体外培养大鼠胚胎脊髓神经干细胞的增殖和分化

目的探讨大鼠胚胎脊髓神经干细胞的体外培养生长及分化情况,为神经干细胞的临床应用提供实验依据。方法取孕13d SD大鼠胚胎脊髓,在条件培养基中培养获得神经干细胞,应用免疫荧光法鉴定。神经干细胞在含血清的培养基中传代培养,应用免疫细胞化学法检测神经干细胞的分化情况。结果从大鼠胚胎脊髓可获得具有自我增殖分化能力的神经干细胞,培养7d即可获得神经球。用免疫细胞化学和免疫荧光法鉴定干细胞分化,可检测到神经元和星形胶质细胞。结论从大鼠胚胎脊髓能分离获得神经干细胞,并可向神经元和星形胶质细胞方向分化。     

ES细胞来源的神经前体细胞移植Aβ损伤大鼠海马后的分化及对学习记忆的改善

目的 观察来源于小鼠胚胎干细胞的神经前体细胞移植Aβ海马损伤大鼠后的存活、分化以及细胞移植对模型大鼠的治疗作用.方法 采用改良的无血清方法将表达绿色荧光的小鼠胚胎干细胞定向诱导为神经前体细胞,移植至单侧海马注射Aβ1-40损伤模型大鼠注射处;免疫荧光双染观察移植细胞的存活、分化.结果 胚胎体在改良的N3选择性培养基生长5 d后,90%以上的小鼠胚胎干细胞分化为nestin阳性神经前体细胞.移植到模型大鼠海马后神经前体细胞存活良好,EGFP荧光显示移植细胞呈集落生长,Cy3荧光显示大部分细胞分化为GFAP阳性细胞,移植区周围可见一定数量NF200阳性细胞,其中部分发出类似神经元的长突起.行为学结果显示移植大鼠记忆能力较对照组明显改善.结论 胚胎干细胞来源的神经前体细胞移植Aβ1-40损伤模型大鼠海马后能有效存活,大部分移植细胞分化为胶质细胞,小部分分化为神经元,细胞移植能改善模型大鼠学习记忆功能障碍.     

脊髓源神经干细胞向胆碱能神经元诱导分化的研究

目的 研究胚胎大鼠脊髓源性神经干细胞的培养和在体外骨髓基质细胞诱导其分化的情况。方法 从孕龄13d的胚胎大鼠脊髓组织中分离获得神经干细胞，采用含表皮生长因子（EGF）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的无血清限定性培养基培养，同时进行诱导分化，观测脊髓神经干细胞向胆碱能神经元分化的情况，用细胞免疫荧光化学方法鉴定分化结果。结果 可从胚胎脊髓中分离得到大量的神经于细胞，通过限定性培养基培养可获得于细胞球，经从骨髓基质细胞培养液中获得的限制性培养液在体外可被诱导分化，用细胞免疫荧光化学法鉴定，可见有胆碱能神经元生成。结论 胚胎大鼠脊髓神经干细胞在添加EGF与bFGF的限定性培养基中可以增殖并长期保持稳定的性状，在体外可以被诱导分化为胆碱能神经元。     

大鼠骨髓源神经干细胞的分离培养及鉴定

目的:对Wistar大鼠骨髓源神经干细胞进行分离、培养和鉴定,观察其生长方式和分化特征。方法:运用无血清培养基对Wistar大鼠骨髓基质细胞进行培养,对分离获得的悬浮生长的神经球采用免疫组织化学法检测CD133和Nestin表达情况。用血清诱导其分化,分化7 d后,采用免疫荧光细胞化学染色方法检测分化后GFAP、Map2、β-tubulinⅢ、Galc的表达情况。结果:大鼠骨髓基质细胞在无血清培养基中,呈悬浮状态生长,形成细胞球,经免疫荧光检测,细胞球呈CD133和Nestin阳性。将细胞球转入含血清培养基后,转为贴壁生长,经免疫荧光检测大部分已分化细胞呈GFAP阳性,少部分细胞呈MAP-2、β-tubulinⅢ及Galc阳性。结论:采用含bFGF、EGF的无血清培养基可培养出呈球状聚集生长、具多向分化潜能的大鼠骨髓源神经干细胞。     

神经干细胞的分离培养和鉴定

目的研究神经干细胞分离、培养和分化鉴定技术.方法从胚胎大鼠的大脑皮质、海马、纹状体等组织分离神经干细胞,用无血清培养技术在体外进行培养、扩增、传代和诱导分化.采用免疫荧光技术,鉴定神经干细胞和分化的神经细胞.结果从胚胎大鼠的大脑皮质、海马、纹状体等组织获得了大量神经干细胞,可自我增殖并分化成为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞.结论用上述方法分离培养的神经干细胞具有自我更新和增殖能力,并具有多向分化潜能.     

