应用酵母双杂交系统筛选虾夷扇贝FOXL2的相互作用蛋白

FOXL2是脊椎动物的雌性决定基因,在多种无脊椎动物中也被认为是雌性决定与分化的关键基因,但其在无脊椎动物中的作用机制目前尚不清晰。本文利用Clontech酵母双杂交系统筛查虾夷扇贝FOXL2的相互作用蛋白。研究首先构建诱饵质粒pGBKT7-FOXL2,并检测诱饵蛋白的毒性及自激活活性,结果显示诱饵蛋白对酵母菌株无毒,也无自激活活性。利用该诱饵质粒,本研究从虾夷扇贝酵母双杂交cDNA文库筛选得到17个阳性克隆,测序验证得到12个读码框正确的阳性克隆,它们来自4种蛋白:COP9信号复合体亚基5、钠/钾ATP酶β3、哺乳动物室管膜相关蛋白1和胰脂肪酶相关蛋白2。研究进一步将诱饵质粒与4种蛋白的猎物质粒进行共转化验证,结果均为阳性,表明这4种蛋白与虾夷扇贝FOXL2都可能存在相互作用。本文为研究FOXL2在无脊椎动物性别决定与分化中的作用提供了参考。     

条斑紫菜丝状孢子体cDNA文库构建及抗病相关基因鉴定

经过微量总 RNA抽提、c DNA合成、c DNA扩增和克隆等步骤 ,构建了微量条斑紫菜丝状孢子体 c DNA文库 ,并进行了小规模表达序列标签分析。从 1 70条标签序列中鉴定出 6条抗病相关基因序列。这些序列可用于研制抗病单核苷酸多态性标记 ,辅助紫菜抗性遗传改良。     

不同时期和生长状态条斑紫菜总可溶性蛋白差异表达初探

用SDS-PAGE技术研究了不同时期条斑紫菜样品、高温下培养的丝状体以及不同季节收获的叶状体的总可溶性蛋白。结果表明,这些样品总可溶性蛋白的表达数量和种类相差很大。壳孢子中总可溶性蛋白的表达数量和种类明显比丝状体中多,但比膨大丝状体中少;高温条件下培养的丝状体比正常条件下培养的丝状体表达更多数量和种类的可溶性蛋白;所有样品中,以叶状体表达的溶性蛋白的表达数量和种类最多;上年收获的与本年度不同季节收获的叶状体在蛋白质表达图谱上差别很小。     

锯缘青蟹(Scylla serrata)呼肠孤病毒5个结构蛋白互作分析

采用酵母双杂交系统,对青蟹呼肠孤病毒(Scylla serrata reovirus)5个结构蛋白(VP3,VP6,VP9,VP11,VP12)间的双向互作进行了分析。将5个结构蛋白对应的ORF分别亚克隆至诱饵载体p GBKT7和猎物载体p GADT7,成功构建了10个酵母双杂交重组载体。将重组诱饵载体或重组捕获载体转化至酵母菌Y2H Gold中进行自激活检测,结果显示5个结构蛋白均不能激活酵母菌报告基因HIS3的表达,表明5个病毒蛋白均不具有自激活活性。通过酵母双杂交实验,从5个结构蛋白25个可能性互作对中,共筛选出2个双向互作对(VP11VP6,VP11VP12)和3个自身互作对(VP3VP3,VP11VP11,VP12VP12)。本研究是有关Ss RV结构蛋白互作的首次报道。     

