RNA干扰survivin对卵巢癌HO-8910PM细胞周期的影响

目的 探讨RNA干扰survivin基因对卵巢癌HO-8910PM细胞周期的影响.方法 实验分3个组：siR-NA组,采用脂质体法将靶向survivin siRNA荧光真核表达质粒载体pGPU6-GFP-survivin-shRNA转染卵巢癌HO-8910PM细胞;空白对照组,单纯细胞培养;阴性对照组,用表达与survivin序列无同源性的siRNA片段质粒pGPU6-GFP-NC转染细胞.于转染后48 h和72 h,用PI单染法流式细胞术检测各组HO-8910PM细胞周期的变化以及Western blot检测survivin蛋白的表达情况.结果 PI单染流式细胞仪检测细胞周期结果表明,与空白对照组和阴性对照组相比较,2个时间点siRNA组转染后的G0/G1期细胞比例明显增加,而G2/M期细胞比例均下降（P＜ 0.05）;Western blot结果证实,siRNA组的HO-8910PM细胞survivin蛋白的表达量明显下调.结论 导入survivin基因特异性的siRNA可导致卵巢癌HO-8910PM细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞增殖受阻,且细胞sur-vivin蛋白表达量下降.     

己酮可可碱抑制人卵巢癌HO-8910PM细胞AnnexinⅡ、NF-κB p65蛋白的表达

目的观察己酮可可碱(PTX)对体外培养的人卵巢癌细胞增殖及其AnnexinⅡ、NF-κB p65蛋白表达的影响。方法不同浓度PTX作用于人卵巢癌细胞HO-8910PM,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测其对HO-8910PM增殖的影响;采用免疫细胞化学方法检测PTX作用前后HO-8910PM细胞AnnexinⅡ、NF-κBp65蛋白表达的变化。结果 MTT结果显示:不同浓度PTX(0.25～2.0mg/ml)作用于HO-8910PM细胞12、24、48、72h,均可不同程度抑制细胞增殖,同一时间段各浓度PTX作用组与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),各浓度PTX作用组组内两两相比差异有统计学意义(P<0.05)。PTX同一浓度组各时间点两两相比细胞增殖抑制率差异均有统计学意义(P<0.05)。免疫细胞化学显示:以不同浓度的PTX(0.5～2.0mg/ml)作用HO-8910PM细胞24、48、72h后,AnnexinⅡ蛋白较空白对照组有所降低;同一时间段内AnnexinⅡ蛋白表达呈浓度依赖性,差异有统计学意义(P<0.05),同一剂量组AnnexinⅡ蛋白表达呈时间依赖性,差异有统计学意义(...     

Cyclin E干扰RNA对人卵巢癌HO-8910细胞蛋白质组表达的影响

目的使用RNA干扰技术阻断人卵巢癌HO-8910细胞中Cyclin E的表达,分析Cyclin E表达受抑制后产生的一些效应,采用双向凝胶电泳和质谱技术分析鉴定转染前后细胞内差异表达的蛋白质,探讨Cyclin E在人卵巢癌细胞增殖中的作用,以期为人卵巢癌发生、发展、诊断与治疗提供有价值的资料。方法构建质粒表达载体pU6-Cyclin E-siRNA,同时设立阴性对照组和空白对照组。采用脂质体转染法稳定转染卵巢癌HO-8910细胞,G418筛选阳性克隆细胞;噻唑蓝(MTT)法检测细胞生长曲线的改变;RT-PCR法比较转染前后Cyclin E mRNA的表达量的变化;双向凝胶电泳-图像分析-质谱技术-数据库搜索,比较转染前后蛋白质组表达的变化,鉴定差异显著的蛋白点。结果 1)成功构建了Cyclin E干扰RNA的重组质粒并获得稳定转染组细胞HO-8910-Cyclin E siRNA。2)稳定转染组HO-8910-Cyclin E siRNA细胞与阴性对照组HO-8910-neo细胞和空白对照组相比,细胞生长速度减慢,Cyclin E mRNA表达水平降低。3)通过双向电泳-图像分析-质谱技术得到稳定转染组低表达蛋白5个,经数据库搜索分别是锌指蛋白ZFP-36、波形蛋白、肿瘤拒绝抗原gp96、未知蛋白、DNA校正蛋白酶Ⅱ。结论Cyclin E干扰RNA干扰后卵巢癌HO-8910细胞Cyclin E基因的表达明显降低,细胞增殖能力减弱。差异表达的蛋白质参与细胞的增殖、细胞信号转导调节,并与肿瘤的发生、发展、诊断密切相关。     

