桑树耐盐性研究进展

从盐胁迫对桑树叶片光合特性、膜透性、抗氧化酶活性、渗透调节物质、养分吸收及种子萌发和幼苗生长等几个方面的影响进行分析总结,并阐述了缓解桑树盐害的途径,为全面研究桑树的抗盐机理及进一步的抗盐育种奠定基础。     

6个桑树品种的耐盐性鉴定试验

种植耐盐性强的桑树品种是土壤盐渍化地区生态修复的技术途径之一.选择桂桑优12、桂桑优62、抗青283×抗青10、桂桑5号、桂桑6号、桑特优2号共6个桑树品种的实生苗供试,将供试桑苗种植于质量浓度分别为0 g/L(CK)、2 g/L、4 g/L、6 g/L的NaCl溶液中,在历时28 d的盐胁迫试验期,每隔7d测定和统计各处理组桑苗的枝高、叶片数量、最大叶长、最大叶宽、受害叶片数量和枯死植株数量等,初步评价供试桑品种实生苗对盐胁迫的耐受能力.结果表明:在不同浓度盐胁迫处理组桑苗生长均较好的桑树品种是桂桑优12和桑特优2号;桑苗受盐害指数和死亡率最低的桑树品种均是桂桑优12.试验结果提示,6个供试桑树品种中桂桑优12是耐盐性最强的品种.     

ACC氧化酶基因在桑树水分和盐胁迫条件下的表达研究

为从分子水平上理解桑树在逆境胁迫中的应答机制,研究利用简并引物和RACE方法克隆了桑树氨基环丙烷羧酸(ACC)氧化酶基因部分序列,并初步分析了该基因在水分胁迫和盐胁迫下的表达模式。结果表明:克隆得到的桑树ACC氧化酶基因编码区与其它植物ACC氧化酶基因的同源性很高,与蔷薇科李属植物相似性高达85%~86%;该基因在水分胁迫下表达量增加,但个体之间表达量有差异,推测可能与个体抗旱性差异有关;在盐胁迫下,ACC氧化酶表达量变化不明显,同一桑树幼苗不同叶位之间有差异,推测是盐害引起组织死亡导致表达量发生变化,而非盐胁迫直接诱导,个体之间耐盐性的差异以及不同发育阶段的叶片对盐害的敏感程度不同,表达量变化也不同。     

3个实用桑树品种的耐盐性生理生化特征及耐盐害的能力评价

盐分胁迫会对植物的生理生化特性产生影响,通过测定植物在盐分胁迫下的生理生化指标,是评估其对盐害耐受能力的方法之一。以3个实用桑树(Morus L.)品种的绿枝扦插盆栽苗及其离体叶片为材料,分别用300 mmol/L Na Cl溶液进行盐胁迫处理,观察与测定3个品种的扦插苗在盐胁迫下的叶片形态、渗透调节物质含量和抗氧化酶活性。盐胁迫处理后3个品种扦插苗叶片的失绿程度从小到大依次为大10、金10、育711号。测定盐胁迫处理后4 d 3个品种扦插苗根、皮、叶中的渗透调节物质含量和抗氧化酶活性均存在显著差异:3个品种的根、皮和叶中的脯氨酸(Pro)含量均升高,且育711号和金10的增幅显著高于大10;育711号的皮和叶中的可溶性蛋白含量最高,金10最低,而在根中的可溶性蛋白含量则是金10最高,大10最低;育711号叶中的超氧化物歧化酶(SOD)活性极显著高于金10和大10,而大10根和皮中的SOD活性相对较低;育711号和金10根中的过氧化物酶(POD)活性显著高于大10,而大10叶中POD具有较高的活性;育711号根中的丙二醛(MDA)含量增幅显著高于金10和大10。研究结果表明,在盐胁迫下,大10扦插苗根和叶中的渗透调节物质含量和抗氧化酶活性均较为稳定,叶圆片失绿程度最低,而育711号不同组织渗透调节物质的积累显著增加,抗氧化酶活性提高。据此评价3个桑树品种对盐害的耐受能力由高到低依次为大10、金10、育711号。     

