重症肌无力单链抗体基因的制备

[目的 ]构建抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体 .[方法 ]应用多聚酶链反应从抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区抗原结合片段扩增重链和轻链可变区基因 ,并克隆到载体噬粒 pHEN2 .将含有单链抗体基因的重组噬粒转化大肠杆菌DH5α ,分离提纯重组噬粒后再经酶切、琼脂糖凝胶电泳检查以确认单链抗体基因的正确性 .[结果 ]电泳检查发现了大小分别为 3 78bp ,3 3 9bp和 762bp的重链可变区、轻链可变区和单链抗体基因 ,且位置正确 .[结论 ]已成功地构建了抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体基因     

重症肌无力抗乙酰胆碱受体单链抗体基因的构建

[目的 ]构建重症肌无力抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因 .[方法 ]应用PCR技术及基因克隆技术分两步完成重链和轻链可变区基因的克隆 ,再对构建的单链抗体A 7基因进行序列测定检测其核苷酸序列 .[结果 ]构建的重组质粒经序列分析 ,重链可变区基因长度为 36 9bp ,轻链可变区基因长度为 32 1bp ,单链抗体基因长度为 735bp ;单链抗体A 7基因正确地插入在载体质粒pHEN 2开放读码框架内 .[结论 ]成功地构建重症肌无力抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因 ,为进一步制备基因工程抗体奠定了基础 .     

抗DR5单链抗体的构建与表达

目的:构建抗DR5单链抗体的真核表达载体,以实现真核表达。方法:RT-PCR法从分泌抗DR5抗体的杂交瘤细胞中合成第一链cDNA,用通用引物钓取单克隆抗体的轻、重链可变区基因。经测序和BLAST比对,证实为一株新的鼠源性抗体基因。利用overlapping PCR方法构建单链抗体真核表达载体pCMV-express-scFv,Lipofectamine2000法转染宿主细胞293T,72 h后ELISA法检测细胞培养上清,检测抗体表达。结果:经序列鉴定和BLAST比对证实克隆的抗体轻、重链可变区基因为新鼠源抗体基因。ELISA实验结果显示抗体有效表达在细胞培养上清中。结论:成功得到抗体轻、重链可变区基因,实现了抗DR5单链抗体的真核表达,为进一步的研究和开发奠定了基础。     

抗转铁蛋白受体单链抗体原核表达载体的构建和表达

目的 构建抗转铁蛋白受体(TfR)单链抗体原核表达载体，为进一步研究其效应奠定基础。方法 从抗TfR单克隆抗体重链和轻链可变区基因的克隆载体pGEM-T-VH和pGEM-T-VL中扩增重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因，用重叠延伸PCR的方法，在VH和VL基因间引入连接短肽(Linker)，构建VH-Linker-VL的单链抗体(single chain Fv，scFv)基因。经NcoⅠ和NotⅠ酶切后亚克隆到原核分泌型表达载体pUCl9／119上，转化和筛选后，阳性细菌经IPTG诱导表达。间接免疫荧光法(IFA)及抗体封闭试验鉴定其抗体活性。结果 凝胶电泳可见重叠延伸PCR扩增产物约700bp条带，SDS-PAGE鉴定表达产物的分子量为27kD左右，与scFv的理论值一致，IFA及抗体封闭试验证明表达产物有抗人TfR的活性。结论 本研究成功地构建并表达了抗人TfR scFv，为抗人TfRscFv的应用奠定了基础。     

单链抗体A7基因的原核细胞表达

[目的]制备抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因,为基因治疗重症肌无力奠定基础.[方法]构建含有抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的重组原核表达载体pHEN 2-单链抗体A 7,将其转化至大肠杆菌HB 2151中,以异丙基--βD-硫代半乳糖苷(IPTG)为诱导剂,在外周质中进行表达,以硼酸钠裂解细菌细胞壁,制备含有单链抗体的裂解液,应用鼠抗c-myc单克隆抗体的斑点杂交试验检测表达的单链抗体A 7基因.[结果]在大肠杆菌的外周质中可见单链抗体A 7基因表达,培养上清液中未见单链抗体A 7基因表达.[结论]抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因在原核细胞成功表达.     