可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)酵母双杂交文库和铁结合蛋白真核表达载体的构建

构建了可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)的酵母双杂文库, 总克隆数为6.09×106CFU, 重组率100%, 平均插入片段长度>1kb。随机挑取200个克隆子测序, 结果1个空载, 67 个无法对应的基因类型, 已知的132个基因中线粒体蛋白占29.54%, 蚯蚓血红蛋白15.9%, 核糖体蛋白10.6%, 铁结合蛋白8.3%, 肌动蛋白6.1%, 其它基因29.56%。这些基因分别为: 5-氨基乙酰丙酸合成酶、类博莱霉素水解酶、纤溶蛋白、谷氨酰胺合成酶、热休克蛋白、非特性类碱性磷酸酶、脂肪酶、金属蛋白、线粒体、硫氧还蛋白、蛋白磷酸酶、肌钙蛋白C、泛素。根据已获得的可口革囊星虫铁结合蛋白基因, 以EcoRⅠ和KpnⅠ为双酶切位点设计引物, 构建了可口革囊星虫铁结合蛋白真核表达载体pPink-HC-fer, 经PCR 及测序检验, 序列完全正确, 然后电转化至酵母细胞中诱导表达, 经SDS-PAGE检验其融合蛋白分子量大小约为23kDa。     

低盐、高温诱导的条斑紫菜(Pyropia yezoensis)病烂机制研究

条斑紫菜(Pyropia yezoensis)是中国北方沿海大面积栽培的一种重要大型经济海藻。近些年,因高温等环境因子导致的烂菜时有发生,严重制约了产业的可持续发展。测定分析了不同温度(15°C和20°C)、不同盐度(20,25和30)条件对条斑紫菜叶状体光合作用参数、抗氧化酶系统活性及相关分子表达量变化的影响。发现高温(20°C)和低盐(盐度20)胁迫下会导致潜在最大量子产额(Fv/Fm)下降、非光化学淬灭Y(NO)值上升;同时,高温低盐(20°C,盐度20)条件下丙二醛(MDA)含量显著提高,表明条斑紫菜叶状体光合作用系统已受到一定的损伤。另外,过氧化氢酶(CAT)与抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性随盐度降低而下降,在盐度20和高温(20°C)时其酶活显著降低,而超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性显著上升。而荧光定量结果显示,在20°C高温条件下, SOD转录出现轻微上调。随着盐度的降低, POD转录水平显著下调。此外, 20°C高温胁迫下,低盐盐度20条件下,相关抗氧化酶系统关键基因的表达均出现显著下调,表明在高温、低盐胁迫下,藻体内氧自由基清除能力受到抑制,最终导致细胞受到氧化损伤。因此,本实验表明,在高温条件下、盐度降低导致的抗氧化系统酶活及相关基因表达受到抑制,这是紫菜病烂发生的诱因之一。     

条斑紫菜5个栽培品系的ISSR分析

利用ISSR-PCR方法对条斑紫菜(Porphyrayezoensis)5个栽培品系进行遗传多态性分析,优化了PCR反应体系和反应参数。从100个ISSR引物中筛选23个引物扩增了217个DNA片段,其中201个片段呈现多态性,占总扩增片段的92.6%。依据扩增结果进行遗传相似性和遗传距离分析,构建分子树状图。结果表明,在条斑紫菜5个品系中,采自南通海区的2个品系首先聚在一起,其遗传距离为0.3897;接着依次和来自青岛的2个野生品系聚类,两个野生品系间的距离为0.4299;原种来自日本的样品与其他4个样品相距最远,平均遗传距离为0.4469。同时,5个紫菜品系的ISSR分析中产生了一些特有的指纹图谱,可进一步应用于种质分析的研究。     

条斑紫菜SOD基因家族的全基因组分析及温度和失水胁迫下表达研究

为探究超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)在条斑紫菜响应温度和失水胁迫时发挥的作用,本文利用生物信息学的方法对条斑紫菜SOD基因家族的进化树、染色体定位、基因结构和蛋白结构等方面进行研究分析。在条斑紫菜中共鉴定出12个SOD基因(PySOD),包括8种Cu/Zn-SOD、3种Mn-SOD和1种Fe-SOD,不均等地分布在3条染色体上,且各含0～2个内含子;SOD基因启动子区域含有不同数目的胁迫响应、生长发育和激素响应元件;Mn-SOD和Fe-SOD二级结构中α螺旋所占比重大,Cu/Zn-SOD中β折叠所占比重大。基于条斑紫菜受到温度和失水胁迫的转录组数据和qPCR结果,PySOD不同胁迫条件下具有不同的表达模式,尤其在失水胁迫时Cu/Zn-SOD表达量呈现不同程度的上调。这种PySOD基因的全基因组分析为了解植物中SOD基因的进化关系提供信息,并且条斑紫菜受温度和失水胁迫时SOD基因的表达分析为改良条斑紫菜育种提供参考。     