大鼠胚胎脊髓源性神经干细胞的培养和分化

目的探讨大鼠脊髓源性胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化,为进一步的实验研究提供基础。方法取孕14~16 d的SD大鼠胚胎脊髓在条件培养基中培养增殖传代分化,用神经干细胞特异性抗体—巢蛋白(Nestin)鉴定克隆细胞,用特异性的单克隆抗体鉴定克隆球诱导分化后的细胞。用Brdu免疫荧光对神经干细胞传代能力检测。结果获得了大量能自我增殖并分化的神经干细胞,分化后主要产生神经元特异性微管相关蛋白染色阳性的神经元质纤维酸性蛋白阳性的星型胶质细胞和少突胶质细胞三种神经组织细胞。Brdu免疫荧光显示神经球中绝大多数细胞为Brdu阳性细胞,其细胞核中可见荧光标记物。结论大鼠胚胎脊髓能分离、培养出神经干细胞,并能诱导分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶细胞。     

大鼠视网膜共培养诱导神经干细胞分化为视网膜神经节细胞

目的:研究新生大鼠视网膜组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养对干细胞分化的影响.方法:采用机械分离、无血清培养基选择培养的方法从孕14 d的胚鼠上丘中获取神经干细胞并传代培养.使用组织-细胞共培养系统将出生4 d的乳鼠视网膜组织与上丘源神经干细胞共培养,观察干细胞分化过程,对分化细胞进行鉴定,并与干细胞的自然分化过程进行比较.结果:从胚鼠上丘中获得的细胞在无血清培养条件下聚集呈球形悬浮生长,可以持续传代培养,具有多向分化能力,经免疫荧光鉴定证实为神经干细胞.新生大鼠视网膜组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养促进干细胞的分化,并诱导分化出Thy1.1阳性细胞.结论:从胚胎大鼠上丘可以分离培养神经干细胞,与新生鼠视网膜组织共培养可以诱导上丘源神经干细胞分化出视网膜神经节细胞.     

纤维连接蛋白在小鼠胚胎干细胞诱导为神经前体细胞中的作用

目的 观察采用ITSF和N2无血清培养基诱导小鼠胚胎干细胞为神经前体细胞的作用及纤维连接蛋白对神经诱导的影响。方法 小鼠胚胎干细胞的培养和无血清诱导为神经有体细胞，NBT／BCIP染色，Nestin免疫组化染色。结果 细菌培养皿法或悬滴法培养胚体，ITSF或N2无血清培养基均能将小鼠胚胎干细胞诱导为神经前体细胞。纤维连接蛋白预处理培养皿法表面，对胚体的贴壁情况影响不大，但能使无血清培养后存活的细胞增多。结论 小鼠胚胎干细胞在ITSF和N2培养基均能分化为神经前体细胞，在N2培养基中加入纤维连接有使存活的神经前体细胞数量增多。     

缺氧对体外培养的鼠胚神经干细胞分化的影响

目的分离大鼠胚胎皮质神经干细胞（NSCs）进行体外培养,探讨缺氧对体外培养的鼠胚大脑皮质神经干细胞分化的影响。方法对孕14d（E14d）大鼠取鼠胚脑皮质用无血清培养技术分离培养神经干细胞,血清：培养基贴壁诱导分化。通过免疫细胞化学染色检测细胞分化情况;NSCs采用三气培养箱予以不同缺氧干预,缺氧培养后再用10％胎牛血清培养基进行贴壁分化,用MAP2免疫荧光染色检测缺氧对NSCs向神经元方向分化的影响。结果①大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,分化后可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原;②缺氧干预实验中,5％O2组尤以72h组可诱导NSCs向神经元方向分化。结论从大鼠胚胎皮质可成功分离NSCs,缺氧可影响NSCs的分化,适度缺氧可诱导离体培养的大鼠脑皮质NSCs向神经元方向分化。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及分化研究

目的:研究大鼠胚胎神经干细胞体外分离、培养的条件及增殖、分化特性。方法:取胎龄15~17 d的SD大鼠胎脑海马及室周组织,在含碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF),表皮生长因子(EGF),B27、N2添加剂的无血清培养基中培养,用有限稀释法进行克隆、传代,免疫细胞化学法鉴定神经干细胞克隆球及诱导分化后的细胞。结果:大鼠胎脑能在体外培养获得大量神经干细胞,并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论:胚胎脑组织有丰富的神经干细胞,可在体外长期培养并保持干细胞特性,能分化为神经元、胶质细胞等终末细胞。     