单链抗体A7基因真核表达载体的构建

[目的]构建抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的真核表达载体,为单链抗体A 7基因的真核表达及基因治疗重症肌无力奠定基础.[方法]应用PCR技术,从已构建的含有抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的重组原核表达载体pHEN 2单链抗体A 7上扩增单链抗体A 7基因并纯化,将纯化后的PCR产物经EcoRⅠ和AvrⅡ双酶切后,用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收并纯化,再与经同样酶切并纯化的真核表达载体pPIC 9 K连接,将其产物转化至大肠杆菌DH 5α后扩增,再用AvrⅡ和EcoRⅠ酶切和测定序列检查ScFv A 7基因插入的准确性.[结果]构建pPIC 9 K-ScFv A 7重组载体,经序列测定检查核苷酸序列正确,且ScFv A 7基因准确地克隆至载体开放读码框架内.[结论]成功地构建了抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的真核表达载体.     

6B11卵巢癌抗独特型单链抗体表达及序列分析

目的：克隆和表达６Ｂ１１卵巢癌抗独特型抗体单链可变区基因，并进行序列分析。方法：采用逆转录ＰＣＲ和基因重组技术，扩增并构建６Ｂ１１鼠抗独特型抗体单链可变区基因，重组至噬菌体表面表达载体，在大肠杆菌表达，并利用双脱氧末端终止法进行核苷酸序列分析。结果：阳性克隆表达产物与卵巢癌单克隆抗体ＣＯＣ１６６－９特异结合；ＤＮＡ序列分析表明重链和轻链可变区分属小鼠免疫球蛋白重链第Ｉ亚群和轻链第Ⅱ亚群。结论：自６Ｂ１１小鼠杂交瘤细胞成功地克隆表达了该抗独特型单链抗体基因，为进一步人源化改造，推进卵巢癌的免疫治疗奠定了良好基础。     

SZ—63单链抗体的基因构建、表达及免疫性研究

目的：基因构建与表达SZ-63单链抗体(SZ-63scFv)，降低单克隆抗体对人体的免疫源性。方法：运用基因工程手段通过一段小分子连接肽(Gly4Ser)3将SZ-63抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因连接，构建成pET22b-63scFv表达载体，并导入大肠杆菌BL21（DE3）plys中进行表达，同时进行表达特性的研究。结果：pET22b-63scFv在BL21（DE）3plys中经IPTG诱导后，SZ-63scFv以包涵体形式存在，经复性处理后具有与纤维蛋白D—二聚体结合的活性，其表达量占菌体总蛋白的18％，SZ-63scFv具有13mg／g湿菌的表达量。结论：成功地获得了SZ-63scFv单链抗体并保留了与亲本抗体同一的抗体结合特性。     

抗粘蛋白1单链抗体的构建及其功能初步分析

目的 分离鼠源抗粘蛋白1(mucin1,MUC1)单克隆抗体可变区基因,构建有结合功能的单链抗体,并初步检测结合活性.方法 提取杂交瘤细胞总mRNA,合成cDNA后,PCR扩增鼠特异性抗体可变区编码基因,通过9个氨基酸的连接子构建表达单链抗体的原核重组表达载体,体外诱导表达纯化后,采用Western blot和流式细胞术方法分析单链抗体与变性或天然状态下抗原的结合活性.结果 在杂交瘤细胞中成功分离到抗体轻重链可变区基因,重组链接后形成单链抗体能够在大肠杆菌中分泌表达,Western blot和流式细胞术分析表明该单链抗体能够与变性或天然状态下的T47D肿瘤细胞表面MUC1特异性结合.结论 成功制备具有生物活性的抗肿瘤相关MUC1单链抗体,该单链抗体具有与MUC1特异性结合的生物学活性.     

抗CD44抗体单链抗体构建及表达

目的构建抗 CD44抗体的单链抗体(anti-CD44-ScFv),为进一步应用基因工程抗体研究打下基础。方法从分泌抗 CD44单克隆抗体的杂交瘤细胞系 HII44a 中提取总 RNA,经 RT-PCR 分离获得了轻、重链可变区(V_L、V_H)基因,用连接肽将其构建成具有 V_L-Linker-V_H 结构的单链抗体基因,并将构建的单链抗体基因克隆到分泌型蛋白表达载体 PET22b( )中进行表达。结果经测序表明,V_H、V_L 及 Linker 的序列正确。ScFv 在大肠杆菌中的表达量约占菌体总蛋白的16%。能够特异性与 CD44抗原结合。结论成功构建抗 CD44抗体单链抗体,为进一步制备基因工程抗体奠定了基础。     