条斑紫菜( Porphyra yezoensis) 耐高温品系的筛选及特性分析

采用60Co-γ射线诱变和高温胁迫处理条斑紫菜野生品系(WT),进行了耐高温品系的选育研究。结果表明,在18℃和22℃组,所选育的耐高温品系(TM-18)和WT品系的壳孢子存活率无显著差异,但在24℃和25℃组,TM-18与WT相比,壳孢子存活率分别提高了274%和296%,畸形苗率分别下降了286%和161%,假根发生率分别提高了151%和429%。将18℃培养50d的苗再分别在18℃、22℃和24℃下再培养30d,TM-18苗的绝对生长率分别为WT苗的3.82、3.16和4.95倍,特定生长率为WT苗的1.53、1.49、2.10倍。在24℃下培养15d或25℃下培养10d,WT苗停止生长,出现了卷曲和严重腐烂,而TM-18苗仍然生长良好,不腐烂。另外,TM-18的三种主要光合色素(Chl.a、PE和PC)含量明显比WT高。上述结果说明,TM-18是一个颜色好、生长快和耐高温的优良品系。     

条斑紫菜丝裂原活化蛋白激酶PyMAPK3基因的克隆及胁迫条件下的功能分析

本研究从条斑紫菜中克隆了一个丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase)基因,命名为PyMAPK3。该基因全长2155bp,开放阅读框(ORF)1401bp,编码466个氨基酸,含有两个内含子。氨基酸序列分析表明,PyMAPK3磷酸化位点的氨基酸基序为TDY,其等电点为7.17,蛋白分子量为51.6KDa,亚细胞定位于叶绿体。荧光定量PCR技术对该基因在不同非生物胁迫条件下的转录差异分析结果显示,极端胁迫条件下基因表达量显著增加。蛋白免疫印迹技术对蛋白在不同胁迫条件下的表达量分析结果显示,在不同的胁迫条件下其翻译水平的表达模式表现出与转录水平的不一致性。本研究为深入了解条斑紫菜在逆境适应机制中MAPK蛋白的作用奠定基础,同时为条斑紫菜抗逆品系的选育提供理论指导。     

条斑紫菜Tubulin和Kinesin基因家族鉴定及失水胁迫表达模式分析

微管是细胞骨架的主要成分,其结构及动力学机制对提高生物体耐受性具有重要作用。微管网络如何通过结构的动态变化调控适应环境变化已成为胁迫生物学领域的研究热点之一。条斑紫菜(Pyropiayezoensis)能够适应潮间带复杂多变的环境,是研究潮间带大型海藻抗逆机制的良好材料。目前对紫菜微管相关基因家族构成及其生物学功能的研究较少。本研究利用生物信息学方法,在条斑紫菜基因组中共鉴定出4个Tubulin基因(Pyα-tubulin 1、Pyα-tubulin 2、Pyβ-tubulin和Pyγ-tubulin)和11个Kinesin基因(PyKinesin1—PyKinesin11),并对其理化性质、基因结构、蛋白特征、染色体定位、系统进化和失水胁迫下的表达模式进行了系统分析。结果显示:条斑紫菜中有3种微管蛋白(Tubulin)亚型;该家族成员散布于1号和2号染色体上, Pyα-tubulin 1和Pyα-tubulin 2为串联重复基因;PyTubulin家族成员在基因结构和蛋白特征方面均较为保守,且在转录水平对失水胁迫不敏感。条斑紫菜中有5种驱动蛋白(Kinesin)亚型,亚家族种类和基因数量均少于高等植物;该家族基因散布于1号、2号和3号染色体上,无串联重复基因; PyKinesin家族成员在基因结构和蛋白特征方面存在一定差异,PyKinesin1在中高度失水胁迫下表达量显著上调。本研究为进一步理解Tubulin和Kinesin基因家族的进化和功能、解析微管在条斑紫菜响应失水胁迫中的作用奠定了基础。     