表皮生长因子对大鼠胚胎神经干细胞增殖分化的影响

目的：建立神经干细胞分离、培养的技术方法，探讨表皮生长因子(EGF)对大鼠胚胎神经干细胞增殖、分化的影响。方法：从大鼠胚胎大脑组织中分离、培养神经干细胞，并用EGF和血清诱导其分化，采用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞增殖和分化的神经样细胞。结果：大鼠胚胎神经干细胞在无细胞因子和血清的培养基中无新生细胞形成，但能在EGF和血清的诱导下产生nestin和BrdU阳性细胞，细胞贴壁后分化为神经元和星形胶质样细胞。结论：EGF和血清能促进神经干细胞增殖，并诱导其向神经元样和星形胶质样细胞分化。     

胚胎干细胞源性与海马源性神经干细胞培养与分化的特性比较

【目的】探讨胚胎干细胞(ESCs)源性神经干细胞(NSCs)与海马源性NSCs的培养条件与分化特性,并进行比较研究。【方法】将拟胚体阶段视黄酸及视网膜Muler细胞诱导的ESCs和自60只BALB/c胎鼠海马组织分离的细胞(每次实验取10只),分别在NSCs选择性培养基中进行NSCs培养筛选,观察细胞形态变化,RT-PCR法检测Nestin基因表达,免疫细胞化学法检测Nestin等NSCs特异性标志物,对其分化后细胞检测Map2、Gap43、NF200、S100、GFAP神经组织细胞标志抗原,并对6次诱导结果进行观察比较。【结果】初级诱导的ESCs及海马细胞,在NSCs选择性培养基中培养,均形成大量呈Nestin抗原阳性,整合BrdU,表达Nestin基因的神经球样结构,且具有体外扩增传代及分化为神经元及神经胶质样细胞的能力。但ESCs源性NSCs增殖力更强,且分化细胞中NF200阳性细胞率42.1％±3.6％高于海马源性NSCs分化细胞中NF200阳性细胞率18.7％±5.1％,P<0.01。【结论】体外诱导可获得ESCs源性NSCs,与海马源性NSCs相比有更强的增殖力和向神经元分化的潜能,可作为干细胞移植治疗青光眼等神经变性疾病研究新的种子细胞。     

蒺藜皂苷诱导SD新生大鼠海马神经干细胞分化的实验研究

目的 探讨蒺藜皂苷对于诱导SD新生大鼠海马神经干细胞(neural stem cells, NSCs)分化的影响作用以及蒺藜皂苷培养液浓度变化对其的影响.方法 采用无血清和单克隆培养方法,将蒺藜皂苷加入离体的海马NSCs的培养液中,应用Nestin、BrdU、NF200、GFAP免疫荧光染色观察NSCs的形态及分化而来的神经元、神经胶质细胞形态,并检测由海马NSCs分化而来的细胞的数量.结果 海马NSCs在无血清培养下,可形成Nestin阳性细胞球.在诱导分化后,免疫荧光染色可见NF阳性细胞、GFAP阳性细胞,而其中20 mg/kg 蒺藜皂苷干预组海马NSCs向神经元的分化比例最高.结论 在蒺藜皂苷的作用下,海马NSCs向神经元分化的数量增多.     

小鼠胚胎干细胞体外诱导分化成GABA能神经元

目的探讨小鼠胚胎干细胞在体外培养向GABA能神经元定向诱导分化的可能性。方法将小鼠胚胎干细胞以"无血清"方法培养,用DMEM/F12、N2、B27及NT4作为诱导分化剂定向诱导分化,分化好的细胞利用免疫荧光技术、流式细胞技术和RT-PCR鉴定。结果在胚胎干细胞诱导分化成神经元后期,免疫荧光显示有GABA能神经元存在;RT-PCR结果证实有GABA能神经元正确分化的重要调控基因Viaat、Gad1和Gad2基因表达;流式细胞仪计数结果显示GABA阳性细胞约占总细胞数的(11.49±6.86)%。结论小鼠胚胎干细胞经体外培养可以定向诱导分化成GABA能神经元,可作为神经移植的新来源。     

