辣椒转录因子CaNAC23基因的克隆与表达分析

为分析NAC转录因子在辣椒发育及非生物胁迫中的功能,本研究以‘晋尖椒22’为试验材料,克隆获得CaNAC23基因全长,该基因全长1 899 bp,编码632个氨基酸,预测分子量约为72.54 kD,等电点为6.26,无序化区域有7个。二级结构预测和亚细胞定位预测表明CaNAC23含有一个保守的NAC结构域,定位于细胞核。氨基酸序列比对和进化树分析表明CaNAC23和拟南芥AT3G03200 (NAC045)同源性较高,进化上在同一分支。CaNAC23基因的组织表达特异性和非生物胁迫下的表达模式结果表明:CaNAC23在叶片中表达量最高,其次是根,暗示CaNAC23基因可能参与辣椒叶片或根发育相关。CaNAC23能够被干旱和盐胁迫诱导表达,推测其参与调控辣椒的非生物胁迫调控。本研究结果为研究NAC转录因子在辣椒发育及非生物胁迫应答中的功能提供了参考依据。     

基于VIGS技术的小麦干旱响应基因TaEF-1α的功能研究

为了进一步研究Ta EF-1α基因在小麦响应干旱胁迫中的作用,首先在正常灌水和干旱胁迫2个处理下对Ta EF-1α基因在转录水平上的表达量进行了验证,并利用VIGS(Virus induced gene silencing)技术将Ta EF-1α基因进行沉默,对其功能进行研究。结果表明,Ta EF-1α基因在m RNA水平上的表达量与其蛋白水平上的变化趋势一致,均受干旱诱导上调表达。与正常灌水且未进行VIGS沉默处理的植株相比,干旱处理且未进行VIGS沉默处理的植株中Ta EF-1α基因表达量极显著升高,其叶片相对含水量也极显著降低、相对电导率和丙二醛(MDA)含量则极显著升高;干旱条件下,与未进行VIGS沉默的对照植株相比,VIGS沉默后的植株中Ta EF-1α基因表达量极显著下降,其叶片相对含水量也极显著降低、相对电导率和丙二醛(MDA)含量则极显著升高,植株表现出叶片下垂、对干旱胁迫敏感的表型。综合干旱处理和VIGS沉默Ta EF-1α基因后小麦植株的表型和生理指标变化,说明干旱胁迫诱导小麦植株中Ta EF-1α基因上调表达,敲低Ta EF-1α基因表达后小麦抗旱性显著下降,因此,Ta EF-1α基因在小麦响应干旱胁迫中可能发挥了重要作用。     

陆地棉叶片发育相关基因GhRH39克隆与功能分析

【目的】研究陆地棉DEAD-box RNA解旋酶基因GhRH39在叶片发育中的功能。【方法】借助生物信息学方法分析GhRH39的基因结构和进化关系,利用实时定量聚合酶链反应PCR (Quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)分析该基因在棉花不同组织和叶片不同发育时期的表达情况,利用病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing, VIGS)技术对该基因进行沉默。观察阳性植株表型,检测其光合色素含量变化,对阳性植株中叶绿体发育和光合色素合成相关基因进行表达量检测。【结果】Gh RH39编码620个氨基酸,且序列较为保守。qRT-PCR分析表明,该基因在根、茎、叶片、顶芽、花瓣、纤维中均有表达,在叶片中表达量较高,且在叶片中的表达量随着叶片发育进程而变化。利用VIGS技术成功降低了GhRH39的表达水平,基因沉默的阳性棉株出现失绿表型,叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素3种光合色素含量均降低。阳性沉默棉株的叶绿体发育和光合色素合成相关基因表达量出现一定程度的下降。【结论】GhRH39基因影响棉花叶绿素和类胡萝卜素合成,同时影响叶绿体发育过程。     

