慢病毒载体及其在肿瘤基因治疗中的研究应用

慢病毒载体（LV）是逆转录病毒载体中的特殊成员,已成为当前基因治疗载体研究的热点。研究表明LV可使目的基因稳定表达于肿瘤细胞,在消化系统、血液系统及妇科肿瘤等基因治疗中作为转运工具发挥了重要作用,为肿瘤基因治疗提供了新途径。     

腺病毒E1A基因高效真核表达载体的构建与鉴定

目的构建真核高效表达该基因的载体,为进一步探讨运用高效表达Ｅ１Ａ的重组质粒进行肿瘤基因治疗及研究Ｅ１Ａ基因的作用机理和与其他基因的相互作用提供方法。方法运用分子克隆技术构建２套用较强启动子驱动的表达Ｅ１Ａ的真核重组质粒,并用多种限制性内切酶和ＤＮＡ测序对重组质粒进行鉴定。结果构建的重组质粒分别含有１．３４ｋｂ和１．７７ｋｂＥ１Ａ片段,分别命名为ｐＥ１Ａ１和ｐＥ１Ａ２,且插入的方向均为正向,无重排等异常现象,核苷酸序列无误。结论为人腺病毒５型（Ａｄ５）Ｅ１Ａ基因实验性抗肿瘤基因治疗包括放射增敏研究提供方法学及资料。     

MTS1基因异常与肿瘤

近年来，随着分子生物学的发展，抑癌基因成为继癌基因之后的又一研究热点。迄今，已发现10余种的抑癌基因，其中新发现的多肿瘤抑制基因（MultipleTumorSuppressor1，MTS1）颇为引人注目，该基因又称CD－KN2、P16或P16INK4A基因，已证实与多种人类肿瘤的发生有关。本文就此做一综述如下。1结构与功能MTS1基因是1994年由美国犹他医学中心的Kamb等人首次报道的[1]。该基因定位于9P21，长约8．5kb，由3个外显子和2个内含子组成[2]。MTS1基因的蛋白产物为15．84kD的单链多肽，称P16，属5100家族的钙结合蛋白，含有一个由148个氨基酸…     

EB病毒BHRF1基因慢病毒载体的构建及功能鉴定

目的:构建并制备能够有效表达EB病毒BHRF1基因的重组慢病毒载体,观察BHRF1表达对人胚肺成纤维细胞(KMB17)凋亡的影响。方法:采用RT-PCR法,从B95-8细胞扩增EBV BHRF1基因,克隆至pWPI GW慢病毒载体上,与pVSVG及pSPAX质粒共转染人胚肾293T细胞,包装出重组慢病毒。将纯化后的重组慢病毒直接感染293T和KMB17细胞,荧光显微镜、实时定量RT-PCR、免疫印迹等方法检测BHRF1在细胞中的表达水平。流式细胞仪检测BHRF1表达对凋亡诱导剂或无血清培养诱发KMB17细胞凋亡的影响。结果:重组慢病毒介导BHRF1在293T和KMB17细胞内获得表达,能有效地抑制KMB17细胞的凋亡。结论:成功构建了表达BHRF1基因的重组慢病毒载体。     

外源性Egr—1基因表达对食管癌细胞株Eca109细胞生长的影响

目的：检测Egr-1蛋白在食管癌细胞株Eca109中的表达。方法：采用免疫细胞化学检测Egr-1蛋白在Eca109细胞中的表达,用脂质体基因转染法将真核表达载体PCMV－Egr-1质粒导入Eca109细胞,经Western blot和免疫细胞化学检测Egr-1蛋白在转染的Eca109细胞中呈高表达。结果Eca109细胞的Egr-1蛋白表达阴性,当导入外源性Egr-1基因后,Egr-1捕达阳性,表达Egr-1蛋白的Eca109的细胞形态上发生明显的的变化,表现为细胞变偏,呈散在生长,结论Egr-1蛋白的表达在一定程度上能抑制Eca109细胞生长。     

人NIT1基因原核表达载体的构建和鉴定

背景与目的目前已知FHIT基因为抑癌基因，其结构和功能的异常与肺癌的发生、发展有密切关系，而且可能与NIT1基因存在功能上的相关性。但是．FHIT基因与NIT1基因调控肺癌发生发展的分子机制尚未明了。本研究旨在构建人NIT1基因原核表达载体．为进一步研究人肺癌细胞株中NIT1基因和FHIT基因的关系打下基础。方法应用RT—PCR法获得NIT1基因cDNA．定向克隆到融合表达载体pET-32a中．作双酶切和测序鉴定。结果①克隆的cDNA片断包含了人NIT1基因翻译区的全部序列，翻译区序列与GenBank登录的人NIT1 cDNA序列完全一致。②对构建的原核表达载体做双酶切．获得了预期的目的条带。结论通过RT—PCR和定向克隆的方法．成功构建了人NIT1基因的原核表达载体，为研究人NIT1蛋白的表达和进一步研究人肺癌细胞中NIT1基因和抑癌基因FHIT的关系奠定了基础。     