桑树花青素合成酶(ANS)基因的克隆及在2种果色桑树中的表达特征

花青素合成酶(anthocyanidin synthase,ANS)是植物花青素生物合成途径末端的关键酶,催化无色花色素到有色花色素的转变。从广东桑品种粤椹大10中克隆得到一条ANS序列,其ORF为1 077 bp,编码358个氨基酸,预测蛋白质分子质量为41 kD,等电点为5.62,具有2-酮戊二酸双加氧酶的保守结构域。多重序列比对表明物种间的ANS序列高度保守,系统进化树中桑树ANS与芍药科、芸香科、葡萄科等植物的同源序列聚在一个类群上。RT-PCR检测桑树ANS在结紫色果的粤椹大10的幼叶和桑椹中特异性表达,并且随着果色加深其表达水平呈上升趋势,而在结白色果的桑品种珍珠白的幼叶和桑椹中检测不到ANS的表达,暗示桑树ANS在桑椹的颜色形成中起到重要作用。     

超表达桑树MaNHX1和拟南芥AVP1基因增强拟南芥耐盐性的研究

盐胁迫会严重影响作物的生长发育,培育和种植耐盐胁迫的作物品种有利于对盐渍化土地的开发利用。Na+/H+逆向转运蛋白基因(NHX)已被证实与作物的耐盐性有关。将克隆的桑树Ma NHX1基因和拟南芥焦磷酸酶基因AVP1分别转入拟南芥植株,筛选获得转基因株系MN和AV,并通过人工授粉杂交后筛选获得共表达2个基因的转基因拟南芥株系MNV,用于探究Ma NHX1和AVP1共表达增强植株耐盐性的机制,确证Ma NHX1基因在盐胁迫适应性调节中的功能。在200 mmol/L Na Cl胁迫条件下,共表达转基因拟南芥株系MNV与野生型植株相比,叶片中的叶绿素含量高出20.69%,含水率高出5.89%,脯氨酸含量高出28.42%,而丙二醛含量的增幅下降7.73%。研究结果表明:超表达耐盐性基因的转基因株系可以通过维持细胞膜稳定性、降低膜损伤和透性伤害等机制应对盐胁迫环境。     

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)诱导的桑树差异表达基因及功能分析

桑椹菌核病是影响桑椹产量和品质的主要病害,核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一种新发现的疑似桑椹菌核病的病原真菌。以果桑品种大10为供试材料,利用数字基因表达谱技术,筛选核盘菌侵染相关的差异表达基因(DEGs)并分析其功能与代谢途径。在感染和未感染核盘菌的桑树幼果样品之间检测到了显著差异表达基因1 226个(上调表达基因1 088个,下调表达基因138个),其中包含33类172个抗性相关基因,35类112个转录因子基因。生物信息学分析发现,显著差异表达基因显著富集于4个细胞组分(胞外区、细胞壁、外部封装结构、质外体)、6种分子功能(抗氧化活性、酶催化活性、酶调节活性、核酸结合转录因子活性、营养物质代谢、翻译调控活性等)和6个代谢通路(亚油酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、植物-病原互作、苯丙氨酸代谢、芳香族氨基酸生物合成、糖类次生代谢产物生物合成)。选取可能与桑树对核盘菌感染应答相关的Fbox等5个基因作为目的基因,进行实时荧光定量PCR检测验证,检测数据与RNA-seq表达谱的分析结果基本一致。研究结果为阐释桑树应答核盘菌侵染的分子机制积累了基础数据。     

桑树钙调素蛋白基因MCaM-3的克隆及序列分析与诱导表达

钙调素蛋白(calmodulin CaM)作为真核生物细胞内的多功能Ca2+结合蛋白,在调节植物的生长发育、环境适应性和抗逆性方面具有重要作用。利用桑树表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)克隆了一个编码桑树CaM基因的全长cDNA序列,命名为MCaM-3(GenBank登录号:GQ303247)。序列分析表明,MCaM-3全长951bp,存在143 bp的5′端非翻译序列(5′-UTR)和358 bp的3′端非翻译序列(3′-UTR),其开放读码框(ORF)长450bp,编码149个氨基酸,预测蛋白质分子质量为16.85 kD,等电点为3.95。用在线软件SMART分析显示,MCaM-3蛋白含有4个Ca2+结合基序(EFh)结构域,可以结合Ca2+。同源分析表明,CaM基因在桑树与拟南芥、杨树、大豆、小麦、水稻、玉米各物种间具有很高的保守性。基于桑树和其它19个物种CaM基因的系统进化分析表明,桑树与蓖麻、烟草、大黄、樱桃的亲缘关系较近。半定量RT-PCR检测表明,与正常生长环境相比,MCaM-3基因mRNA的转录水平在低温、干旱、盐胁迫条件下均显著提高,初步推测MCaM-3基因与桑树的抗逆性有一定关联。     

