肿节风注射液对荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖活力及NK细胞活性的影响

目的研究肿节风注射液(ZJF)对荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖活力及NK细胞活性的影响,探讨其抗肿瘤作用的机制。方法无菌取C57BL/6纯系小鼠脾脏,制成5×106个/ml的单个脾细胞悬液,MTT法检测不同浓度(50、25、12.5、6.25和3.13 mg/ml,以生药量计)的ZJF对正常小鼠T淋巴细胞增殖的影响。将近交系615小鼠经左腋皮下注射小鼠前胃癌Fc细胞(1×106个/ml,0.2 ml/只),复制荷瘤小鼠模型,并随机分成5组:ZJF低、中、高剂量组(给药剂量分别为2、10、20 mg/kg,以生药量计)、CTX组[0.3 g/(kg·3 d)]及阴性对照组(生理盐水0.1 ml/10 g),MTT法检测ZJF对荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖及NK细胞活性的影响。结果 ZJF可显著促进正常小鼠T淋巴细胞的增殖(P<0.05),且呈剂量依赖性;ZJF低、中、高剂量组荷瘤小鼠T淋巴细胞的增殖活力明显高于阴性对照组(P<0.05),且呈剂量依赖性,ZJF中、高剂量组荷瘤小鼠NK细胞的活性明显高于阴性对照组(P<0.05)。结论 ZJF可促进正常小鼠与荷瘤小鼠T淋巴细胞的增殖活力,增强NK细胞活性,为其抗肿瘤作用机制的研究提供了实验依据。     

BCG-CpG-DNA免疫活性作用的初步研究

目的研究BCG-CpG-DNA的免疫学活性。方法通过淋巴细胞增殖、T细胞亚群分析、细胞因子产生、对NK细胞杀伤功能影响等试验,检测BCG-CpG-DNA的免疫活性。结果BCG-CpG-DNA能促进小鼠T、B淋巴细胞增殖,活化巨噬细胞分泌IL-12,并能增强ConA诱导IFN-γ产生,提高小鼠脾细胞中CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群的含量,同时增强小鼠NK细胞的杀伤活性。实验组与对照组所有结果差异均有显著意义(P<0.05)。结论BCG-CpG-DNA能活化抗原呈递细胞(APC),并具有较好的免疫活性。     

正交试验法优选四君子汤的提取工艺

目的:优化四君子汤口服液的水提工艺,对有效成分党参炔苷进行含量测定。方法:采用L_9(3~4)正交试验优化提取工艺。采用高效液相色谱法测定党参炔苷的含量,色谱柱为C18柱(250×4.6mm,5μm),流动相为乙腈-水(25:75),流速为1.0mL/min,检测波长为268nm,柱温为25℃,进样量为10μL。结果:党参炔苷进样浓度在0.0192～0.04800mg/mL时线性关系良好。结论:采用正交试验法得到了四君子汤最优提取工艺为浸泡时间120min,用水量为12倍,煎煮时间为1.5h,煎煮次数为3次。     

含CpG基序寡核苷酸对rHBsAg免疫小鼠脾脏组织及细胞增殖的影响

目的探讨合成含CpG基序的寡核苷酸(CpGODN)与重组乙型肝炎表面抗原(rHBsAg)联合免疫对小鼠脾脏淋巴组织及细胞增殖的影响。方法经后腿胫骨前肌初次免疫BALB/c小鼠,2周后加强免疫1次;常规石蜡切片,H-E染色,观察脾脏组织学改变;3H-TdR掺入法检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应。结果抗原+CpG组脾脏可见明显的组织学改变。加CpG与不加CpG的2组比较,淋巴细胞增殖反应显著增强。结论CpGODN能够有效刺激小鼠脾脏组织T细胞区淋巴细胞增生,生发中心明显增大,而且能够显著增强淋巴细胞增殖反应。     

