自制肝素亲和柱分离纯化载脂蛋白H及其抗体制备与鉴定

目的：自制肝素-琼脂糖6B亲和柱提纯人血清载脂蛋白H（apoH）,免疫制备多克隆抗体,为大量制备与进一步研究做准备。方法：利用间接还原胺化法制备亲和层析柱,并优化反应条件。运用高氯酸沉淀、离子交换及亲和层析从人血清中纯化抗原,制备兔源多克隆抗体。结果：自制亲和柱肝素结合量约5mg/g（介质体积）。纯化的抗原经SDS-PAGE鉴定分子量约50kD,无杂带;16种氨基酸组成分析结果与报道一致。多克隆抗体与购置的国外抗体一样,在进行ELISA与dot-ELISA时与小牛血清白蛋白有交叉反应;但在变性且还原的条件下,Western blot结果显示无交叉反应。结论：自制亲和柱成本低、亲和性好、肝素结合稳定,用之分离纯化得到了高纯度apoH;兔多克隆抗体用于检测血清中载脂蛋白H含量时需进一步纯化。     

人血清载脂蛋白H放射免疫分析试剂盒的研制

目的 :从人血浆中分离纯化载脂蛋白H(apolipoproteinH ,apoH) ,经免疫家兔 ,获得特异性抗血清 ,采用Iodogen法进行12 5I标记apoH ,建立了人血清apoH放射免疫分析 (RIA)方法。结果 :方法灵敏度为2 33mg/L ,工作范围 5～ 32 0mg/L ,批内和批间CV分别为 4 93和 4 0 1% ,回收率为 95 7% ,与apo -AI、apo-B未见交叉反应。测定了 91例正常人血清apoH含量 ,正常值 :男性为 2 30 17± 5 6 4mg/L ,女性为 2 0 0 2 7± 4 2 5mg/L ,男女两组之间血清apoH水平差异无显著性。     

人组蛋白H1基因的原核表达、纯化及其活性检测

目的:克隆人组蛋白H1全长编码区基因,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化以及活性检测.方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人组蛋白H1全长编码区基因,将其克隆到pGEX-KG载体中,在大肠杆菌Rossate中表达后,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化,以SDS-PAGE和Western blot鉴定表达与纯化产物.结果:从人乳腺文库中扩增获得约650 bp的DNA片段,并成功克隆至pGEX-KG载体上,经测序与目的序列完全一致;在Rossate菌中诱导表达出相对分子质量(Mr)约为52 000的目的蛋白,经纯化后获得了纯度较高的重组蛋白GST-H1,激酶实验证明该蛋白活性良好.结论:成功获得了活性良好的重组蛋白GST-H1,为后续研究细胞周期蛋白调控奠定了实验基础.     

人甲状腺球蛋白的纯化和鉴定

新鲜甲状腺组织经硫酸铵沉淀和两次ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００凝胶层析后，可获得较高纯度的甲状腺蛋白。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定，显示了３条区带，主带为１９Ｓ，另两条为２７Ｓ和１２Ｓ。经双向琼脂扩散和免疫电泳鉴定，提纯的甲状腺球蛋白未见血清蛋白质的污染。     

包虫抗原的免疫亲和层析纯化与鉴定

<正> 包虫(细粒棘球蚴Echinococcusgranulosus,Eg)囊液(CF)为包虫病最常用的免疫诊断抗原。在ELISA试验中,以粗囊液作为抗原,用量少则敏感性差;用量大却非特异反应重,故纯化包虫抗原显得尤为重要。我们以包虫病人血清Ig交联的免疫亲和层析法纯化包虫抗原,经ELISA及免疫印渍法与半饱和硫酸铵盐析纯化的EgCF抗原及粗EgCF抗原作对比,结果如下。     

联合火箭电泳法测定人血清apoA-1、apoB-100含量

<正> 载脂蛋白(apolipoprotein,apo)是脂蛋白中的蛋白质部分,在脂蛋白的运输和代谢过程中具有重要作用。apoA-1和apoB-100分别为HDL和LDL中的主要蛋白质,其定量测定已被用于评价动脉粥样硬化性疾病(AS)、监测AS治疗效果等方面。比较研究已证实,apoA-1/apoB-100比值在预测AS危险中最有价值。目前对apoA-1和apoB-100的定量测定已发展了各种免疫测定方法,诸如放免测定(Radioimmuno-assay,RIA),电免疫测定(Electroimmuno-assay,EIA,又称火箭电泳),圆周免疫扩散     