过量表达甘菊CBF1基因提高拟南芥抗旱耐盐能力

CBF是一类植物特异性、具有多种功能的转录因子。本研究将从甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)中分离的ClCBF1基因构建到植物表达载体pBI121上,并采用农杆菌介导的花序浸染法对拟南芥(Arabidopsis thaliana)进行遗传转化,共获得4个转基因株系经过抗性筛选和RT-PCR验证,对其中表达量较高的3个转基因株系进行研究,结果表明:在150mmol·L~(-1)甘露醇培养基中转基因拟南芥的种子萌发率和根长平均为野生型的2.0倍和1.2倍,在150mmol·L~(-1) NaCl培养基中转基因拟南芥种子萌发率和根长平均为野生型的1.1倍和1.4倍;在干旱和盐胁迫条件下,转基因拟南芥幼苗的成活率高于野生型,并且超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性显著高于野生型(P0.05),丙二醛(MDA)含量及相对电导率显著低于野生型植株(P0.05)。说明ClCBF1基因在拟南芥受到干旱和盐胁迫过程中发挥一定作用。     

草地早熟禾转CMO-BADH双基因和转CMO基因耐盐性分析

通过对非转基因草地早熟禾(Poa pratensis L.)、转CMO-BADH双基因草地早熟禾、转CMO基因草地早熟禾进行不同浓度的NaCl胁迫试验,测定其细胞膜的透性,丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、氧化氢酶(CAT)活性,评定各株系耐盐能力的强弱,同时还验证并比较了CMO-BADH双基因和CMO基因的耐盐性功能,为耐盐新品种的选育提供了理论依据。结果表明:所有株系的相对电导率、MDA含量均随盐浓度增加而增大,在NaCl胁迫下相对电导率和MDA含量的大小顺序为:非转基因株系>转CMO基因株系>转CMO-BADH双基因株系;在NaCl的胁迫下,各个株系的SOD活性、POD活性、CAT活性都有明显的提高,此3种指标的大小顺序为:转CMO-BADH双基因株系>转CMO基因株系>非转基因株系;综合考虑各个指标,各株系耐盐性强弱顺序为:转CMO-BADH双基因株系>转CMO基因株系>非转基因株系。     

转rstB基因苜蓿耐盐性评价(简报)

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)(以下简称苜蓿)是一种比较耐盐的豆科牧草,能在轻度盐碱地种植^[1]。rstB 基因来源于费氏中华根瘤菌耐盐菌株RT19,可使费氏中华根瘤菌盐敏感突变体RC33恢复耐盐性,推测该读码框编码的基因与渗透调节相关。rstB基因定位在细胞壁上,是一个分泌型蛋白,有在根部表达(或积累)的偏好性,属于细胞壁缔合蛋白类成员,可以提高植物的耐盐性^[2~6]。     

导入APX基因提高了普那菊苣植株的抗逆性

采用农杆菌介导的方法,把CaMV35S启动子驱动的来自棉花(Gossypium spp.)的抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)基因导入普那菊苣(Cichorium intybus L.cv.Puna)。结果表明:经过卡那霉素(Km)筛选和对抗性植株的PCR和Southern杂交分析,证明APX基因成功地整合到普那菊苣基因组中。转APX基因普那菊苣植株对NaCl和甘露醇胁迫表现出一定的抗性,在NaCl浓度为500mmol·L^-1、甘露醇浓度为30g·L^-1的条件下,转APX基因不定芽能够正常生根和生长,转基因植物叶片外植体能够形成愈伤组织和再生植株,而野生型植株不定芽不能正常生根、已生根幼苗不能正常成长,野生型植株叶片不能形成愈伤组织。     

荧光素酶基因在转化烟草中的表达

来源于萤火虫的荧光素酶结构基因与花椰菜花叶病毒35SRNA启动子以及胭脂碱合成酶DNA3’末端结构相拼接,构成一融合基因.通过叶盘感染法将该融合基因引入烟草叶盘,把选择诱导培养基上形成的愈伤组织转到选择分化培养基后能很快分化出芽点,继而长成完整的再生植株.对再生植株提取物发光试验表明,外源基因已整合到烟草细胞的核基因组上,并能在烟草中表达.带有这种融合基因的重组质粒pBC341具有KpnI、SstI等单一的酶切位点,因而也可作为常规的基因载体.     