辣椒抗黄瓜花叶病毒病候选基因功能鉴定

黄瓜花叶病毒(CMV)为辣椒的主要病害,鉴定辣椒抗CMV基因并研究其抗性机理是辣椒抗CMV育种的理论基础。前期研究发现,CA02g19570和CA02g19600为辣椒抗CMV主效QTL (qCmr2.1)的候选基因,其中CA02g19570可能性更高。本研究以辣椒抗CMV材料PBC688和易感CMV材料G29为试验材料,采用qRT-PCR和VIGS技术验证候选基因CA02g19570和CA02g19600在辣椒抗CMV中的功能。结果表明,接种CMV后0～28 d的发病过程中,抗病材料PBC688和感病材料G29中的CA02g19570基因表达量均显著上调,且抗病材料中基因上调水平显著高于感病材料;而CA02g19600在抗、感材料中的基因表达模式无显著规律。在PBC688中沉默CA02g19570后,有6个(60%)植株在接种CMV后出现严重的系统花叶症状,CA02g19570的相对表达量显著下调;而沉默CA02g19600后,仅有2个(20%)植株出现轻微的花叶症状。本研究认为CA02g19570是辣椒2号染色体上的抗CMV主效QTL (qCmr2.1)的抗性基因。     

VIGS沉默CaCYC1基因对喜树叶片中喜树碱合成的影响

喜树是一种具有药用价值的木本植物,其主要次级代谢产物喜树碱具有良好的抗癌功效。本研究主要通过病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)技术对喜树碱生物合成途径中的关键酶基因CaCYC1环烯醚萜合酶(Camptotheca acuminata iridoid synthase,CaCYC1)进行瞬时沉默,进而研究该基因对喜树碱生物合成的影响。以喜树叶片总RNA为模板,通过RT-PCR技术克隆CaCYC1基因片段并构建TRV-VIGS重组质粒,转化农杆菌GV3101后侵染喜树叶片,培养20 d后利用qRT-PCR与HPLC技术分析沉默对CaCYC1基因转录水平及喜树碱合成的影响。结果表明:与对照组相比,实验组中CaCYC1基因的相对表达量显著下降49%,叶片中喜树碱的积累量显著下降35%。上述结果表明,本研究所构建的由TRV介导的VIGS体系可有效沉默内源基因的表达,CaCYC1基因可正向调控喜树叶片中喜树碱的生物合成。     

橄榄果实氨基酸转运蛋白基因CaAAP1、CaAAP2和CaAAP4的克隆与表达分析

氨基酸通透酶(amino acid permease, AAP)参与植物氨基酸的转运、吸收、氮代谢等途径。为了解橄榄果实AAP基因在不同品种果实成熟发育过程的表达模式,本研究以呈味差异显著的两个品种普通橄榄‘长营’和清橄榄‘梅埔2号’为试验材料,通过RT-PCR方法克隆了3个APP基因的cDNA序列全长,并对其进行了生物学信息分析与亚细胞定位分析,同时利用实时荧光定量PCR技术分析了两个不同品种果实在不同发育时期的CaAAPs表达情况。结果表明：3个基因的序列长度分别为1 254 bp (CaAAP1)、405 bp (CaAAP2)、633 bp (CaAAP4),其编码的蛋白均为不稳定疏水性蛋白,分别含有7、1、5个跨膜区,保守基序差异较大;亚细胞定位结果表明,CaAAP1、CaAAP2主要在细胞质膜上表达。荧光定量结果表明随着果实的发育,CaAAP1、CaAAP2和CaAAP4在‘长营’果实的表达量均呈显著上升趋势,在‘梅埔2号’的表达量变化趋势较平缓,且在170 d时显著下降,两个品种CaAAPs家族基因表达量差异大,表明CaAAP1、CaAAP2、CaAAP4基因可能对橄榄果...     

ClaMADS12基因克隆及在西瓜果实发育中的表达特性分析

本研究从西瓜果实发育转录组数据中,筛选出ClaMADS12基因,并对其进行基因克隆、生物信息学以及初步表达分析。生物信息学分析显示该基因的开放阅读框为3 374 bp,编码区全长621 bp,共编码206个氨基酸。结构域分析显示,该基因含有一个典型的“MADS-box”保守结构域,位于从N端第1到75个氨基酸,属于MADS-box家族。对其蛋白质的理化性质分析显示,ClaMADS12蛋白以异亮氨酸为主,无信号肽和跨膜结构域,属于不稳定型、亲水蛋白,亚细胞定位预测该蛋白位于细胞核。对该基因进行同源性比对及系统进化树分析显示,冬瓜MADS-box 12基因与ClaMADS12亲缘关系最近,同源性高达95.61%。RT-PCR分析表明,ClaMADS12在西瓜果实发育中,相对表达量与果肉质地的软化呈正相关。本研究为进一步明确ClaMADS12基因在西瓜果实发育中的功能提供依据。     