转移抑制基因BRMS1对卵巢癌细胞侵袭能力的影响

目的研究转移抑制基因BRMS1对高转移性人卵巢上皮癌细胞(HO-8910PM)侵袭能力的影响。方法脂质体介导将重组真核表达质粒pcDNA3.0-BRMS1转染HO-8910PM细胞;RT-PCR检测转染前后细胞中BRMS1mRNA的表达;Boyden小室法检测细胞侵袭能力。结果与未转染细胞(HO-8910PM)和pcDNA30空质粒转染细胞(HO-8910PM-vect)相比,BRMS1基因转染细胞(BRMS1.c2)侵袭穿透Matrigel基质膜的细胞数降低70.6%(P<0.001)。结论BRMS1基因能抑制卵巢癌细胞HO-8910PM的侵袭能力,为进行卵巢癌基因治疗提供了实验依据。     

转移抑制基因BRMS1对卵巢癌细胞侵袭能力的影响

目的研究转移抑制基因BRMS1对高转移性人卵巢上皮癌细胞(HO-8910PM)侵袭能力的影响.方法脂质体介导将重组真核表达质粒pcDNA3.0-BRMS1转染HO-8910PM细胞;RT-PCR检测转染前后细胞中BRMS1mRNA的表达;Boyden小室法检测细胞侵袭能力.结果与未转染细胞(HO-8910PM)和pcDNA3.0空质粒转染细胞(HO-8910PM-vect)相比,BRMS1基因转染细胞(BRMS1.c2)侵袭穿透Matrigel基质膜的细胞数降低70.6%(P<0.001).结论BRMS1基因能抑制卵巢癌细胞HO-8910PM的侵袭能力,为进行卵巢癌基因治疗提供了实验依据.     

RNA干扰对VEGF在人卵巢癌细胞中表达及细胞增殖的影响

目的:探讨小发夹RNA(shRNA)载体介导抑制人卵巢癌细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达和对卵巢癌细胞增殖的影响.方法::采用脂质体介导的方法将抗VEGF小发夹状双链RNA真核基因表达载体转染到人卵巢癌细胞(HO-8910)中,用G418 筛选获得阳性克隆.用Western印迹法、RT-PCR检测VEGF基因在卵巢癌细胞中的表达;通过MTT及细胞周期分析观察其对卵巢癌细胞增殖的影响. 结果:转染特异性小发夹RNA质粒表达载体的HO-8910细胞中VEGF表达量明显减少;HO-8910细胞生长减慢,阻滞于G1期的增多,S期细胞减少.结论:VEGF小发夹RNA质粒载体可显著抑制HO-8910细胞中的VEGF基因的表达,抑制卵巢癌细胞的增殖,该研究为应用RNAi进行肿瘤的基因治疗提供了实验依据.     

pten基因重组腺病毒对卵巢癌细胞生长的抑制作用

目的:观察携带野生型pten基因的重组腺病毒(Ad-pten)体外转染高转移卵巢癌HO-8910PM细胞后的表达,并研究其对卵巢癌细胞抑制增殖、诱导凋亡和抑制迁移的作用.方法:利用Ad-Easy腺病毒载体系统构建Ad-pten,体外转染高转移卵巢癌HO-8910PM细胞,荧光显微镜检测Ad-pten的转染效率. Western印迹检测pten在HO-8910PM细胞中的表达;MTT实验观察pten对细胞生长的影响;HE染色法观察外源性pten基因表达对细胞形态学的影响;细胞划痕实验观察pten对细胞迁移的抑制作用;Hoechest33258凋亡染色检测pten基因对HO-8910PM细胞凋亡的诱导作用.结果:外源性野生型pten基因经腺病毒介导成功转入HO-8910PM细胞,Western印迹检测出有PTEN蛋白的表达,当感染复数MOI为100时,体外转染效率高达90%以上. pten显著抑制HO-8910PM细胞增殖、诱导其凋亡并能抑制其迁移.结论:重组腺病毒是高效的基因转移系统,能将pten目的基因高效地转移到高转移卵巢癌HO-8910PM细胞中,对细胞产生强有力的生长抑制及凋亡诱导作用,并能抑制其迁移.     