山奈酚对小鼠迟发型超敏反应的免疫抑制作用

目的探讨山奈酚(kaempferol,KA)对二硝基氟苯(dinitrofluorobenzene,DNFB)诱导的小鼠迟发型超敏反应(delayed type hypersensitivity,DTH)的免疫抑制作用。方法将BALB/c小鼠按体重随机分为6组:生理盐水对照组、DTH模型组、环磷酰胺(cytoxan,CTX)组(20 mg/kg)、KA低剂量(2 mg/kg)、中剂量(4 mg/kg)、高剂量(8 mg/kg)组,每组10只,用DNFB致敏,同时给药,连续给药7 d。致敏后第5天于小鼠右耳背涂1%DNFB 5μl诱发DTH,左耳涂等量的丙酮/橄榄油溶剂作为对照。连续给药7 d后,称量小鼠体重及脾脏和胸腺湿重,计算脾脏指数和胸腺指数;DNFB激发后48 h,剪下小鼠左右耳廓,称重,计算小鼠耳廓肿胀度,并将剪取的右耳耳廓制成冰冻切片,光学显微镜下观察小鼠耳廓局部组织的病理变化;无菌取脾,制备脾细胞,MTT法检测经ConA刺激的脾淋巴细胞的增殖活力。结果 KA高剂量组能显著降低DTH小鼠的脾脏指数和胸腺指数(P<0.01或P<0.05);KA中、高剂量组能明显抑制DNFB所诱发的小鼠耳廓肿胀度(P<0.05或P<0.01);KA能明显减少DTH小鼠耳廓局部组织淋巴细胞的浸润,并抑制脾脏淋巴细胞的增殖(P<0.05或P<0.01)。结论 KA对DTH小鼠具有明显的免疫抑制作用,抑制淋巴细胞的增殖可能是其作用机制之一。     

西洋参皂甙对免疫抑制小鼠免疫功能的影响

目的探讨西洋参皂甙对免疫抑制小鼠免疫功能的影响。方法用不同浓度的西洋参皂甙[0.12、1.20和12 g/(kg.d)]灌胃小鼠,每天1次,连续灌胃21 d,第10～14天,经腹腔注射环磷酰胺0.1 g/(kg.d)。测定小鼠血中血小板(PLT)、白细胞(WBC)、红细胞(RBC)的数量和血红蛋白(Hb)含量以及免疫器官重量;鸡红细胞吞噬试验检测小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能,并进行二硝基氟苯(2,4-D)皮肤试验(DTH);体外测定小鼠腹腔巨噬细胞和脾淋巴细胞的增殖活性、腹腔巨噬细胞NO含量以及脾淋巴细胞转化功能。结果西洋参皂甙可使免疫抑制小鼠血中的PLT、WBC、RBC和Hb的降低恢复良好,并恢复小鼠免疫器官重量,2,4-D所致迟发型超敏反应减轻,促进小鼠腹腔巨噬细胞代谢,增强巨噬细胞吞噬功能,诱导巨噬细胞产生NO,提高脾淋巴细胞转化率及淋转指数。结论西洋参皂甙能提高免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬功能,增强小鼠细胞免疫与体液免疫功能。     

皮下植入医用几丁糖对大鼠免疫系统的影响

目的探讨经大鼠腹部皮下植入医用几丁糖对其免疫系统的影响。方法将96只Wistar大鼠随机分为医用几丁糖高剂量组(5 ml)、低剂量组(1 ml)、假手术组(5 ml无菌生理盐水)、空白对照组(未处理)、免疫抑制组(取材前连续4 d经大鼠腹腔注射环磷酰胺)和免疫刺激组(取材前12 h单次腹腔注射脂多糖),根据考察周期将每组16只大鼠再随机分为1、4、8和12周4个实验操作小组。对大鼠以下指标进行检测:免疫器官系数、免疫器官组织病理学观察、NK细胞杀伤活性、T淋巴细胞亚群分析和T/B淋巴细胞增殖情况。结果医用几丁糖植入后1、4、8和12周,医用几丁糖高剂量组及低剂量组大鼠的免疫器官系数、NK细胞杀伤活性、T淋巴细胞亚群分析、T/B淋巴细胞增殖的结果与假手术组和空白对照组比较,差异均无统计学意义(P0.05),免疫器官组织病理学观察未见异常;免疫抑制组大鼠的免疫器官系数、NK细胞杀伤活性、T淋巴细胞亚群分析、T/B淋巴细胞增殖的结果与其他各组比较,差异均有统计学意义(P0.05),免疫器官组织病理学观察可见淋巴细胞数目大量减少等免疫抑制现象;免疫刺激组大鼠的脾脏系数、T淋巴细胞亚群分析、T淋巴细胞增殖的结果与其他各组比较,差异均有统计学意义(P0.05),免疫器官组织病理学观察可见淋巴细胞数目大量增多等免疫刺激现象。结论经大鼠腹部皮下植入医用几丁糖后,未对其免疫系统产生明显影响。     