抗日本脑炎病毒单克隆抗体2F2重链可变区基因的克隆与鉴定

目的 克隆抗日本脑炎病毒单克隆抗体2F2重链可变区（VH）基因.方法 从分泌抗日本脑炎病毒单克隆抗体2F2的杂交瘤细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增重链可变区基因.凝胶回收纯化后与pMD-18T载体连接,重组载体转化于宿主菌DH5α,挑取菌落PCR鉴定后测序并进行分析.测序正确的质粒经EcoRI和XhoI酶切、纯化后的产物和原核表达载体pRSET A在SolutionI作用下连接,转化BL21（DE3）对重组质粒进行表达.经Tricine-十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测重链可变区表达产物的表达水平,用ELISA检测表达产物能否与日本脑炎病毒结合.结果 确定了2F2VH基因序列,长度为354 bp,编码118个氨基酸,第22位和第96位残基是维持抗体结构的半胱氨酸,含有特异性CDR1、CDR2和CDR3区域,符合鼠源性免疫球蛋白基因的特征.ELISA检测结果显示原核表达的2F2重链可变区产物可与日本脑炎病毒特异性结合.结论 获得了抗日本脑炎病毒单克隆抗体2F2重链可变区基因.     

重症肌无力单链抗体A7基因在毕赤酵母中的表达

[目的]将抗乙酰胆碱受体单链抗体(ScFv)A 7基因转化至毕赤酵母GS 115,筛选阳性转化子并诱导蛋白表达,制备单链抗体A 7蛋白.[方法]将构建的含有抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的重组真核表达载体pPIC 9 K-ScFv A 7经SalⅠ酶切线性化后,利用电转化方法转化受体毕赤酵母菌GS 115,以甲醇诱导蛋白表达,应用鼠抗c-myc单克隆抗体进行斑点杂交试验,检查所表达的单链抗体A 7蛋白.[结果]在酵母菌的培养上清液中发现单链抗体A 7蛋白的表达,而阴性对照菌中未见表达产物.[结论]抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7蛋白已成功地在真核表达系统中表达.     

抗CD44抗体单链抗体构建及表达

目的 构建抗CD44抗体的单链抗体（anti-CD44-ScFv），为进一步应用基因工程抗体研究打下基础。方法 从分泌抗CD44单克隆抗体的杂交瘤细胞系HII44a中提取总RNA，经RT-PCR分离获得了轻、重链可变区（VL、VH）基因，用连接肽将其构建成具有VL-Linker-VH结构的单链抗体基因，并将构建的单链抗体基因克隆到分泌型蛋白表达载体PEV22b（＋）中进行表达。结果 经测序表明，VH、VL及Linker的序列正确。ScFv在大肠杆菌中的表达量约占菌体总蛋白的16％。能够特异性与CD44抗原结合。结论 成功构建抗CD44抗体单链抗体，为进一步制备基因工程抗体奠定了基础。     

6B11卵巢癌抗独特型单链抗体表达及序列分析

目的；克隆和表达６Ｂ１１卵巢癌抗独特型抗体单链可变区基因，并进行序列分析，方法；采用逆转录ＰＣＲ和基因重组技术，扩增并构建６Ｂ１１鼠抗独特型抗体单链可变区基因，重组至噬菌体表达表达载体在大肠杆菌表达，并利用双脱氧末端终止法进行核苷酸序列分析。结果；阳性克隆表达产物与卵巢癌单隆抗体ＣＯＣ１６６－９特异结合；ＤＮＡ序列分析表明重链和轻链可变区分属小鼠免疫球蛋白重链第Ｉ亚群和轻链第Ⅱ亚群。结论；自６Ｂ１     

抗骨形成蛋白单链抗体的构建与表达

目的:构建抗骨形成蛋白单链抗体并获得表达.方法:应用一段人工合成的含15个氨基酸的连接肽,采取亚克隆技术,将一株鼠抗BMP单克隆抗体的重链可变区(VH)的N端和轻链可变区(VL)的C端连接起来;将连接产物克隆入融合蛋白表达载体pEGX-4T-l,在大肠杆菌JM109中进行表达.结果:构建的单链抗体(ScFv)全长705 bp,并获得融合表达产物约52×103u.结论:亚克隆方法是一种构建单链抗体快速、简便、可靠的方法.     