RNAi技术沉默PTHrP基因的表达诱导软骨肉瘤细胞凋亡的实验研究

目的 研究甲状旁腺相关蛋白(parathyroid hormone-related protein,PTHrP)对软骨肉瘤细胞增殖的影响.方法 本实验设置空白对照组、空质粒组和siPTHrP转染组,每组样本数均为6.空白对照组不做处理;分别将空质粒pSilencer3.1 H1 neo(空质粒组)和重组质粒pSilencer3.1H1 neo-siPTHrP(siPTHrP转染组)转染至SW1353软骨肉瘤细胞株,通过MTT法检测各组细胞活力并绘制细胞生长曲线,利用流式细胞技术测定细胞凋亡率,半定量RT-PCR和Western blotting法检测PTHrP基因在mRNA水平及蛋白水平表达上的变化.结果 siPTHrP转染组的细胞生长较空白对照组软骨肉瘤细胞明显缓慢;siPTHrP转染组细胞凋亡率明显升高;重组质粒pSilencer3.1H1 neo-siPTHrP能明显抑制软骨肉瘤细胞的PTHrP基因在mRNA转录水平和蛋白水平上的表达.结论 重组质粒pSilencer3.1H1 neo-siPTHrP可明显抑制软骨肉瘤细胞增殖及其内源基因PTHrP在mRNA转录水平和蛋白水平的表达,为PTHrP介导的软骨肉瘤基因沉默疗法提供了理论基础.     

熊果酸对卵巢癌细胞HO-8910PM侵袭转移的影响

目的 探讨熊果酸对人高转移卵巢癌细胞HO-8910PM侵袭转移的影响及其可能的机制.方法 以不同浓度的熊果酸处理高转移卵巢癌细胞HO-8910PM后,采用MTT法检测其对细胞的生长抑制作用,应用Transwell小室进行人工重组基底膜侵袭和运动实验,观察熊果酸对HO-8910PM细胞侵袭和转移的影响,明胶酶谱法检测HO-8910PM细胞基质金属蛋白酶-2、-9(MMP-2、MMP-9)的活性变化,Westen blot方法检测细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达变化.结果 熊果酸处理后卵巢癌细胞生长受到抑制,且作用呈时效、量效依赖关系,熊果酸能抑制卵巢癌细胞HO-8910PM侵袭和运动能力,各实验组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01,P＜0.05);熊果酸能抑制卵巢癌细胞HO-8910PM明胶酶活性(P＜0.01),抑制卵巢癌HO-8910PM细胞MMP-2和MMP-9蛋白表达,各实验组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 熊果酸能抑制卵巢癌细胞侵袭和转移,其机制可能与抑制MMP-2和MMP-9酶活性和蛋白表达有关.     

CXCL12/CXCR-4对卵巢癌高低转移细胞的作用机制探讨

目的探讨趋化因子CXCL12及其受体CXCR-4对人卵巢浆液性囊腺癌高低转移细胞株HO-8910PM及HO-8910增殖、迁移作用的差异。方法采用流式细胞术分析HO-8910PM及HO-8910细胞中CD44、CD49e、E-cad-herin的表达差异;RT-PCR检测CXCR-4在HO-8910PM及HO-8910细胞中的转录水平差异;比较不同浓度CXCL12对HO-8910PM及HO-8910细胞增殖、迁移能力及对其表面相关黏附分子表达水平的影响。结果流式细胞术检测显示HO-8910PM及HO-8910细胞均表达CD44（97.6%vs 96.2%）,E-cadherin在前者不表达（6.5%）,后者高表达（92.5%）;CXCR-4在HO-8910PM中高表达（93.3%）,在HO-8910中不表达（5.7%）;CXCL12上调HO-8910PM中CD49e的表达（27.6%vs 83.2%,P〈0.05）,并且可促进细胞的增殖和移行。结论趋化因子CXCL12及其受体CX-CR-4在卵巢癌的增殖及侵袭转移中具有重要作用。     