携带靶向沉默LSD1基因表达shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建慢病毒干扰LSD1表达的载体并鉴定。方法:设计并合成3对针对LSD1基因的shRNA链,退火形成双链,与酶切的质粒连接,转化DH5a菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。脂质体法转染人胃癌MKN-28细胞,通过荧光倒置显微镜判定转染效率,并通过real time-PCR法检测细胞中LSD1基因的表达水平。结果:经酶切鉴定筛选出的重组质粒测序结果与目的序列相同,重组质粒构建成功;转染胃癌MKN-28细胞后,LSD1基因在mRNA水平的表达降低。结论:成功构建了靶向LSD1基因的shRNA慢病毒载体,并筛选出1种对LSD1基因有显著抑制作用的shRNA。     

KAI1基因对乳腺癌细胞体外增殖的抑制作用

目的研究KAI1基因对乳腺癌细胞体外增殖的抑制作用。方法应用脂质体法将pCMV-KAI1质粒转染人高转移性人乳腺癌细胞株MDA-MB-231中,免疫印迹方法检测蛋白表达;利用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、平板克隆形成实验、体外黏附及侵袭力实验判断细胞增殖能力及黏附、侵袭力的变化。流式细胞术检测细胞生长周期的变化。结果获得了稳定表达KAI1基因的MDA- MB-231乳腺癌细胞克隆。MTT法显示,转染KAI1基因组的集落形成率(25.33%±2.36%)较转染前(43.17%±2.75%)明显降低(P<0.05)。体外黏附及侵袭力实验表明,转染组的细胞黏附侵袭能力低于未转染组和转染空载体组(P<0.05)。流式细胞术显示,转染KAI1后,G_0/G_1期细胞数量增高,从36.78%±0.61%升高至64.00%±7.56%;G_2/M期数量降低,由17.88%±0.76%降至7.63%±0.60%,差异有统计学意义。结论KAI1基因可以抑制乳腺癌细胞的增殖黏附和侵袭能力,并可能通过调节细胞周期来影响细胞的增殖。     

腺相关病毒载体介导外源基因导入人外周血干细胞的研究

目的：观察腺相关病毒载体介导外源基因导入人外周血干细胞的转染效率及表达。方法：本文采用腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）载体介导的基因转移方法，将绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因和人多药耐药基因（multi-drug resitance,MDR1）导入人外周造血干／祖细胞，并对转染效率和转基因造血细胞的耐药性进行了初步研究。结果：rAAV/GFP感染CD34阳性细胞后，在荧光显微镜下观察，约30％细胞中可见绿色荧光。将rAAV/MDR1重组病毒感染CD34阳性细胞，经PCR和MTT法证实，导入MDR1基因的CD34阳性细胞对秋水仙素的耐药性与未导入MDR1基因的细胞有明显差异。结论：腺相关病毒载体能有效地将外源基因导入外周血CD34阳性细胞，并可在其中有效地表达。     

Egr-1启动的融合肿瘤治疗基因研究进展

目前,一种新的提高恶性肿瘤基因治疗特异性的方法是应用放射线诱导的早期生长反应基因-1（Egr-1）启动子来启动治疗基因的表达。现就近几年来放射诱导Egr-1启动子启动下游目的基因的表达在恶性肿瘤治疗方面的研究进展作一综述。     

ILK基因RNAi慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的:进一步研究整合素连接激酶(ILK)的功能,构建ILK基因RNAi慢病毒载体,并对其在肺腺癌A549细胞株中干扰效率进行鉴定.方法:针对ILK基因RNAi有效靶序列,合成4对oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI酶切的质粒pGCSIL-GFP载体连接产生shILK-LV慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定,用shILKi-LV载体、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293 T细胞,包装产生慢病毒,以293 T细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达水平测定病毒滴度.获得重组慢病毒后感染人肺癌A549细胞,荧光显微镜观察GFP及Real-time PCR检测ILK在A549细胞中的表达.结果:PCR扩增出插入片段,测序证实成功构建了ILK-shRNA慢病毒载体shILKi-LV.包装并浓缩慢病毒,滴度分别为6×108、6×108、5×108和4×108 pfu/mL;将病毒感染A549细胞,荧光显微镜下观察80％细胞表达绿色荧光,Real-time PCR检测ILK mRNA表达明显下降,其中染shILKFKD-1的A549细胞中ILK2-△△Ct值为0.058,shILKi-KD-2、3和4的ILK2-△△Ct值分别为0.162、0.072和0.119,尤以ILKsiRNA-1抑制最明显.结论:成功构建shILKi-LV病毒载体并建立了A549-shILKi细胞模型,为ILK在肺癌信号转导通路中的研究提供了工作基础.     

