达情况.结果:获得纯化的MSCs,免疫荧光检测细胞表面标记CD44呈阳性,CD34呈阴性.诱导后细胞形态逐渐发生变化.RT-PCR显示NKX2.5和GATA-4 mRNA在MSCs有基础性的表达,而分别以5-aza和丹酚酸B处理24 h后,NKX2.5和GATA-4mRNA表达增强,7 d时表达达高峰,以后维持在高水平,与空白对照组相比,有统计学差异(P＜0.01).未诱导的MSCs α-actin mRNA表达呈阴性,丹酚酸B诱导后的第14日,出现α-actin mRNA的表达.结论:用贴壁培养法可获得纯化的MSCs,丹酚酸B可诱导MSCs向心肌样细胞分化.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

[目的] 探讨体外培养定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞 ( MSCs )向心肌样细胞分化的潜能.[方法] 取大鼠下肢骨骨髓,分离培养 MSCs,用 5-氮胞苷 ( 5-aza )定向诱导 24 h,相差显微镜下观察其形态变化,免疫组化法检测肌钙蛋白 ( cTnT )和心肌细胞结蛋白 ( desmin )表达,并通过 RT-PCR对肌球蛋白重链 ( MHC )在细胞中的表达进行鉴定.[结果] MSCs经 5-aza诱导后,部分细胞呈梭形,并可见肌管样结构.免疫组化检测示诱导后 MSCs的 cTnT阳性细胞数为 15%, Desmin表达强阳性, RT-PCR示诱导后 MSCs有 MHC表达.[结论] MSCs在体外能在一定条件下被诱导分化为心肌样细胞,是心肌缺血干细胞移植的较理想的细胞来源.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

【目的】探讨体外培养定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化的潜能。【方法】取大鼠下肢骨骨髓，分离培养MSCs，用5-氮胞苷(5-aza)定向诱导24h，相差显微镜下观察其形态变化，免疫组化法检测肌钙蛋白(cTnT)和心肌细胞结蛋白(desmin)表达，并通过RT-PCR对肌球蛋白重链(MHC)在细胞中的表达进行鉴定。【结果】MSCs经5-aza诱导后，部分细胞呈梭形，并可见肌管样结构。免疫组化检测示诱导后MSCs的cTnT阳性细胞数为15％，Desmin表达强阳性，RT—PCR示诱导后MSCs有MHC表达。【结论】MSCs在体外能在一定条件下被诱导分化为心肌样细胞，是心肌缺血干细胞移植的较理想的细胞来源。     

犬骨髓间质干细胞体外定向诱导分化心肌细胞的实验研究

目的建立骨髓间质干细胞体外诱导分化心肌细胞的方法。方法犬骨髓液10ml通过密度梯度离心法分离出间质干细胞,间质干细胞用5-氮胞苷诱导培养3～4周,进行心肌细胞特异性标志物测定及细胞超微结构的观察。结果犬骨髓间质干细胞经5-氮胞苷诱导培养3～4周后,免疫组化显示肌细胞特异性蛋白α-actin、Myosin、TropninⅠ阳性,心肌特异性肌钙蛋白I阳性。电镜观察细胞呈梭形,可见细胞肌丝与房性颗粒。结论密度梯度分离法分离出骨髓间质干细胞,用5-氮胞苷诱导后可分化为心肌细胞。此可为心肌梗死、心力衰竭与心律失常的移植及修复治疗提供理想的细胞材料。     

Electrophysiological characteristics of cardiomyocyte-like cells from rat bone marrow derived mesenchymal stem cells by four inductors