血清簇集蛋白、水通道蛋白4、载脂蛋白H与2型糖尿病患者认知功能障碍的相关性分析

目的探讨血清簇集蛋白(Clusterin)、水通道蛋白4(AQP4)、载脂蛋白H(ApoH)与2型糖尿病(T2DM)患者认知功能障碍的相关性。方法选取2016年1月至2018年1月期间的208例T2DM患者作为研究对象。根据蒙特利尔认知评估量表(MoCA)评分将T2DM患者分为认知功能障碍组(≤26分,n=121)和认知功能正常组(≥26分,n=87)。选取同期体检的健康人100例作为对照组。比较各组间基本资料、血清Clusterin、AQP4、ApoH水平,并进行Pearson相关分析与Logistic多元回归相关分析。结果三组间的性别比例、年龄、受教育年限、BMI、HDL-C等差异无统计学意义(P>0.05),认知功能障碍组糖尿病病程、FPG、HbAlc、TC、TG、LDL-C、ApoH、MoCA均显著高于认知功能正常组和对照组,Clusterin、AQP4显著低于认知功能正常组和对照组(P <0. 05)。认知功能正常组糖尿病病程、FPG、HbAlc、TC、TG、LDL-C、ApoH、MoCA均显著高于对照组,Clusterin、AQP4显著低于对照组(P<0.05)。随着T2DM患者认知功能障碍程度的加重,血清Clusterin、AQP4水平不断降低,ApoH不断提高(P <0.05)。经过Pearson相关性分析,Clusterin、AQP4与T2DM患者MoCA评分均呈正相关,ApoH与其呈负相关(P<0.05),ApoH与T2DM患者Clusterin、AQP4均呈负相关(P<0.05)。经过Logistic多元逐步回归分析,Clusterin、AQP4是T2DM患者发生认知功能障碍的保护因素,ApoH是其独立危险因素。结论 Clusterin、AQP4、ApoH均与T2DM患者认知功能障碍有密切关系,对T2DM患者认知功能障碍的早期发现和预防有重要临床意义。     

人中性粒细胞防御素的分离纯化

从人中性粒细胞分离胞浆颗粒,以5%乙酸从中提取酸溶性组分,经SephadexG100及Bio-gel P10凝胶过滤层析后获得纯化的人中性粒细胞防御素(HNP)。纯化的HNP经AU-PAGE分析不含杂质蛋白区带,SDS—PAGE分析为一条分子量约3 000的带。氨基酸组成分析表明,在被检测的17种氨基酸中,HNP含12种,各种氨基酸残基的推算数与文献报道氨基酸序列分析结果一致。HNP在体外实验中表现较强杀白色念珠菌活性,在浓度为100μg/ml时,白色珠菌死亡率近90%。     

人载脂蛋白A-I表达上调剂的发现与活性研究

目的筛选上调人载脂蛋白A-I(ApoA-I)基因表达的新型活性化合物,并在表达和功能水平对其作用进行研究。方法利用人ApoA-I基因表达上调剂筛选模型对化合物库进行筛选;对发现的活性化合物在ApoA-I启动子水平进行量效关系研究;利用实时荧光定量RT-PCR检测ApoA-I mRNA的表达水平;利用Western blot、ELISA和流式细胞技术检测ApoA-I的蛋白表达;利用胆固醇流出试验检测ApoA-I介导的巨噬细胞胆固醇外流的情况。结果从20 000样次化合物筛选中得到活性化合物5238B-69,在一定浓度范围内存在转录调控活性的量-效关系,当化合物浓度为0.30μg/ml时,上调ApoA-I表达活性达到最高值(408%),EC50为0.01μg/ml。5238B-69能显著上调HepG2细胞中ApoA-I mRNA的水平;同时,Western blot结果显示5238B-69能增加HepG2细胞ApoA-I蛋白的表达。ELISA结果显示,与对照相比,5238B-69作用48 h时,胞外ApoA-I水平增加了48%,流式细胞检测表明,5238B-69作用24 h后,胞内ApoA-I蛋白水平增加了21.4%。功能分析试验显示,5238B-69作用HepG2细胞上调生成的ApoA-I,能促进巨噬细胞RAW264.7内[3H]标记的胆固醇的流出。结论得到一个具有上调ApoA-I表达的活性化合物,在提高ApoA-I表达水平和生物学功能方面均有明显的效果。     

Quantitative Determination of Human Plasma Apolipoprotein A-II by a Non Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Abstract

A noncompetitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for apolipoprotein A-II (ApoA-II) was developed. Microtiter plates were coated with affinity purified antibodies to ApoA-II. After incubation with human plasma, the amount of ApoA-II bound to the coated plate was determined with peroxidase-labeled antibodies to ApoA-II. When pure ApoA-II or delipidated reference plasma was used as standard, a single step delipidation was required in order to unmask some antigenic sites of ApoA-II. However, the understimated ApoA-II values in untreated samples were shown to be corrected by using intact reference plasma as secondary standard. The average concentration of ApoA-II in normolipidemic plasma was 0,376 g/1.     