循环应用低剂量环磷酰胺对黑色素瘤荷瘤小鼠调节性T细胞的影响及抗瘤作用

目的观察循环应用低剂量环磷酰胺(CTX)对黑色素瘤荷瘤小鼠调节性T细胞(Treg)的影响及抗瘤作用。方法通过皮下接种黑色素瘤细胞B16制备黑色素瘤荷瘤小鼠模型;对荷瘤小鼠分别经腹腔单次或循环注射CTX,每隔7d给药1次,共3次,应用流式细胞术检测小鼠脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg的含量;培养小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC),将DC与脾T淋巴细胞混合培养,应用ELISA法检测脾T淋巴细胞干扰素γ(IFNγ)的分泌量;同时测量肿瘤的大小,绘制肿瘤生长曲线,并观察各组荷瘤小鼠自身免疫病的发生情况。结果CTX的最佳应用剂量为100mg/kg。随着荷瘤时间的延长,荷瘤小鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+/CD4+的比值呈逐渐升高趋势。单次应用CTX抑制Treg的时间较短,而循环应用CTX能够延长对Treg的抑制,使其维持在相对较低的水平;循环应用CTX显著提高了荷瘤小鼠脾T淋巴细胞IFNγ的分泌水平。单次和循环应用CTX均未能延缓肿瘤的生长,两组小鼠均未见免疫性白斑及明显的化疗毒副反应。结论循环应用CTX能更加有效地调控Treg,从而促进DC对T淋巴细胞的抗原特异性激活,这将会提高DC疫苗的抗瘤效果。     

西洋参根多糖对免疫抑制小鼠免疫功能的影响

应用环磷酰胺引起免疫抑制小鼠模型，观察了西洋参根多糖（PQRP）对其免疫功能的影响。结果表明，PQRP不仅能抗免疫抑制小鼠外周血白细胞减少、胸腺和脾脏重量的减轻，并能增强正常和免疫抑制小鼠网状内皮系统的吞噬功能；可明显促进免疫抑制小鼠牌淋巴细胞转化，并提高白细胞介素－2活性。提示PQRP可作为一种新的免疫调节剂。     

透明质酸的氧化降解及其体外免疫调节活性探究

通过抗坏血酸(Vc)、过氧化氢(H_2O_2)以及氯化铜(CuCl_2)氧化体系产生羟自由基(oOH),研究了该自由基对透明质酸(HA)的降解作用,得到低分子量透明质酸(LMWHA)。LMWHA经过乙醇沉淀和层析柱纯化后,通过高效凝胶过滤色谱法(HPGFC)测得其分子量为1.302×105Da。同时运用体外细胞实验探索了LMWHA的免疫调节活性,结果表明LMWHA具有增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性以及一氧化氮合酶(iNOS)活性,并提高一氧化氮(NO)的生成量,促进了脾脏T淋巴细胞的增殖,由此可见LMWHA能够调节小鼠的免疫功能。     

