乳链菌肽自身免疫基因nisI的表达对乳链菌肽产量的影响

【目的】通过基因工程手段增加乳链菌肽(nisin)自身免疫基因nisI在nisin产生菌Lactococcus lactisNZ9800/pHJ201中的表达水平,增强该菌对nisin的抗性,从而达到提高nisin产量的目的。【方法】将带有强组成型启动子P59的免疫基因nisI克隆到nisin表达质粒pHJ201上,将重组质粒引入L.lactis NZ9800中,使nisI基因过量表达,得到重组菌株L.lactis NZ9800/pHMI,并比较该重组菌株与对照菌株L.lactis NZ9800/pHJ201的生长曲线、对nisin的抗性水平、抑菌活性及nisin产量的差异。【结果】nisI的表达对重组菌的生长速度没有明显的影响,却能促使重组菌株对nisin的抗性水平提高25%、在发酵6h和8h时,nisin的产量分别提高32%和25%。【结论】增加乳链菌肽自身免疫基因nisI的表达可以提高产生菌对nisin的抗性,从而提高乳链菌肽产量。     

大肠杆菌重组乳链菌肽抗性蛋白(NSR)的表达纯化及其功能分析

乳链菌肽(Nisin)是由某些乳酸菌产生的一种阳离子抗菌肽, 而Nisin抗性蛋白(Nisin resistance protein, NSR)的表达则使一些非 Nisin产生菌获得Nisin抗性。为深入探索NSR的作用机制, 本研究在大肠杆菌中表达了去除N末端38个氨基酸残基的NSR(NSRΔ38)与GST的融合蛋白GST-NSRΔ38。通过谷胱甘肽(GSH)亲和层析和GST标签的切除后, 得到纯化的NSRΔ38, 并测定了该蛋白可能的nisin降解活性。反应产物的抑菌活性测定结果表明被NSRΔ38作用     

通过定点突变提高乳链菌肽对热及pH的稳定性

【目的】通过定点突变技术改变乳链菌肽(nisin)特定位置氨基酸,获得性质改善的nisin突变体,为扩大其应用范围提供依据。【方法】在抑菌谱扩大的nisin单突变体M21K nisinZ的基础上,对M21K nisZ基因第29位丝氨酸密码子进行定点突变;将其克隆至乳酸菌表达载体pMG36e,并在Lactococcus lactis NZ9800中进行表达;双突变体M21K/S29K nisinZ经分离纯化后检测其在抑菌活性、抑菌谱和稳定性等方面的变化。【结果】与单突变体M21K nisinZ及野生型nisinZ(wild-type,WT)相比,双突变体M21K/S29K nisinZ对指示菌的抑菌活性虽有所下降,但其对温度及pH值的稳定性有显著提高。同时其抑菌谱与M21K nisinZ相同,可抑制革兰氏阴性菌,扩大了WT的抑菌谱。【结论】通过改变nisin分子特定位置的氨基酸可以改善nisin分子的理化性质,有可能得到应用范围更广的nisin品种。     

乳链菌肽细胞分子传感器的构建与应用

[背景]乳链菌肽主要是由乳酸乳球菌生产的一类多肽,对革兰氏阳性菌有抑菌作用,是目前联合国粮食及农业组织/世界卫生组织唯一批准使用的天然食品防腐剂.但是其产量低、缺乏简便高效的检测方法,限制了其研究和应用.[目的]构建一种可输出肉眼可见红色荧光的细胞分子传感器,以期能简单方便地检测样品中的乳链菌肽,同时应用该传感器筛选乳...     

绿色荧光蛋白(GFP)研究进展

源于多管水母属(Aequoria Victoria)等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)是一种极具潜力的标记物,该文对GFP的基础理论研究和应用研究进行了综述。     

啤酒花抗性机制的研究进展

酒花苦味酸是构成啤酒风味的重要组分,也是啤酒生产过程中的天然抑菌剂,酒花苦味酸通过降低pH梯度而抑制啤酒花敏感菌生长。研究发现,啤酒花抗性菌是通过膜上转运蛋白将酒花苦味酸泵出细胞外,以降低膜上的质子流速,维持了细胞内的pH梯度。结合近年来酒花抗性相关研究结果,讨论了细胞膜上酒花抗性相关组分与酒花抗性间的关系,提出了酒花抗性机制的模型。     