Background Bone marrow derived mesenchymal stem cel induced by different inductors individually or collectively. In s （BMdMSCs） can differentiate into cardiomyocyte-like cells this study, by inducing BMdMSCs with p53 inhibitor （p-fifty three inhibitor-alpha, PFT-a）, 5-azacytidine （5-AZA）, angiotensin-II （Ang-II） and bone morphogenic protein-2 （BMP-2） we compared the influences of four inductors on the differentiation of rat BMdMSCs into caridomyocyte like-cells. Methods BMdMSCs were collected from the bone marrow of Sprague Dawley rats and after the fourth generation, the purified cells were divided into five groups： 5-AZA （10 μmol/L）, Ang-II （0.1 μmol/L）, PFT-α （20 μmol/L）, BMP-2 （10μg/L） and control. The purity of the BMdMSCs and the cardiac differentiation rates were obtained by flow cytometry. The expressions of cTnT in the BMdMSCs after four weeks of induction were detected by immunofluorescence and the expressions of cTnl and Cx43 detected by Western blotting. The green fluorescent levels reflecting intracellular calcium transient function were determined by laser scanning confocal microscopy. The total potassium current levels of cells were measured on patch clamp. Results All inductors affected to a different degree the differentiation of BMdMSCs into cardiomyocyte-like cells and the expressions of cTnT, cTnl and Cx43 suggesting that the combination of inductors could be an improved method for cardiac regenerative medicine. In addition, the total potassium current level and calcium transient in PFT-a cardiomyocyte-like cells were higher than other groups. Conclusions The cardiac differentiation of BMdMSCs induced by PFT-α, 5-AZA, Ang-II and BMP-2 has been improved at different levels. PFT-a has an advantage of differentiation rate and electrophysiological function over other inductors.     

大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞内向钠电流的研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)诱导分化为心肌样细胞内向钠电流的状态.方法取健康SD大鼠骨髓,经密度梯度离心和贴壁培养获得MSCs,传至第两代,以10 μmol/L的5-氮杂胞嘧啶(5-aza)孵育诱导24h.培养4周,用免疫细胞化学染色方法鉴定心肌样细胞(cardiomyocyte-like cells);用全细胞膜片钳技术,检测胞膜内向钠电流,并与未经诱导的MSCs和急性分离的心肌细胞进行比较.结果MSCs经5-aza诱导后部分表达心肌特异性肌钙蛋白T,在诱导后4周记录到快速激活和失活的膜内向钠电流.与急性分离的心肌细胞比较,相同刺激脉冲下心肌样细胞所产生的电流幅值较小,Ⅰ-Ⅴ曲线向右偏移.结论经5-aza诱导后,MSCs可分化成具有兴奋性内向钠电流的心肌样细胞.     

人胎盘来源间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征比较

目的:从人足月的胎盘羊膜中和Wistar 大鼠股骨及胫骨骨髓中分离、培养间充质干细胞（MSCs）,研究人胎盘来源MSCs（HPMSCs）和大鼠骨髓来源MSCs（BMSCs）的分离培养方法和生物学特征、表面标志及其多分化潜能。方法:将人足月胎盘组织通过胶原酶Ⅱ消化培养获取HPMSCs,采用全骨髓贴壁法从4周龄Wistar大鼠双侧股骨及胫骨中分离、纯化大鼠BMSCs,运用活细胞计数法检测其增殖能力,采用流式细胞术检测2种细胞表面标志物的表阳性率;
用地塞米松、维生素C和β磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,用茜素红染色鉴定;用胰岛素、地塞米松、IBMX和吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,以油红O染色鉴定。结果:HPMSCs为梭形贴壁细胞,增殖能力较强,CD44和CD34表达阳性率分别为94.45%和1.67%;BMSCs为圆形、梭形和多角形,增殖能力强,CD44和CD34表达阳性率分别为93.11%和2.68%。2种细胞经过成脂诱导液和成骨诱导液诱导后,茜素红和油红O染色结果均为阳性,表明2种细胞均可向脂肪细胞和成骨细胞分化。结论:HPMSCs与大鼠BMSCs的生物学特征相似,同样具有多分化潜能,HPMSCs具有更强的增殖能力。     

骨髓间质干细胞分离培养及向心肌细胞的转化

目的:探讨骨髓间质干细胞(MsCs)诱导分化为心肌细胞的可能性,为干细胞移植治疗心肌梗死寻求理想的细胞材料.方法:体外分离培养大鼠骨髓MSCs,5-氮胞苷(5-aza)诱导24 h后继续培养,免疫细胞化学染色和RT-PCR检测心肌细胞特异性蛋白的表达.结果:MSCs经5-aza诱导后3周心肌肌钙蛋白T和连接蛋白43免疫细胞化学染色阳性表达;RT-PCR显示诱导3周细胞有心肌肌钙蛋白I、α心肌肌动蛋白表达.结论:MsCs可在体外经5-aza诱导定向分化为心肌细胞.     