条斑紫菜PyMGST3基因克隆、表达及功能分析

微粒体谷光甘肽硫转移酶(microsomal glutathione S-transferases,MGST)作为膜结合蛋白之一,具有谷光甘肽转移酶和过氧化物酶活性,在细胞及细胞器的抗氧化胁迫中扮演着重要角色,但MGST基因在紫菜(Pyropia yezoensis)中的鉴定与分析还未见报道。本文采用RACE-PCR方法首次克隆了条斑紫菜的微粒体GST基因的全长,命名为PyMGST3,同时利用生物信息学及实时定量PCR方法对该基因的序列及诱导表达特征进行了分析,并通过原核表达进一步验证了该基因的酶活性及在抗氧化胁迫中的作用。结果表明,PyMGST3基因的c DNA序列全长为681bp,其中开放阅读框长度417bp,5'-UTR长度80bp,3'-UTR长度184bp,在受到Cd~(2+)和Cu~(2+)胁迫时,上调表达;PyMGST3蛋白具有三个跨膜结构域及跨膜疏水区,与皱波角叉菜的MGST蛋白相似性最高为60%,与其它藻类的MGST蛋白的相似性较低;在大肠杆菌中表达及纯化后的PyMGST3蛋白具有谷光甘肽转移酶活性;此外,超表达PyMGST3蛋白的重组菌株提高了对抗Cd~(2+)和Cu~(2+)毒害的能力。这些结果暗示PyMGST3基因很可能在条斑紫菜遭遇重金属等引起的氧化胁迫时起到重要的保护作用。     

基于第二代测序技术的条斑紫菜(Pyropia yezoensis)贝壳丝状体附生菌群研究

条斑紫菜(Pyropia yezoensis)贝壳丝状体黄斑病给育苗产业造成危害,但目前对健康状态下的菌群结构及其发病后变化仍缺乏认识。本研究基于第二代测序技术和16S r RNA序列分析,对健康和患病丝状体的细菌组成与变化进行比较。测序共产生1.6Gb配对末端序列,获得了第一个高通量的条斑紫菜贝壳丝状体细菌群落数据集。通过数据分析共识别出7,833种可操作分类单元(operational taxonomic units,OTUs),比对确定为18个细菌门。相对于健康样本,黄斑病丝状体样本的微生物多样性显著增加。主坐标分析和非加权组平均法(unweighted pair group method using arithmetic average,UPGMA)聚类均将健康和黄斑病丝状体分成不同的组,且健康组样本间的距离明显小于黄斑病组。上述结果说明,健康贝壳丝状体保持着相似的微生物群落结构,而患病后的丝状体则发生了不同的变化;健康样本和黄斑病样本组间差异显著的细菌属有39个,其中29个在健康样本中的相对丰度明显高于病患组样本。本研究从菌群生态角度分析了健康贝壳丝状体微生物菌群结构、发病后菌群的变化及其对丝状体生长的潜在作用,为丝状体病害的检测和预防提供有价值的信息。     

温度对皱紫菜(Pyropia crispata)壳孢子萌发及叶状体形态建成的影响

近几年,紫菜"高温烂菜"现象频发,为开发耐高温紫菜栽培种质,本文研究了4种温度(15、20、25、28℃)对皱紫菜壳孢子萌发及叶状体形态建成的影响,并观察了藻体的繁殖特性。结果显示,在试验设定的培养条件下,适宜皱紫菜壳孢子萌发生长温度为20—25℃,最适温度为20℃。皱紫菜壳孢子幼苗萌发初期细胞分裂为横分裂,叶状体细胞呈直线排列,生长至7—10个细胞后,细胞开始出现纵分裂。15、20℃温度组藻体多为不规则的半圆形裂片。25、28℃温度组藻体多为细长型叶片。有性生殖是皱紫菜主要的繁殖方式,但15—20℃培养组的部分藻体能够少量形成并放散类似无性生殖的单孢子并萌发形成叶状体。     