rHBsAg结合载脂蛋白H的机理研究

用酶免疫测定、配体印迹、酶水解、化学修饰等方法研究ｒＨＢｓＡｇ结合ａｐｏＨ的机理。实验结果表明，ｒＨＢｓＡｇ结合ａｐｏＨ是不依赖于Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋等二价阳离子的，其最适ｐＨ在６．５～８．０。切除ａｐｏＨ上的神经氨酸和Ｎ－糖苷键，ａｐｏＨ结合力无变化，说明糖基不是ａｐｏＨ结合ｒＨＢｓＡｇ所必需的。化学修饰ａｐｏＨ的精氨酸残基对ａｐｏＨ的结合力无影响。然而，修饰其中几个赖氨酸残基即可减弱直至完全破坏ａｐｏＨ的结合力，说明赖氨酸残基与ａｐｏＨ结合ｒＨＢｓＡｇ有关。由于ａｐｏＨ与脂蛋白，特别是ＣＭ和ＨＤＬ结合，ＨＢＶ有可能通过ａｐｏＨ，结合ＣＭ、ＨＤＬ等，在脂蛋白代谢过程中进入肝细胞。     

人脐带血血红蛋白的分离纯化与病毒灭活研究

建立了一套通过热敏法分离纯化及病毒灭活人脐带血血红蛋白的工艺。对该工艺条件的优化。使得纯化血红蛋白产品纯度及回收率等得到提升，并建立了一套较为完善的纯化血红蛋白质量检测指标。与现有的纯化方式相比。热敏法操作简便。仪器设备造价低廉。纯化与病毒灭活同时进行，得到的纯化产品损失少，纯度高。各项理化指标达到国际水平。为规模制备纯化及病毒灭活的血红蛋白以及血液代用品的研发创造了有利条件。     

人肿瘤抑素相关T21RGD肽的表达与纯化

目的 构建引入RGD序列人肿瘤抑素相关21肽（T21RGD）―内含肽―几丁质结合蛋白融合表达载体，实现目的肽的几丁质珠亲和层析一步纯化。方法 人工设计合成T21RGD肽基因， 经重组定向克隆插入到原核表达载体pTYB2，酶切和测序鉴定正确后转化入大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导其融合表达，对表达蛋白进行几丁质珠亲和层析，DTT诱导柱上裂解以获得T21RGD肽。经Trcine-SDS-PAGE和反相高效液相色谱(RP-HPLC)对纯化产物进行鉴定。结果 质粒酶切和测序结果显示，含T21RGD肽基因按正确方向和序列插入质粒,融合蛋白表达量达菌体蛋白总量的50％以上，Trcine-SDS-PAGE显示了T21RGD肽目的条带与预期相符，反相高效液相色谱测定峰纯度达97％。结论 成功构建T21RGD肽融合表达载体，实现了融合蛋白在大肠杆菌中高效表达和T21RGD肽几丁质珠亲和层析一步纯化，为进一步研究T21RGD肽抗肿瘤活性和作用机理奠定基础。     

大鼠胚胎神经干细胞的纯化、诱导分化及鉴定

探讨胚胎神经干细胞 (Neural stem cell,NSCs)的体外纯化扩增、保存标记、诱导分化及其鉴定方法。将14 .5 d胎龄大鼠大脑额叶皮质 NSCs在无血清 DMEM/ F12 (含 2 0 ng/ ml b FGF,2 0 ng/ m l EGF及 B2 7辅助培养液 )培养 ,利用有限稀释法将悬浮生长的单个细胞所形成的克隆球挑选出来、通过亚克隆连续传代大量扩增而纯化 ,免疫组化鉴定 nestin抗原阳性 ;选取部分 NSCs冻存、复苏后 nestin抗原阳性 ;用 Brd U孵育 NSCs,被 Brd U标记的 NSCs及其血清诱导分化后仍均呈 Brd U阳性。用血清或饲养层诱导 NSCs分化为大量表达 Tubulin- (神经元特异性抗原微管蛋白 3)阳性的神经元和 GFAP(神经胶质纤维酸性蛋白 )阳性的神经胶质细胞。由该实验可知有限稀释单细胞克隆连续传代是分离纯化、大量扩增胚胎期大脑 NSCs的简单有效方法。饲养层细胞也能诱导 NSCs分化为神经细胞。 Brd U可标记、示踪神经系统疾病动物模型 NSCs的实验治疗。掌握 NSCs的体外纯化培养、保存标记、诱导分化及鉴定方法可为进一步研究 NSCs的生物学特性及神经系统疾病的治疗提供新方法。