骨髓间充质干细胞的免疫调节活性

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一种多潜能的非造血干细胞,可以向多系分化,如骨、脂肪和软骨,并优先归巢于损伤组织,有利于组织修复。体外研究显示它们不诱导免疫应答,对识别、清除同种异体抗原的免疫细胞具有抑制作用。在动物实验中,骨髓间充质干细胞可以诱导外周免疫耐受并向损伤处迁移,抑制致炎细胞因子的释放,促进损伤组织修复。这种独特作用说明它们在细胞治疗和自身免疫性疾病治疗中发挥了积极作用。     

脉冲微交流电刺激促进体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌分化

目的 探讨脉冲微交流电刺激对体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的作用.方法 常规方法 分离培养鼠骨髓间充质干细胞,取P3细胞进行5-氮胞苷诱导,诱导后以是否给予脉冲微交流电刺激分为两组,观察各组细胞生长情况、细胞形态学及超微结构改变,免疫细胞化学方法 检测、cTnT、Cx43的表达.结果 脉冲微交流电刺激组细胞较非刺激组生长良好,更早出现心肌样细胞改变,诱导后1周可观察到胞内肌丝形成及、cTnT、Cx43的表达,且在随后的相同时相点(诱导后2、3、4周),、cTnT、Cx43表达水平明显高于非刺激组,胞内肌丝也由杂乱分布逐渐成束,部分细胞可观察到肌节.结论 模拟心脏跳动的脉冲微交流电刺激有助于经5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞在体外分化为功能完备的心肌样细胞.     

MSC体外诱导分化为心肌样细胞的鉴定及Nesprin蛋白表达研究

目的体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）向心肌细胞分化并进行相关鉴定,观察分化过程中细胞Nesprin蛋白表达的变化。方法大鼠MSC经Ficoll密度梯度离心法分离获得后贴壁传代培养,流式细胞术鉴定第2代MSC表面抗原表达。以10μmol／L5-氮杂胞苷（5-Aza）诱导第2代MSC向心肌细胞分化,观察细胞形态学改变;RT—PCR、免疫组织化学法和免疫荧光细胞化学染色鉴定心肌细胞相关蛋白Desmin、α—sarcomeric actin、cardiac Troponin Ⅰ（cTnⅠ）mRNA和蛋白表达;Western blotting检测MSC分化前后Nesprin蛋白表达。结果经5-Aza诱导分化后的MSC细胞及细胞核增大,形态渐趋一致,大部分呈长梭形;细胞Desmin、α-sarcomericactin、cTn ⅠmRNA和蛋白呈阳性表达。免疫荧光细胞化学染色显示Nesprin蛋白定位于核膜,Westernblo Ring分析发现诱导分化后细胞Nesprin蛋白表达明显增加（P〈0．05）。结论成功诱导大鼠MSC向心肌细胞分化;Nesprin蛋白在分化后细胞中的表达明显增加,提示Nesprin可能参与MSC向心肌细胞样变化的过程。     

体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的体外分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)并研究其一般的生物学特性.方法通过密度梯度离心法分离MSCs、体外培养传代细胞计数、流式细胞仪检测细胞增殖周期、表面分子测定以及细胞化学染色了解人MSCs一般的特点.结果人MSCs经过体外培养均一地表达CD29、CD44、CD166,而CD34、CD45阴性.细胞化学结果显示,细胞糖原(PAS)强阳性,脂肪(SB)为阴性,5%～10%细胞碱性磷酸酶(ALP)阳性.细胞周期分析表明:G0/G1、S和G2/M所占比例分别为83.11%、5.17%和11.72%.分离细胞在成骨诱导体系下进一步向成骨细胞分化.结论密度梯度离心法能够分离纯化MSCs有其特殊的生物学特点,能够向成骨细胞分化.