一个含有乳链菌肽抗性基因的乳酸乳球菌质粒pTS50的鉴定

在添加乳链菌肽、乳糖及溴甲酚紫的M1 7选择培养基上 ,从 1 97个新鲜牛奶样品中筛选到 3株乳链菌肽抗性菌株 ,PCR扩增证实它们都含有乳链菌肽抗性基因。菌种生理生化特性鉴定及特异性 1 6SrDNAPCR扩增产物的序列测定结果表明这 3株菌都属于乳酸乳球菌乳酸亚种。质粒转化实验发现乳酸乳球菌乳酸亚种TS 1 640中的乳链菌肽抗性基因位于一个约47kb的大质粒pTS50上。BamHI、EcoRI、HindⅢ、NcoI、PstⅠ酶切分析和Southern杂交 ,进一步将乳链菌肽抗性基因定位于pTS50的一个约 1 9kbEcoRI酶切片段中     

一株蛹拟青霉(Paecilomyces militaris )深层发酵产物中抗肿瘤活性物质分析

摘要： 【目的】初步搞清一株蛹拟青霉（Paecilomyces militaris ）菌株RCEF0927在发酵罐发酵条件下发酵液的抗中国仓鼠卵巢瘤（CHO）细胞活性及活性成分的具体组成。【方法】用刃天青（Resazurin）法测定样品对CHO细胞的抑制率;用高效液相色谱-高分辨质谱和活性测定联用的方法进行活性成分分析和鉴定。【结果】活性测定结果表明菌株RCEF0927经发酵罐发酵的发酵液具有较强的抗CHO细胞活性;提取实验结果表明抗肿瘤活性物质能较好地被乙酸乙酯提取出来;液相色谱-质谱-活性测定分析表明     

狄斯瓦螨对杀螨剂抗性机制的研究进展

狄斯瓦螨Varroa destructor是严重危害西方蜜蜂Apis mellifera的主要寄生螨之一,由于杀螨剂长期大量、单一和连续使用,狄斯瓦螨对杀螨剂的抗性发展日趋严重,探明狄斯瓦螨抗性机制对于治理狄斯瓦螨具有重要意义。狄斯瓦螨抗性形成受遗传因素、人为操作因素及其他生态因素的影响,其抗性机制与化学杀螨剂的种类有关,目前研究较多的是靶标不敏感性机制和解毒代谢增强机制,对拟除虫菊酯类杀螨剂抗性机制研究较为透彻,而对有机磷类和甲咪类杀螨剂抗性机制研究有限。本文基于文献,阐述了狄斯瓦螨对拟除虫菊酯类、有机磷类和甲咪类杀螨剂抗性机制的最新研究进展,讨论了抗性治理的最新研究成果及该领域未来的研究方向,以期为狄斯瓦螨有效治理、杀螨剂的安全有效使用及新型杀螨剂开发等研究提供参考。     

乙肝病毒感染对细胞基本自噬的影响

【目的】慢性乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染在肝硬化和肝癌的发生过程中起着重要的作用,通过研究HBV感染对细胞基本自噬的影响,为HBV感染诱发肝癌以及HBV的免疫逃逸机理研究提供新的思路。【方法】本研究利用乙肝病毒表达质粒瞬时或稳定转染不同肝细胞,通过计数绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein,GFP)聚集数目检测自噬小体形成,western blot检测LC3(microtubule-associated proteinlight chain 3,微管相关蛋白质轻链3)脂酰化和p62的降解,通过构建HBV B型和C型X蛋白(HBx)的表达质粒并瞬时转染肝癌细胞和正常肝细胞,对不同基因型X蛋白对细胞自噬的影响进行了分析。【结果】乙肝病毒感染后促进了LC3的脂酰化和p62的降解,增加了自噬小体的形成,增强了细胞的基本自噬。进一步研究发现,HBV感染增强的细胞基本自噬水平由HBx所引发,且C型HBx比B型对细胞基本自噬的增加更加显著。【结论】HBV通过HBx增强细胞的基本自噬,且不同基因型HBx对细胞基本自噬的增强程度不同,为进一步阐明HBV感染机理奠定了基础。     