桑树黄化型萎缩病植原体溶血素基因MDPH的克隆及生物信息学分析和原核表达

溶血素为细菌分泌的能够使细胞溶解的毒素,是病原菌重要的毒力因子。利用同源克隆技术得到桑树黄化型萎缩病植原体溶血素全长基因,命名为MDPH(GenBank登录号:HQ891118)。MDPH全长717 bp,编码238个氨基酸,预测蛋白质分子质量为27.3 kD,等电点为9.29,氨基酸序列与其它植原体中已分离的溶血素有很高的同源性。蛋白质序列结构预测表明:MDPH的二级结构中富含α-螺旋,其次为β-折叠和无规卷曲,而β-转角仅占5.46%。对蛋白质序列的理化特征预测表明:MDPH有多个亲水和疏水区域,且疏水性强于亲水性;易形成跨膜螺旋,具有7个显著跨膜结构区;蛋白的抗原性较强,不含有明显的信号肽序列,为非经典分泌蛋白。将MDPH的编码区插入原核表达载体pET30a(+),并转化到E.coli BL21中,经过IPTG诱导,MDPH在BL21菌株中成功表达。研究结果为深入探讨MDPH的功能及植原体的致病机制奠定了基础。     

水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因转化桑树获得转基因植株的初报

利用基因枪法将水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因 (OC)导入桑树组织 ,经抗性筛选和组织培养获得再生植株 ,通过对转基因植株的PCR Southern杂交及RNA点杂交等检测 ,证实OC基因转化桑树成功 ,为选育抗虫性桑树品种奠定了基础。     

转rstB基因苜蓿耐盐性初评(简报)

rstB基因来源于费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)耐盐菌株RT19。该基因可以使费氏中华根瘤菌盐敏感突变体RC3-3恢复耐盐性,推测该读码框编码的基因与渗透调节相关,并命名为rstB^[1]。rstB基因核苷酸序列和蛋白序列在NCBI基因Bank上同源性比对分析结果显示,rstB基因编码一糖基/苷转移酶,属于糖基/苷转移酶第二家族成员(glycosyl transferase),该酶参与细胞壁的生物学功能,为多功能酶。糖基转移酶是糖基化过程的关键酶,它的表达和细胞周期密切相关。     

外源甜菜碱对桑树抗盐生理的影响及其作用机理的研究

为探讨提高桑树抗逆境反应的新途径,对桑树扦插幼苗叶面喷施甘氨酸甜菜碱,调查外源甜菜碱对桑树生长发育及抗盐生理的影响,测定不同处理条件下桑树体内的甜菜碱含量。试验结果表明:在盐胁迫条件下,叶面施用甜菜碱可以提高叶片中叶绿素、可溶性糖及脯氨酸的含量,并保持叶片适当含水率和K+/Na+离子平衡,减轻盐胁迫对桑树枝叶生长的抑制作用。盐胁迫或叶面喷施甜菜碱均可显著诱导桑叶和根部内源甜菜碱的合成与积累,表明桑树属于甜菜碱积累型植物,外源甜菜碱对桑树抗盐性的增强效应可能与甜菜碱积累及相关生理过程有关。     

外源甜菜碱对桑种子抗盐性效应的影响

为了探讨外源甘氨酸甜菜碱(Glycinebetaine,GB)对桑种子的抗盐效应,研究了GB对盐胁迫下桑种子萌发及幼苗生长的影响。试验结果表明:用10mmol/L的GB浸种能提高盐胁迫下种子的发芽率,增加幼苗叶片的叶绿素含量,保持叶片的适当含水量,并能造成幼苗体内游离脯氨酸的积累,减轻盐胁迫对细胞膜的伤害,促进盐胁迫下萌芽幼苗的生长发育。