油用牡丹PsFAD6基因的克隆与表达分析

本研究以油用牡丹(Paeonia suffruticosa)叶片为试验材料,采用RACE和RT-PCR的方法克隆得到油用牡丹ω-6脂肪酸脱氢酶(ω-6 FAD)基因cDNA全长,命名为PsFAD6(GenBank登录号:KY233120)。序列分析表明,该基因cDNA序列全长1 819 bp,其中开放阅读框1 326 bp,编码441个氨基酸,3'端非编码区长271 bp,5'末端非编码区长192 bp;多序列比对表明,油用牡丹PsFAD6氨基酸序列含有3个保守结构域,系统发育分析显示油用牡丹与葡萄处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和TargetP亚细胞定位分析得知,PsFAD6蛋白无信号肽,具有3个跨膜域,可能定位于叶绿体中发挥功能。组织特异性分析表明,PsFAD6在油用牡丹的根、茎、叶、花瓣、雌蕊、雄蕊、种子中均有表达,其中,在叶片中表达量最高,雄蕊次之,在雌蕊中表达量最低;不同发育时期种子中,80 d表达量最高,60 d次之,在20 d中表达量最低     

转基因烟草中半胱氨酸跨膜基因CYS生物信息学分析

在烟草中过量表达MYB转录因子LrAN2,能够激活上调花青素生物合成代谢通路,但富含半胱氨酸跨膜结构域蛋白A (CYS)的表达量明显降低。作为植物中一种重要的生物氨基酸,CYS的生物学研究鲜有报道。本研究克隆烟草的CYS基因,其全长为282 bp,编码氨基酸数94个。预测编码的蛋白分子量和等电点分别为24 019.84 Da和5.23,并且序列中没有保守区。实验结果显示该蛋白具有亲水性,主要由α-螺旋(19.35%)和无规则卷曲(65.59%)构成,CYS蛋白质不通过跨膜区,在膜外进行作用。系统发育树显示,烟草CYS基因与辣椒CYS基因亲缘关系最近,其次是番茄的HTC基因和WIH2基因。本研究结果克隆并分析CYS基因编码区序列,为CYS基因的功能研究提供参考依据。     

灰楸外整流钾离子通道CfSKOR基因的克隆及表达分析

灰楸(Catalpa fargesii)是中国重要的珍贵用材树种,为了探讨外整流钾离子通道SKOR同源基因在灰楸发育中的可能作用,本研究从灰楸中分离得到CfSKOR基因,该cDNA序列全长2 459 bp,开放阅读框(ORF)为1 899 bp,编码632个氨基酸和1个终止密码子,推测蛋白相对分子质量为72.81 kD,理论等电点(pI)为6.49。CfSKOR编码蛋白具有较强的亲水性并含有6个跨膜区(S1～S6),且包含SKOR亚家族蛋白独特的保守结构域和一个位于C末端缺失部分氨基酸的锚蛋白区。此外,该蛋白亚细胞定位预测定位于细胞质膜。CfSKOR基因在不同处理下的表达水平分析表明,在单一外源225 g/L PEG、100μg/L ABA胁迫1 d后,CfSKOR基因在灰楸根部皆呈上调表达,在ABA处理组中的表达量最高,显著高于其他处理;但在PEG、ABA和PEG+ABA胁迫7 d后,该基因在所有处理组中皆呈下调表达。以上研究结果表明,灰楸CfSKOR基因可能在灰楸非生物应答过程中发挥功能。研究结果有助于解析灰楸Shaker家族基因调控灰楸钾离子吸收转运的分子机制和灰楸钾离子通道与耐盐性的关系,并为利用基因工程手段改良灰楸积累研究资料和基因资源。     