Pfk基因过表达对乳酸乳球菌N8产nisin速率的影响

【目的】通过基因工程手段增加糖酵解途径中编码限速酶6-磷酸果糖激酶基因Pfk在乳酸链球菌素(nisin)产生菌Lactococcus lactis N8中的表达,增快nisin的产生,从而提高单位时间内nisin的产量,缩短发酵周期。【方法】将pfk基因及编码以c AMP为依赖的蛋白激酶催化亚基基因pka C克隆到表达质粒p MG36e上,将共表达重组质粒转入L.lactis N8中,使Pfk-pka C基因过量表达,得到重组菌株L.lactis N8-p MG36epfk-pka C,并比较该重组菌株与野生菌的生长曲线、胞内6-磷酸果糖激酶活性、发酵上清液的抑菌活性及效价,并从转录水平分析两株菌nis A及pfk-pka C的转录差异,比较野生菌与重组菌在不同葡萄糖含量下培养产nisin的变化。【结果】Pfk基因与pka C基因的过表达对重组菌的生长速度没有明显的影响,却能提高重组菌产nisin的速度,在发酵10 h时nisin的产量比野生菌提高了20%,使得发酵周期缩短近2 h。野生菌及重组菌在不同葡萄糖含量下培养发酵上清液的nisin效价没有明显的变化。【结论】糖酵解途径中6-磷酸果糖激酶基因Pfk的过表达可以加快乳酸乳球菌N8产nisin的速率,缩短发酵周期。     

耻垢分枝杆菌的蚯蚓血红蛋白样蛋白MSMEG_3312影响其大环内酯类药物的敏感性

【目的】活性氧类分子是机体有氧代谢的自然产物,可以引起氧化损伤,导致细胞DNA突变、蛋白质失活,是细菌耐药产生的原因之一。蚯蚓血红蛋白家族是能携带氧、可逆地结合氧的一类蛋白,在氧代谢过程中发挥重要作用,与活性氧类分子介导的细菌耐药相关。预测耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)MSMEG_3312是蚯蚓血红蛋白样蛋白,其功能可能与细菌抗药性有关。【方法】通过生物信息学预测耻垢分枝杆菌MSMEG_3312的结构特征。通过基因敲除、遗传互补和抗药性分析以及启动子表达测定等方法研究MSMEG_3312与耻垢分枝杆菌抗药的相关性。【结果】与野生菌株mc2155相比,msmeg_3312敲除菌株表现为抗大环内酯类抗生素,而且回补msmeg_3312部分丧失了这种耐药表型。此外,大环内酯类抗生素的胁迫在统计上显著下调msmeg_3312启动子的表达。另外,对作用于核糖体的其他药物,敲除菌株和野生菌株没有抗药性差异。【结论】生物信息学分析显示MSMEG_3312的氨基酸序列具有典型的蚯蚓血红蛋白保守的HHE结构域,预测其二级结构含有4个α-螺旋组成的典型蚯蚓血红蛋白结构。MSMEG_3312与耻垢分枝杆菌对大环内酯类抗生素的药物敏感性相关,其可能通过影响药物与核糖体50S亚基的作用来发挥功能。     

志贺菌CRISPR的检测及其与耐药的关系

【目的】检测志贺菌成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR),并分析其与志贺菌耐药的关系。【方法】根据CRISPR DB数据库公布的志贺菌确定的CRISPR结构序列CRISPR-S2、CRISPR-S4和可能的CRISPR结构序列CRISPR-S1、CRISPR-S3设计四对引物,对60株志贺菌进行PCR扩增。采用CRISPR Finder分析CRISPR,采用改良K-B药敏纸片法检测志贺菌耐药情况,并分析CRISPR-S4与耐药的关系。【结果】确定的CRISPR结构的总阳性率为95%,四个CRISPR位点组成12种CRISPR谱型(A-L),除K型外均含确定的CRISPR结构,新发现1种重复序列和12种间隔序列。60株志贺菌的多重耐药率为53.33%。CRISPR-S4阳性菌株与阴性菌株之间,耐药的分布差异无统计学意义,但多重耐药菌株和耐TE菌株CRISPR-S4的重复序列多为R4.1,其3’末端缺失碱基AC;多重耐药菌株CRISPR-S4的间隔序列多为Sp5.1、Sp6.1和Sp7。【结论】CRISPR在志贺菌中广泛分布。CRISPR重复序列的变异和间隔序列的多样性可能与志贺菌耐药有关。     

Multimethod assessment of commercial nisin preparations

Nisin is a GRAS preservative effective against several Gram-positive organisms including Listeria monocytogenes. Commercial preparations are usually fermentation products containing 2.5% pure nisin along with insoluble material which, in this study, was found to influence the quantification and activity of nisin under different conditions. Commercially available samples of nisin were tested for efficacy using various methods, such as well diffusion, time to turbidity, and GUS (where a reporter compound is induced in response to nisin). SDS-PAGE detected a single peptide band, corresponding with the molecular weight of nisin. Protein quantified using the Bradford method indicated that the carrier of some samples was proteinaceous. Though the activity of commercially available nisin preparations is indicated on the label, end users should determine the effect of changing their source of nisin. Received 13 February 2002/ Accepted in revised form 26 July 2002     