神经干细胞的分离培养及超微结构研究

目的研究神经干细胞分离培养及其超微结构特征。方法从胚胎大鼠的大脑皮质、室管膜下区等神经组织分离神经干细胞，用无血清培养技术在体外进行培养、扩增和传代。采用免疫荧光技术，鉴定神经干细胞和分化的神经细胞，同时进行电镜结构观察。结果从胚胎大鼠的大脑皮质、室管膜下区等组织获得了大量神经干细胞，可自我增殖并多向分化。神经球表面呈微绒毛结构，内层细胞结合较为松散．可见凋亡小体。部分细胞分化为具有突起和轴突样结构的细胞。结论分离培养的神经干细胞具有自我增殖和多向分化潜能，并具有与功能相对应的超微形态结构。     

新生大鼠海马神经元的改良培养

探讨体外培养高纯度神经元的方法。方法：体外培养新生大鼠海马神经干细胞,再使神经干细胞在无血清N2添加剂培养基条件下向神经元方向分化。结果：从新生大鼠海马组织培养出的神经干细胞,表达巢蛋白,神经干细胞的分化细胞绝大部分表达MAP2,极少数几个细胞表达GFAP。结论：通过本实验方法可获得高纯度的神经元,为后续实验奠定基础。     

神经干细胞的分离培养和鉴定及体外长期培养

目的探索新生SD大鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及体外长期培养的方法。方法分离新生SD大鼠海马组织,用无血清培养技术培养神经干细胞,免疫组织化学荧光技术检测其巢蛋白(Nestin)的表达;并用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入试验,免疫荧光双标技术观测神经干细胞的增殖状况。诱导神经干细胞分化,分别用神经元特异性核抗原(NeuN)抗体、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体、2,3-环核苷酸磷酸二脂酶(CNPase)抗体进行免疫组织化学荧光染色鉴定分化细胞。结果获得大量未分化呈巢状悬浮生长的神经干细胞团,并能分化为神经元和神经胶质细胞,且经传代培养10代以上仍具干细胞特性。结论成功培养出胚胎大鼠神经干细胞,培养出的细胞具有增殖、自我更新及多潜能分化能力,可分化为神经元及神经胶质细胞并可作为神经干细胞移植实验研究的供体细胞。     

新生大鼠海马神经干细胞表达趋化因子受体CCR2的体外研究

目的 探讨趋化因子受体CCR2在体外培养神经干细胞的表达.方法 采用无血清方法分离、培养新生大鼠海马神经干细胞,细胞免疫荧光方法检测神经干细胞标志巢蛋白(nestin)表达及干细胞多向分化为神经元及胶质细胞的能力,通过细胞免疫荧光及RT-PCR的方法检测神经干细胞表达趋化因子受体CCR2的情况.结果 体外培养新生大鼠海马神经干细胞呈nestin阳性,可分化为NF200阳性神经元、GFAP阳性星形胶质细胞及CNP阳性少突胶质细胞,CCR2细胞免疫荧光及RT-PCR证实神经干细胞表达趋化因子受体CCR2.结论 新生大鼠海马神经干细胞表达趋化因子受体CCR2,为进一步研究其体内、外迁移提供理论依据.     

新生大鼠海马神经干细胞的离体培养及细胞连接的超微结构观察

目的观察体外培养的新生大鼠海马神经干细胞球的超微结构特点。方法取处于指数期的原代培养7d的新生大鼠海马神经干细胞,常规制备透射电镜样品后,用日立H-600透射电镜观察并摄片。结果光镜下神经干细胞呈克隆球散在悬浮于培养基中,Nestin免疫荧光阳性;电镜下观察到神经干细胞相互间排列比较松散、核浆比例高,细胞间胞膜增厚,形成特化的结构,有的胞膜上可见胞吞/胞吐小泡。结论体外培养的新生大鼠海马神经干细胞间的细胞连接有间隙连接样结构,并可出现胞吞/胞吐功能,提示细胞间可进行相互交流,传递化学递质或电兴奋活动。     

体外培养海马神经干细胞的分化及超微结构观察

目的：研究胎鼠海马神经干细胞（NPCs）体外培养方法、了解其分化及超微结构特点．方法：分离胎鼠海马NPCs,应用机械分离法将海马组织制成单细胞悬液,用含有bFGF和EGF的无血清培养基培养,传代后用含血清培养基促分化,免疫细胞化学方法对NPCs及其分化后的子代神经细胞进行鉴定,并在电镜下观察分化后细胞的形态结构特征．结果：海马NPCs在无血清培养基中悬浮成球,贴壁后,细胞逐渐从细胞球向周围迁移分化．体外培养胎鼠海马NPCs表达巢蛋白（nestin）,在体外可诱导分化产生分别表达Tuj-1和GFAP的神经细胞．电镜观察到分化后的神经细胞及突起相互间排列、具有各种细胞器结构,可见细胞间紧密连接,完整的突触结构．结论：采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的大鼠胚胎NPCs．