不同氮浓度下盐胁迫对坛紫菜(Pyropia haitanensis)生长和光合作用的影响

为了探讨在不同氮浓度条件下盐度胁迫对坛紫菜(Pyropia haitanensis)生长和光合生理的影响,设置高(500μmol/L)、低(50μmol/L)2个氮浓度和15、30和45三个盐度水平,将坛紫菜叶状体在不同的氮和盐度条件下适应培养7d后,测定藻体的生长、色素含量、光合放氧和快速光反应曲线等生理指标。结果显示:在低氮条件下,坛紫菜的生长速率随盐度增加而递减;在高氮下,30盐度水平培养的藻体具有最大生长速率。低氮条件下,叶绿素a(Chl a)、类胡萝卜素(Car)、藻红蛋白(PE)和藻蓝蛋白(PC)的含量在盐度15中较高,而在盐度30和45之间没有显著差异;高氮条件下,盐度对藻体Chl a和Car的含量没有显著影响,但相对于盐度30的处理,盐度15和45都显著降低了PE和PC的含量,虽然这两种色素含量在两个盐度处理间没有显著差异。不同的氮和盐度处理对藻体的光合放氧速率几乎没有影响,除了高氮条件下,单位湿重的放氧速率在盐度30中较低而单位Chl a的放氧速率在盐度45中稍高。从快速光反应曲线的结果看出,盐度虽然对光饱和点(Ik)、电子传递效率(α)和最大相对电子传递速率(r ETRmax)没有显著影响,但高盐胁迫显著提高了光抑制项的值(a)。综上所述,高盐度胁迫能够抑制坛紫菜的生长和光合作用,氮的浓度对这种抑制作用没有显著影响;低盐度胁迫对藻体的生长和光合没有抑制,甚至在低氮条件下表现出对生长的促进。这些结果为坛紫菜的栽培和对富营养化海水的修复提供了一定的理论参考。     

青蛤(Cyclina sinensis)cDNA文库构建及免疫相关因子基因的筛选

在鳗弧菌侵染下,利用SMART方法构建了青蛤的cDNA文库,并采用高通量测序方法和BLASTX比对筛选出ESTs及免疫相关因子的基因.结果表明,所构建的cDNA文库的库容量为1.12×106,插入片段均在500bp以上;大于100bp的有效ESTs序列1113条,平均长度725bp,拼接后获得一致性序列420条,其中包括126个叠联群和294个单拷贝EST,BLASTX比对后获得注释序列271条,进一步筛选获得青蛤免疫相关因子基因序列45条,为克隆其免疫防御相关因子的基因提供了重要的基础.     

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)诱导拟穴青蟹(Scylla paramamosain)血淋巴cDNA 文库构建及表达序列标签初步分析

利用SMART技术构建副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)诱导的拟穴青蟹(Scylla paramamosain)血淋巴cDNA文库。结果表明,该文库的滴度为1.04×107CFU/mL,文库总容量达1.144×107CFU,克隆子插入片段大小为500—2000bp,重组率达98%。将随机挑选的300个阳性克隆测序,经过质量控制和拼接,共得到141个单基因组簇(UniGenes),75个UniGenes与NCBI非冗余蛋白质数据库中登录的蛋白质序列存在显著相似性,其中20个与免疫防御相关,如kazal-like丝氨酸蛋白酶抑制剂类蛋白、kazal-type蛋白酶抑制剂arasin-like蛋白、抗内毒素因子、抗微生肽、金属硫蛋白、铁蛋白、类70kD热休克蛋白等,达总测序数的6.67%。研究结果证实,构建cDNA文库是获得拟穴青蟹免疫相关基因的可靠途径。