棉花GhFT基因的克隆及功能分析

开花是植物营养生长向生殖生长转变的一个重要过程,其中FT基因是开花调控过程中重要的整合因子和调控开花的关键基因。为了研究GhFT基因在棉花的开花和株型发育过程中的功能,本研究克隆了棉花GhFT基因,分析发现该基因开放阅读框为525 bp,编码174个氨基酸,由4个外显子组成。基因表达模式分析发现GhFT在棉花不同品种中都呈现随着植株的生长,表达水平逐渐增加的趋势。在零式果枝‘3798’品种中,茎尖和花芽的表达量相对较高。在正常品种中,各组织表达水平差异不大。在晋县短果枝棉中使用VIGS沉默GhFT之后植株的节间生长受到了一定的限制。酵母双杂的结果没有发现GhFT和GhBRC1之间存在互作,酵母单杂的结果显示GhFLC和GhBRC1可以与GhFT启动子区域相应的位点结合。本研究的结果为进一步研究GhFT基因的功能,完善棉花开花和株型分子调控机制提供了帮助。     

甘蔗新基因ShHXT4克隆亚细胞定位及表达特征

以甘蔗品种新台糖22号为材料,利用同源克隆技术从甘蔗中分离出ShHXT4基因,以GADPH基因为内参,并采用实时定量RT-PCR分析该基因在甘蔗组织中的表达,同时构建亚细胞定位载体,通过农杆菌侵染洋葱表皮的方法对ShHXT4编码的蛋白进行亚细胞定位。研究分析发现该基因CDS序列长度为1 632 bp,编码540个氨基酸,蛋白的等电点(p I)为9.16,理论分子量为56.64 k D,命名为ShHXT4,基因编码多肽链中包含信号肽和12次跨膜结构域,且亚细胞定位于质膜,编码一种转运蛋白。洋葱表皮瞬时表达该基因GFP融合载体表明,ShHXT4定位于细胞膜,组织表达分析显示ShHXT4基因在根、茎和叶中均有表达,叶片中的表达量较高,暗示ShHXT4基因可能在甘蔗叶片糖分转运过程中扮演重要角色,研究结果为进一步研究ShHXT4基因的功能及应用提供帮助。     

菘蓝IiCYP79B2基因的克隆与表达分析

为了探究菘蓝IiCYP79B2基因的结构、特性和功能,对菘蓝IiCYP79B2基因进行了克隆,并进一步开展了生物信息学分析和不同条件下的表达模式研究。相关研究结果显示:IiCYP79B2基因全长1 827 bp,包含1个内含子,ORF全长1 629 bp,编码542个氨基酸。其编码的蛋白含有2个跨膜结构域,无信号肽,定位于叶绿体类囊体膜上,属于主要由无规则卷曲和α-螺旋构成的亲水性蛋白,与白芥的亲缘关系最近。qRT-PCR分析结果表明:IiCYP79B2基因在菘蓝各组织中的表达量由高到低依次为叶茎果花根,在不同发育时期的表达量依次为营养生长期花期幼苗期萌芽期;此外,该基因的表达还显著响应茉莉酸甲酯(MJ)和葡萄糖(Glu)信号的诱导,受到水杨酸(SA)和低温(Cold)胁迫的抑制。相关研究结果为进一步探讨IiCYP79B2基因的功能提供了有效的试验依据。     

苹果CTK响应因子MdRR1的克隆和功能初步分析

为了探究B型细胞分裂素响应因子RR在苹果腋芽萌发中的功能,以难分枝的一年生‘长富2号’/T337/八棱海棠苹果苗为试验材料,从其腋芽中克隆得到细胞分裂素响应因子家族的1个关键基因MdRR1,其开放阅读框长度为2 025 bp,编码674个氨基酸。实时荧光定量PCR分析表明,MdRR1在根中表达量最高,而在腋芽等其他部位较少;6-BA和去顶处理后,MdRR1在腋芽中的表达量显著下调,去顶加Lovastatin(细胞分裂素合成抑制剂)处理与仅去顶处理相比,MdRR1的表达量在处理6 h显著上调。亚细胞定位发现苹果MdRR1基因定位于细胞核。拟南芥中异源过表达苹果MdRR1后其分枝数量较野生型没有显著差异,但对外源独脚金内酯的敏感性降低。这些结果表明,MdRR1可能参与调控苹果腋芽萌发。本研究为苹果优质苗木繁育和省力化栽培中的分枝发育调控提供了理论基础。     