miRNA-200c在上皮性卵巢癌细胞株及肿瘤组织中的表达变化及意义

目的观察上皮性卵巢癌细胞株及肿瘤组织microRNA-200c(miR-200c)的表达水平,探讨其可能的临床价值。方法采用Real-time RT-PCR技术比较人卵巢癌母细胞系(HO-8910)、卵巢癌高转移能力变异细胞株(HO-8910PM)及HO-8910细胞团簇中miR-141、miR-200c的表达差异。同法测定上皮性卵巢癌(n=83)、交界性卵巢肿瘤(n=13)及正常卵巢组织(n=8)中miR-141、miR-200c的表达,并分析卵巢癌不同临床病理特征下二者的表达差异。结果与HO-8910、HO-8910PM相比,HO-8910细胞团簇中miR-200c表达下调(P<0.05);正常卵巢组织、卵巢交界性肿瘤、卵巢癌中miR-141、miR-200c表达依次上调(P<0.05)。转移性卵巢癌、低分化卵巢癌及透明细胞卵巢癌中miR-200c表达下调(P<0.05)。miR-200c高表达患者预后优于miR-200c低表达者(P<0.05)。结论 miR-200c表达下调与卵巢癌进展相关,可能提示卵巢癌预后不良。     

Gene expression profile differences in high and low metastatic human ovarian c ancer cell lines by gene chip

目的：用基因芯片技术研究高低转移人卵巢癌细胞系（HO-8910PM和HO-8910）基因表达谱差异,筛选与转移相关的基因。方法：按一步法分别抽提高低转移人卵巢癌细胞和对照正常卵巢组织的总RNA并纯化mRNA;分别将等量的高低转移人卵巢癌细胞及对照组织的mRNA逆转录合成以Cy5和Cy3标记的cDNA一链做探针,分别混合后在2张含有4096条双点人类全长基因的芯片上进行杂交。经洗片后用ScanArray3000扫描仪扫描芯片荧光信号图像,用ImaGene3.0软件对扫描图像进行数字化处理,计算机分析高低转移人卵巢癌细胞系之间及与正常卵巢上皮基因表达谱差异。结果：人卵巢癌细胞系HO-8910细胞与正常卵巢上皮比较差异3倍以上共有355个基因。高转移人卵巢癌细胞系HO-8910PM细胞与正常卵巢上皮比较差异3倍以上共有323个基因。高转移人卵巢癌细胞系HO-8910PM与母系HO-8910比较差异2倍以上共有165个基因,其中两株细胞系比较差异3倍以上共有21个基因。结论：两株人卵巢癌细胞系与正常卵巢上皮细胞基因表达谱存在差异,提示这些基因与卵巢癌的发生和发展及高转移特性有关。本实验说明利用基因芯片对基因表达谱的检测可以为人体卵巢癌的基因诊断、治疗和预防提供新的方向。     

姜黄素对人卵巢癌细胞株HO-8910增殖和凋亡的影响

目的:探讨姜黄素对体外培养人卵巢癌HO-8910细胞增殖和凋亡的影响。方法:选用人卵巢癌细胞株HO-8910进行体外培养至对数生长期,以0~80μmol/L姜黄素(5μmol/L,10μmol/L,20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L)分别处理HO-8910细胞24、48、72h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验测定细胞的生长抑制率;流式细胞仪检测不同浓度药物对细胞凋亡率的影响;免疫组化法检测PCNA在细胞中的表达,评价细胞的增殖状态。结果:姜黄素对HO-8910细胞增殖抑制率随药物浓度增加及作用时间延长有升高趋势,呈时间剂量依赖性。姜黄素作用24h随浓度的升高PCNA阳性表达逐渐降低。流式细胞仪分析证实随着浓度的升高细胞凋亡率和膜受损率均提高。结论:姜黄素对人卵巢癌细胞株HO-8910的生长有显著的抑制作用,并能诱导其凋亡。     