拆分获得(S)-酮基布洛芬脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆与表达

【目的】筛选具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的脂肪酶基因,构建其表达分泌型工程菌,并进一步提高该脂肪酶的立体选择性。【方法】以自筛选出的一株具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的菌株NK13为材料,通过构建其基因组文库,筛选具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的脂肪酶基因。通过构建该脂肪酶基因的分泌型诱导表达载体pHY300-plk-sacR-gene,将其转入枯草芽孢杆菌WB600,获得基因重组菌WB600(pHY300-plk-sacR-gene)。用SDS-PAGE检测其表达和转化情况,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法纯化脂肪酶;并利用TLC和HPLC检测该酶的立体选择专一性。【结果】得到了具有专一性拆分获得(S)-酮基布洛芬能力、长度为633bp的脂肪酶基因(GenBank登录号为:EU381317)。该脂肪酶在枯草芽孢杆菌WB600中得到了分泌表达。TLC和HPLC检测结果显示,纯化的脂肪酶对底物转化40h时转化率为30%,生成(S)-酮基布洛芬的e.e.%值最高,达60.02%,与未加Tween-80的枯草芽孢杆菌转化子体系相同。而在含Tween-80的环境下,枯草芽孢杆菌表达重组菌对底物转化36h时转化率约为45%,生成(S)-酮基布洛芬的e.e.%值最高,达93.64%,是野生菌NK13的16倍。【结论】从NK13号菌株中筛选得到的新的脂肪酶具有很高的不对称拆分获得(S)-酮基布洛芬的能力,实现了NK13菌中633bp脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,研究证明Tween-80能提高该脂肪酶的拆分专一性。     

洋葱伯克氏菌致病因子的研究进展

洋葱伯克氏菌群(Burkholderia cepacia complex,Bcc)大部分成员是重要的人类条件致病菌。虽然其分类学和分子鉴定研究已取得较大进展,但致病分子机理尚不明确,新药物开发进展十分缓慢。Bcc对许多常用临床抗菌药物都有耐药性,因此揭示其致病因子对新型抗菌药物或治疗方法开发具有重要意义。本文对Bcc主要致病因子、致病机理研究中存在的问题和采用的遗传工具方面的进展做了综述,重点介绍了耐药性、蛋白分泌系统、群体感应系统等6类重要致病因子。     

A new multidrug resistance protein at the blood-brain barrier

Porcine brain capillary endothelial cells (PBCEC) cultured in serum-free and hydrocortisone supplemented medium are characterised by high transendothelial electrical resistances and low cell monolayer permeabilities for small solutes very similar to the blood-brain barrier (BBB) in vivo. Differential screening of a subtracted cDNA library disclosed a 2.1-kb mRNA that is overexpressed in hydrocortisone treated PBCEC relative to untreated cells. The mRNA encodes a 656-aa member of the ATP-binding cassette (ABC) superfamily of transporters that we named brain multidrug resistance protein (BMDP). Phylogenetic analysis and multiple sequence alignment showed that porcine BMDP is most related to the human and mouse breast cancer resistance protein (BCRP). Northern blot analysis revealed that BMDP is expressed in brain tissue in vivo and was predominantly localised within the endothelial cells isolated from brain capillaries. Thus, we identified a new transport protein at the BBB that might play an important role in the exclusion of xenobiotics from the brain.     

偏肺病毒对副粘病毒细胞融合的新注释

对于副粘病毒科中的大多数病毒而言,细胞融合过程需要病毒的融合蛋白和吸附蛋白共同参与,其中吸附蛋白负责与受体结合,吸附蛋白与融合蛋白的相互作用激活融合蛋白进而激活细胞融合。而偏肺病毒介导的细胞融合则与上述副粘病毒的融合显著不同,所有已报道偏肺病毒介导的细胞融合不需要吸附蛋白的参与,其融合蛋白可单独完成与受体结合和融合。并且近年研究发现有些人偏肺病毒毒株介导的融合需要低pH条件,禽偏肺病毒A型具备极强的融合能力,而禽偏肺病毒B型则较弱。原有的副粘病毒细胞融合理论模型均不能解释上述现象,偏肺病毒介导的这种融合机制目前还不清楚,其研究在近几年日趋成为细胞融合机制研究的热点。近年发现的偏肺病毒介导的融合现象打破了人们对副粘病毒融合的固有理解,拓展了人们对副粘病毒介导的细胞融合的认识。本文旨在对偏肺病毒介导的细胞融合的最新成果和进展加以综述和讨论。