矮牵牛PhACOS5基因的克隆及花药特异性表达分析

酰基辅酶A合成酶5基因(ACOS5)是孢粉素前体生物合成过程中的关键基因,对植物花药的育性具有重要的影响。本研究以矮牵牛(Petunia hybrida)品种‘幻想’为材料,结合前期矮牵牛花药转录组数据库信息,通过PCR克隆从矮牵牛花药中获得了ACOS5基因的c DNA全长,命名为Ph ACOS5。该基因开放阅读框为1 683 bp,编码560个氨基酸,没有信号肽和跨膜结构,预测定位于细胞质中。氨基酸序列分析表明,该基因编码的氨基酸序列具有ACOS家族中保守存在的结构域。序列进化分析表明,Ph ACOS5与其同科的辣椒属植物辣椒以及番茄属植物番茄和马铃薯的ACOS5蛋白亲缘关系较近。荧光定量RT-PCR(q RT-RCR)分析证实了该基因为矮牵牛花药组织特异性表达的基因,且在花药发育的前期表达量较高,并具有花药发育时期的特异性。本研究结果将为今后使用基因编辑等技术创造矮牵牛雄性不育植株提供有效的基因资源。     

嘉兰中酪氨酸脱羧酶基因的克隆与表达分析

酪氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.28)是高等植物体中秋水仙碱合成的关键酶。为了探索嘉兰秋水仙碱生物合成途径的关键酶基因及其相关功能,本研究根据嘉兰转录组数据库和NCBI数据库,克隆得到一个酪氨酸脱羧酶关键酶基因(GsTyDC1)的CDS序列,并使用RT-qPCR检测GsTyDC1在嘉兰植株中不同组织的表达水平。通过烟草悬浮细胞对GsTyDC1进行稳定转化,并分析其亚细胞定位的结果。结果显示,GsTyDC1基因的CDS区全长为1 545 bp,编码514个氨基酸,蛋白分子量为56.3 kD。生物信息学分析表明,GsTyDC1与水仙、石蒜和芭蕉等百合科植物已报道的Ty DC基因聚在一类,具有类似于与其他已报道物种TyDC基因相似的保守结构区域,并且没有跨膜结构和信号肽。此外,GsTyDC1基因在嘉兰根中表达量最高,花和茎次之,在叶中表达量最低。亚细胞定位显示Gs TyDC1蛋白定位在细胞质中。本研究为下一步验证GsTyDC1基因的功能活性提供一定的基础,为阐明GsTyDC1基因在嘉兰秋水仙碱生物合成途径中的作用提供参考依据。     

芒果赤霉素氧化酶基因GA3ox的克隆、表达及亚细胞定位分析

赤霉素3-氧化酶(gibberellin 3-oxidases, GA3ox)是赤霉素(gibberellic acid, GA)生物合成途径中的关键限速酶之一。芒果中GA3ox基因的功能及其表达模式未见报道。本研究利用RACE技术克隆了一个芒果GA3-氧化酶基因(GA3ox),该基因全长cDNA序列为1 680 bp,编码氨基酸381个,开放阅读框(open reading frame, ORF)为1 146 bp,蛋白分子量为42.6 kD,等电点为5.13,不含信号肽,不含跨膜结构域。系统发育树分析发现,该基因编码的蛋白主要与开心果亲缘关系较近,其次为克莱门柚、甜橙、麻疯树等植物。通过拟南芥原生质体亚细胞定位分析发现,该基因主要定位在细胞质中。通过对乔化、矮化芒果品种不同发育时期的叶片的实时荧光定量PCR分析发现,该基因主要在矮化品种中表达量较高,在乔化品种各个时期表达量较低,且差异不大。矮化品种中主要在开花期表达量最高,坐果期7～8周含量最低,但都高于乔化品种的任何取样时期。该基因的克隆和表达分析为下一步功能的研究及其在芒果株形调控分子机制提供理论依据。     