维甲酸诱导基因G慢病毒表达载体的构建及对肺癌细胞A549的影响

背景与目的：维甲酸诱导基因G(retinoic acid-induced gene G,RIG-G)是从急性早幼粒细胞性白血病细胞系NB4细胞中克隆出的肿瘤抑制基因。我们通过调控基因(Tet-on)系统构建受强力霉素(doxycycline,DOX)诱导RIG-G基因表达的A549细胞系,并观察其对A549细胞增殖的作用。方法：采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术扩增RIG-G基因片段,利用LR重组系统构建pLenti6/TO/V5-GIM-RIG-G慢病毒载体,对该慢病毒载体和Tet-on慢病毒载体包装和病毒滴度测定后,感染A549细胞;采用有限稀释法筛选稳定株;使用细胞免疫荧光和蛋白［质］印迹法(Western blot)鉴定RIG-G基因受DOX调控表达的效果;CCK-8试验检测细胞增殖能力。结果：成功构建pLenti6/TO/V5-GIM-RIG-G慢病毒载体,包装后测得其活性滴度为1.0×10⁸ TU/mL;慢病毒经Tet-on包装后物理滴度为4×10⁹ VP/mL;RIG-G蛋白成功地在慢病毒感染后的A549稳定株中合成和表达,并且受DOX的诱导调控。RIG-G蛋白表达成功后,A549细胞的增殖与对照组相比显著降低(1.168±0.107 vs 2.099±0.162,P<0.05)。结论：本研究成功建立了RIG-G基因可调控表达的A549稳定株;RIG-G蛋白对A549的增殖有抑制作用。     

GM-CSF基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建人粒细胞 巨噬细胞集落刺 激因子(GM CSF)基因的重组腺病毒载体,为进 一步研究GM CSF基因在肿瘤基因治疗中的应 用提供实验基础。方法:采用PCR方法,从重 组质粒pcDNA3.1 GM CSF扩增出GM CSF 基因片段,通过穿梭质粒pShuttle,将带有CMV 启动子的目的片段克隆入Adeno X腺病毒 DNA中,获得重组腺病毒DNA,通过脂质体转 染HEK293细胞,经包装扩增后,获得重组腺 病毒Adeno X GM CSF,PCR鉴定,ELISA法 检测表达产物。结果:含GM CSF基因的重组 腺病毒Adeno X GM CSF构建成功,经PCR鉴 定和DNA测序等证实了其正确性,重组腺病毒 上清液中GM CSF表达量达26ng/mL。结论: 含GM CSF基因的重组腺病毒构建成功。     

GM-CSF基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因的重组腺病毒载体，为进一步研究GM-CSF基因在肿瘤基因治疗中的应用提供实验基础。方法：采用PCR方法，从重组质粒pcDNA3．1-GM-CSF扩增出GM-CSF基因片段，通过穿梭质粒pShuttle，将带有CMV启动子的目的片段克隆入Adeno-X腺病毒DNA中，获得重组腺病毒DNA，通过脂质体转染HEK293细胞，经包装扩增后，获得重组腺病毒Adeno-X-GM-CSF，PCR鉴定，ELISA法检测表达产物。结果：含GM-CSF基因的重组腺病毒Adeno-X-GM-CSF构建成功，经PCR鉴定和DNA测序等证实了其正确性，重组腺病毒上清液中GM-CSF表达量达26ng／mL。结论：含GM-CSF基因的重组腺病毒构建成功。     

雌激素受体ERbeta的克隆及重组慢病毒表达载体的构建

目的：构建含人雌激素受体ERbeta基因的重组慢病毒表达载体,为以ERbeta为干预靶点的乳腺癌相关研究奠定基础。方法：经RT-PCR扩增ERbeta基因片段,并将其连接到入门载体pENTRTM3C,然后经LR重组转入到慢病毒表达载体pLenti/V5-DEST中,进而构建含ERbeta基因的慢病毒载体,并进行基因测序鉴定和PCR鉴定。结果：pLenti-ERbeta表达载体测序结果与GenBank中ERbeta基因序列一致,并且其经PCR可扩增出ERbeta基因片段。结论：成功构建携带人ERbeta基因的重组慢病毒表达载体。     