人肝再生增强因子对人外周血单个核细胞增殖的影响及其机制

目的探讨人肝再生增强因子(hALR)对人外周血单个核细胞(PBMC)增殖的影响及其机制。方法梯度离心分离PBMC,将细胞分为正常对照组、刀豆蛋白A(ConA)(5mg/L)组和ConA(5mg/L)+hALR(30mg/L)组,分别培养10min、30min、1h、2h、4h后,MTT法检测各组各时间点细胞增殖水平,钙荧光指示剂法检测细胞内游离Ca2+浓度的变化,Western blot法检测细胞内胞外信号调节激酶(ERK)的磷酸化程度。结果4h内,各组细胞的增殖水平差异无统计学意义,但ConA组细胞增殖水平已表现出逐渐升高的趋势。正常对照组细胞内Ca2+浓度在加入Fluo-3/AM后2h达高峰,ConA组1h达高峰,ConA+hALR组10min达高峰。正常对照组细胞内磷酸化的ERK随培养时间的延长而逐渐减少;ConA组细胞内磷酸化的ERK在30min达高峰,之后逐渐降低;ConA+hALR组细胞内磷酸化的ERK在2h前明显低于ConA组。结论hALR可能通过影响细胞内Ca2+浓度的变化峰值和磷酸化的ERK,来抑制人PBMC的免疫功能,从而影响其增殖。     

皮内注射用布氏菌活疫苗的免疫学评价

目的探讨布氏菌活疫苗皮内注射小鼠产生的体液免疫、细胞免疫应答及免疫保护力。方法将30只小鼠随机分为3组,每组10只,分别为低剂量组(5×107个/只)、高剂量组(2×108个/只)和生理盐水对照组,3组均经后肢皮内注射布氏菌活疫苗,0.1 ml/只。免疫4周后,摘眼球取血,分离血清,制备脾脏淋巴细胞,ELISA法检测小鼠血清中抗Br-PPD Ig G抗体效价;ELISPOT法检测分泌IFNγ、IL-4的脾脏淋巴细胞数;ELISA法检测体外再刺激后小鼠脾脏淋巴细胞分泌的IFNγ水平;流式细胞术对T细胞亚群进行分类。用羊布氏菌M5弱毒株攻击免疫小鼠,通过脾脏荷菌量评价布氏菌活疫苗的免疫保护作用。结果低、高剂量组小鼠血清中抗Br-PPD Ig G抗体效价均较高,几何平均滴度分别为642和557;低、高剂量组小鼠在Br-PPD抗原刺激下,分泌IFNγ、IL-4的脾脏淋巴细胞数以及脾脏淋巴细胞分泌的IFNγ含量,与对照组相比差异均有统计学意义(P均<0.05);CD4+IFNγ+、CD4+IL-4+比例均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P均<0.05);低、高剂量组小鼠脾脏荷菌量为0,对照组小鼠为(5.13±0.16)log10 CFU。结论采用皮内注射布氏菌活疫苗的方式免疫小鼠后,能获得较强的体液免疫、细胞免疫应答及免疫保护力。     

布氏菌活疫苗滴鼻免疫小鼠的免疫学评价

目的评价布氏菌活疫苗滴鼻免疫小鼠后黏膜、体液及细胞免疫的效果。方法将60只小鼠随机分为低剂量组(5×107个/只)、高剂量组(3×108个/只)和阴性对照组(生理盐水),均于小鼠清醒状态下进行滴鼻免疫布氏菌活疫苗,剂量为10μl/只(5μl/鼻孔)。免疫30 d后,分离血清,制备脾脏淋巴细胞及肺泡灌洗液。间接ELISA法检测免疫小鼠血清中Ig G抗体效价、肺泡灌洗液中Ig G、Ig A抗体效价及体外再刺激后小鼠脾细胞分泌IFNγ、IL-4水平;ELISPOT法检测分泌IFNγ、IL-4的脾脏淋巴细胞数目;流式细胞术检测T细胞亚群分类。用羊布氏菌弱毒株M5经皮下和滴鼻两种途径攻击免疫小鼠,通过脾脏细菌计数评价布氏菌活疫苗的免疫保护作用。结果低剂量组和高剂量组小鼠血清中Ig G抗体效价及小鼠肺泡灌洗液中的Ig G、Ig A差异无统计学意义(P0.05);低剂量组和高剂量组小鼠在Br-PPD抗原和灭活菌体抗原刺激下,分泌IFNγ的脾脏淋巴细胞数、体外再刺激后小鼠脾细胞分泌IFNγ的水平及脾淋巴细胞中CD4~+IFNγ~+细胞比例均明显高于阴性对照组(P0.05);攻毒试验结果表明,布氏菌活疫苗具有良好的保护力。结论布氏菌活疫苗经滴鼻免疫小鼠后可获得良好的免疫效果和保护力。     