转FasL基因卵巢癌HO-8910细胞系的建立

目的建立表达转FasL基因卵巢癌细胞系,为以FasL为靶点治疗卵巢癌提供理想细胞模型。方法应用分子克隆技术,将人FasL cDNA片段正向插入逆转录病毒载体pLXSN构建重组质粒pL(hFasL)SN,转染包装细胞PA317收获假病毒上清,磷酸钙法转染卵巢癌HO-8910细胞筛选建系,酶切PCR鉴定、流式细胞仪(FCM)法检测。结果酶切鉴定证实重组质粒pL(hFasL)SN中存在FasL,PCR方法从转染细胞HO-8910-FasL基因组中扩增出0．86kb片段,FCM检测显示FasL表达增加40．32％,HL-60细胞与HO-8910-FasL细胞共培养HL-60细胞凋亡增加25．65％。结论应用逆转录病毒法建立了稳定高表达FasL并具功能的HO-8910-FasL细胞系。     

地塞米松抑制人卵巢癌细胞HO-8910增殖的分子机制:RhoB信号通路的作用

目的 观察地塞米松（Dex）对人卵巢癌细胞HO-8910增殖的影响,探讨小G蛋白RhoB信号通路在其中的作用.方法四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）和软琼脂实验检测细胞的增殖;RT-PCR法检测RhoB mRNA的表达;Western印迹检测RhoB及其上下游信号分子磷酸化Akt（p-Akt）、p21^cip1/waf1和p27蛋白质的表达;报告基因技术检测p21^cip1/waf1基因的转录.结果Dex可以明显抑制HO-8910细胞锚依赖性和非依赖性方式的增殖,100 nM Dex处理细胞6 d,抑制率为31%.100nM Dex处理细胞可以明显上调RhoB mRNA和蛋白质的表达（为对照的2.5倍）;同时伴有p-Akt蛋白质表达的降低（24 h时约为对照的50%）、p27蛋白质表达的增加（36 h时比对照增加了3.3倍）以及p21^cip1/waf1转录和蛋白质表达增多（24h时约为对照的1.7倍）.RhoB过表达可以降低细胞的生长速度,并能增强Dex的增殖抑制作用（100 nM Dex处理6 d,抑制率为44%）;而RhoB表达阻断后可逆转Dex的这一效应（抑制率约为13%）.结论Dex抑制HO-8910细胞增殖的机制可能与抑制PI3K/p-Akt信号,从而上调RhoB蛋白质,使RhoB下游信号分子p21^cip1/waf1和p27蛋白质表达增加有关.     

三苯氧胺联合顺铂抑制人卵巢癌细胞HO-8910增殖的实验研究

目的:研究三苯氧胺(TAM)和顺铂(DDP)对人卵巢癌细胞生长的影响,验证两种药物联合应用治疗人卵巢癌的有效性。方法:以体外培养的人卵巢癌HO-8910为研究对象,不同剂量的TAM和DDP联合作用于人卵巢癌细胞HO-8910,用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法检测细胞生长抑制率,用免疫组化SABC法检测增殖细胞核抗原(PCNA)在细胞中的表达。结果:TAM和DDP联合用药组与单用DDP组相比,大剂量TAM5.0μmol/L合用DDP及中剂量TAM1.0μmol/L合用大剂量DDP3.3μmol/L细胞生长抑制率有显著性差异(P<0.05);TAM浓度(≥1.0μmol/L)合用DDP时PCNA阳性率有显著差异(P<0.05)。结论:TAM和DDP联合用可有效抑制HO-8910细胞生长及增殖。     

噬菌体展示技术筛选卵巢癌细胞表面转移相关分子结合肽

目的：利用噬茵体7肽库筛选高转移潜能卵巢癌细胞株HO-8910PM表面转移相关分子结合肽。方法：利用噬茵体展示技术体外快速差减筛选（biopanning and rapid analysis of selective inter-activeligands,BRASIL）卵巢癌细胞株HO-8910和HO-8910PM,经过连续5轮生物淘洗,随机挑选14个噬茵体单克隆进行DNA测序,并进行ELISA、噬茵体竞争结合实验验证阳性噬茵体的亲和性。结果：噬菌体克隆Z3（短肽LRLRNTR）对高转移潜能卵巢癌细胞株HO-8910PM有较高的亲和性。结论：噬茵体展示技术筛选的短肽LRLRNTR可望为卵巢肿瘤早期诊断、转移复发及治疗提供新的方向。