前列腺特异抗原3慢病毒表达载体的构建与包装

背景与目的：前列腺癌抗原3(prostate cancer antigen 3,PCA3)作为一种长链非编码RNA(lncRNA)已被证实在前列腺癌中高度特异性表达,暗示其可能在前列腺癌中发挥重要作用,为深入研究,我们将完整的PCA3基因转入真核表达载体,并构建慢病毒包装系统。方法：从前列腺癌细胞株LNCaP细胞中提取总RNA,运用重叠延伸方法扩增到PCA3基因,测序正确后定向接入真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP,酶切鉴定并测序正确后进行慢病毒包装和滴度测定。结果：经PCR鉴定及测序,PCA3表达质粒序列与Gene Bank序列进行Blast比对分析,同源性为99.8%,PCA3慢病毒滴度测定为2×108。结论：PCA3成功插入真核表达载体并完成了慢病毒包装,为深入研究PCA3基因在前列腺细胞中的作用奠定了基础,进而为探索前列腺癌的治疗提供了新的途径。     

针对前列腺癌的PSMA-CAR慢病毒表达载体的构建及病毒包装

目的:构建针对前列腺特异性膜抗原（PSMA）的CAR慢病毒表达载体,并包装病毒颗粒。方法:设计并合成针对PSMA的CAR基因序列,将设计的CAR 片段连入 pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-puro 载体中,经酶切、PCR及测序鉴定构建是否成功。应用慢病毒三质粒包装系统将PSMA-CAR载体进行包装,通过荧光显微镜观察及流式细胞仪检测GFP鉴定包装结果及包装时的转染效率。通过超速离心方法浓缩病毒颗粒。结果:成功构建了PSMA-CAR 慢病毒表达载体,成功包装了PSMA-CAR 慢病毒颗粒且包装时的转染效率为70.43％,经测定获得的PSMA-CAR慢病毒滴度为5×105TU/mL。结论:PSMA-CAR 慢病毒表达载体的成功构建及病毒颗粒的包装为应用 CAR 技术治疗前列腺癌奠定了基础。     

MDR1启动子/荧光素酶质粒的构建及其在朊蛋白高表达胃癌细胞中的活性检测

目的:构建含MDR1基因启动子的荧光素酶报告基因质粒,并检测其在朊蛋白高表达胃癌细胞系中的活性表达。方法:PCR克隆人MDRl基因启动子片段,通过亚克隆将启动子分别插入到pMD18-T载体和荧光素酶报告基因pGL3-Enhancer载体中,建立含MDR1启动子的荧光素酶报告基因质粒pGL-MDR1,并经测序及酶切确定扩增序列;脂质体基因转染法将pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系SGC7901-PrP,并测定其荧光素酶活性。结果:PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确,pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系的荧光素酶活性,较转染入pcDNA3.1空载体细胞系相比升高3~5倍。结论:成功构建含MDRl启动子的荧光素酶报告基因质粒;上调朊蛋白表达可激活MDR1的转录活性。     

小鼠DOC-1R反义重组载体的构建及表达的研究

背景与目的：DOC－1R（deleted in oral cancer-1 related）基因是一个候选的抑癌基因,它与CDK2特异性结合后,抑制CDK2与cyclin形成复合物,进而对细胞周期进行调控。本研究拟构建DOC－1R反义重组质粒,并研究该基因表达受到抑制后对正常细胞增殖产生的影响。方法：小鼠DOC－1R基因筛选后构建pcDNA3-DOC-1R反义重组质粒,经细胞转染,通过细胞增殖能力测定、软琼脂培养观察DOC－1R对细胞生长状态的影响。结果：小鼠DOC－1R基因转染的NIH3T3细胞较空载体转染的细胞生长速度有较明显的差异。正义重组体pcDNA3-DOC-1R^ 可明显抑制细胞增殖,而反义重组体pcDNA3-DOC-1R^-则促进细胞的增殖。在软琼脂培养中,正义重组体在软琼脂培养基中成集落能力下降,一方面克隆形成率下降,另一方面形成的集落也普遍较小;而反义重组体明显增加了成集落能力,克隆形成率也较正义重组体有明显的增加。结论：小鼠DOC－1R基因可明显抑制细胞的生长速度和成集落能力,这一作用有助于进行正常细胞生长、增殖规律和肿瘤治疗、预防方面的研究。     

靶向人类WT1基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的 制备编码人类WT1基因的shRNA(short hairpin RNA)质粒表达载体.方法 设计合成WT1shRNA的DNA模板单链,在两端加入限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ的酶切位点,退火形成双链,质粒pGenesil-1的BamH Ⅰ+HindⅢ双酶切线性化,稀释退火片段与线性化Pgenesil-1质粒表达载体经T4DNA连接酶连接,酶切、测序鉴定.结果 经酶切、测序鉴定,pWT1shRNA构建成功.结论 成功构建了针对人类WT1基因的shRNA质粒表达载体,为探讨WT1的生物学功能及白血病的基因治疗奠定了基础.