鼻咽癌人源抗独特型基因工程抗体的原核表达及鉴定

目的构建鼻咽癌人源抗独特型单链抗体原核表达载体，对其产物做初步鉴定，为鼻咽癌疫苗制备奠定基础。方法采用分子克隆技术，PCR扩增G22ScFv基因，并将其克隆到原核表达载体pET25b（＋）上，将重组子转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导表达后，表达的蛋白经His—tag纯化试剂盒纯化后复性。SDS—PAGE及Western blot分析融合蛋白。结果构建的原核表达载体pET25b（＋）－G22经测序检测，序列正确。在大肠杆菌中G22ScFv以包涵体形式获高效表达，SDS－PAGE及Western blot鉴定表达的目的蛋白Mr为25kD，同时证实载体构建及表达均正确。目的蛋白经试剂盒纯化后电泳分析纯度达95％以上。结论利用基因重组技术，在原核细胞中表达出重组G22ScFv并得到纯化，为研究鼻咽癌疫苗打下了基础。     

肝癌细胞内表达抗肝癌单链抗体

0引言细胞内抗体（intrabody）技术是近几年来完善的一种新的基因治疗策略[1]。细胞内抗体具有结合、灭活肿瘤细胞癌蛋白、诱导细胞凋亡的作用[2]。未见有关在肝癌细胞内表达抗肝癌单链抗体的研究报道。本研究在肝癌细胞内表达抗肝癌单链抗体，观察单链抗体在肝癌细胞内表达对肝癌细胞的影响。1方法抗人肝癌单链抗体基因由本室制备。该基因长700加，由重链可变区基因和轻链可变区基因I－inker（Gly4Ser）。连结组成，重链5’端含有EcoRI酶切位点和A”l’G启始码，删除了轻链可变区分端57个碱基，轻链3’端含有一个Sail酶切位点。将含有…     

抗EGFR单链抗体融合gelonin毒素的原核表达体的构建及其生物活性研究

目的 构建表达抗表皮生长因子受体(EGFR)单链抗体融合gelonin毒素的原核表达载体,并初步验证其功能.方法 以抗EGFR单链抗体基因为模板,通过PCR及酶切连接将该基因定向克隆人含gelonin毒素的原核表达载体pET32a中,将该质粒转入BL21( DE3)中经异丙基疏代半乳糖苷(IPTG)诱导表达得到包涵体,...     

抗人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)外膜蛋白gp120单链抗体基因的构建及测序鉴定

目的　构建抗HIV 1gp120单链抗体基因,为进一步用于HIV 1感染的诊断和治疗奠定基础。方法　利用 RT PCR法,从抗HIV 1gp120单克隆抗体杂交瘤细胞扩增得到抗体轻链和重链的可变区基因,经重叠延伸反应, 在体外随机合成单链抗体基因(ScFv),并克隆到pGEM Easy T载体中,经测序及Blast同源性分析。结果　该 ScFV基因全长为666bp,为VH Linker VL结构,VH基因为396bp,编码132个氨基酸;Linker为(Gly4Ser)3短 肽;VL基因为270bp,编码90个氨基酸。VH基因与小鼠IgG2a重链可变区的同源性达95%,VL基因与小鼠免 疫球蛋白κ轻链可变区的同源性达98%。结论　成功构建了抗HIV 1gp120单链抗体基因。     

鼠源性抗HBV-TP可变区抗体基因的克隆及原核表达

目的:扩增鼠源性抗HBV末端蛋白(HBV-PT)mAb轻、重链可变区(VL,VH)基因,构建sFv原核表达载体并于大肠杆菌中表达.方法:从鼠源抗HBV末端蛋白杂交瘤细胞(E3)中提取细胞总RNA,逆转录成cDNA,以鼠源简并性引物PCR扩增抗体的VL和VH基因,克隆到pGEM-T Easy载体,测序并对其结构进行分析.选择序列正确的克隆,分别构建VL及VH的PBV220原核表达载体,42℃诱导表达,Western blot鉴定表达产物.结果:经测序证实,所克隆的VL基因为363 bp,VH基因为375 bp,两者序列与鼠抗体的同源性均大于80%.构建了鼠抗HBV-PT抗体基因VL及VH的PBV220原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达.表达产物经SDS-PAGE及Western印迹分析与羊抗鼠IgG产生特异反应.结论:抗HBV末端蛋白轻、重链可变区基因的克隆及表达为进一步探讨HBV感染患者的免疫治疗奠定了基础.