红花(Carthamus tinctorius)热激转录因子CtHSFA9的克隆及表达分析

根据课题组前期转录组文库信息获得的红花热胁迫相关转录因子Unigene的全长序列,设计引物并克隆该基因,采用生物信息学方法对其氨基酸序列的理化性质、系统发育、蛋白质亚细胞定位、结构域及跨膜区域等进行预测和分析。此外,试验还采用RT-qPCR方法分析该基因在红花各组织包括根、茎、叶、花及4个不同发育时期的种子中的表达情况。结果发现,所获序列全长1 326 bp,可编码441个氨基酸,相对分子质量50.41 k D。其中,最丰富的氨基酸为亮氨酸(Leu),带正电残基64个,带负电残基75个。信号肽及亚细胞定位揭示该基因不存在明显信号肽且该基因属细胞核定位。SMART分析表明该基因具有典型HSF结构域。进化树分析表明,该序列与热激转录因子HSFA9基因相似度较高,与刺菜蓟的亲缘关系最近,因此可将其命名为CtHSFA9。荧光定量PCR分析表明CtHSFA9基因在红花根组织中相对表达量最高,叶次之,花中最低。在不同发育时期种子中,以花后18 DAF (Day after flower)中表达量最高,22 DAF次之,在14 DAF表达量最低。本研究初步明确了红花CtHSFA9基因的结构特点和进化关系,其属于HSF热激转录因子家族,可为后续开展红花逆境相关转录因子的机理研究做铺垫,同时也为植物抗逆性状的改良提供研究基础。     

红麻HcKAN4基因克隆、表达及在类黄酮合成中的功能

MYB类转录因子KAN4 (KANADI4)在红麻类黄酮合成和纤维发育中发挥着重要作用。本研究以红麻品种‘福红952’为材料,对HcKAN4基因进行克隆和表达模式分析,探讨TRV-VIGS诱导该基因沉默对类黄酮合成途径中关键酶基因表达量改变的影响。基因克隆显示, HcKAN4基因开放阅读框(open reading frame, ORF)全长为966 bp,编码322个氨基酸,包含一个MYB保守结构域。进化树分析发现,其与拟南芥和木槿KAN4s的亲缘关系较近。表达分析表明,该基因在红麻不同组织中均有表达,且转录水平随着植物生长而递增。VIGS诱导基因沉默显示, 6株HcKAN4的转录水平显著下调,达到基因沉默效果。进一步实时荧光定量PCR检测发现,类黄酮合成相关基因HcCHS、HcF3’5’H、HcANS、HcANR的转录水平显著下调,分别是对照组的0.51、0.14、0.23、0.11倍,表明HcKAN4基因可调控红麻类黄酮生物合成相关基因。这些结果为阐明红麻MYB转录因子调控类黄酮合成提供了依据,同时为改善纤维品质提供了研究思路。     

陆地棉苗期低温响应基因GhZAT10的克隆及功能研究

【目的】挖掘棉花耐冷相关基因,为培育棉花耐冷品种奠定基础。【方法】克隆陆地棉基因GhZAT10(Zinc finger of Arabidopsis thaliana 10),通过实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)分析冷处理前后该基因在根、茎、叶的表达;通过生物信息学方法分析Gh ZAT10基因结构及其编码的蛋白质性质及进化关系;通过Gateway技术构建蛋白表达载体35S::GhZAT10-GFP进行亚细胞定位;利用病毒诱导的基因沉默技术研究低温胁迫下GhZAT10在棉花耐冷反应中的功能。【结果】GhZAT10基因开放阅读框长度为813 bp(base pair,碱基对),编码270个氨基酸;GhZAT10在根中表达量高于茎和叶,低温胁迫下在3种组织中均上调表达。GhZAT10蛋白无信号肽,不包含跨膜螺旋,且其活性与其磷酸化调控关系密切。陆地棉GhZAT10与可可、拟南芥、甜橙中的ZAT10蛋白亲缘关系较近;GhZAT10蛋白定位在细胞核;沉默GhZAT10基因使棉花的耐冷能力减弱。【结论】GhZAT10蛋白属于C_2H_2型锌指蛋白,在陆地棉冷胁迫响应信号途径中具有积极作用。