结核菌H37Ra在小鼠体内诱导的免疫应答

目的检测结核菌H37Ra免疫小鼠后产生的特异性细胞免疫和体液免疫应答水平。方法将BALB/c小鼠随机分为H37Ra组、BCG组和生理盐水(NS)组,分别进行免疫,免疫8周后处死小鼠,分离血清,ELISA间接法测定血清特异性抗PPDIgG抗体的水平,流式细胞分析仪检测脾脏T淋巴细胞亚群的变化。脾淋巴细胞经体外培养、PPD刺激后,MTT法检测脾淋巴细胞的刺激指数,ELISA法检测培养上清液中IFN-γ和IL-4的水平。结果H37Ra免疫小鼠血清中抗PPDIgG抗体、脾脏CD3+T细胞和CD4+T细胞的百分率、脾淋巴细胞刺激指数、IFN-γ和IL-4水平均显著高于NS对照组,但与BCG组差异无显著意义。各组间脾脏CD8+T细胞、CD4+T/CD8+T比值差异均无显著意义。结论H37Ra免疫小鼠后,可以产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答,有望成为结核疫苗的候选抗原。     

不同产地不同部位巫山淫羊藿中黄酮的HPLC分析

建立HPLC梯度洗脱法同时测定巫山淫羊藿中3种黄酮:淫羊藿次苷Ⅰ,朝藿定C和淫羊藿苷质量分数的方法。采用HPLC法,色谱柱为phenomenex C18分析柱(5μm,4.6 mm×250 mm);流动相为(A)水,(B)乙腈;柱温35℃;流速1.0 mL/min;检测波长270 nm;线性梯度洗脱条件:B∶15%(5 min),B∶30%(10 min),B∶50%(30 min)。本方法测定淫羊藿次苷Ⅰ,朝藿定C和淫羊藿苷的线形范围在0.20—1.80μg,r=0.999 3,r=0.999 9和r=0.999 7;平均回收率分别为98.43%,97.58%和97.91%,RSD(n=3)分别为2.16%,1.77%和1.90%。该方法简便、准确、重现性好,可作为同时测定淫羊藿次苷Ⅰ,朝藿定C和淫羊藿苷质量分数的方法。     

煎煮时间对白芍6种成分含量影响的研究

目的:考察煎煮时间对白芍水提液中6种成分含量的影响,探讨煎煮时间与白芍内在质量的关系。方法:采用高效液相色谱法测定白芍不同时间煎煮液中没食子酸、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酸、1,2,3,4,6-O-没食子酰葡萄糖的含量。结果:煎煮时间对没食子酸、苯甲酸、1,2,3,4,6-O-没食子酰葡萄糖含量影响较大,随煎煮时间的延长3个成分的含量不断升高,分别升高4.36倍、12.13倍、1.38倍;芍药内酯苷、芍药苷的含量较稳定;儿茶素的含量先升后降,下降18.31%。结论:可通过调整煎煮时间来控制白芍提取液中有效成分的含量,发挥不同作用。     

HPLC法测定不同产地半枝莲中野黄芩苷的含量

采用高效液相色谱技术,测定不同产地半枝莲中野黄芩苷的含量。采用Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,乙腈(A)-水溶液(0.1%醋酸,B)为流动相,梯度洗脱(0~60 min,5%~30%A;60~70 min,30%~100%A),流速1.0 m L/min,柱温30℃,检测波长335 nm,进样量20μL。结果不同产地半枝莲中野黄芩苷的含量分别为江西1.08%、河南0.74%、湖南1.06%、四川0.61%、江苏0.91%、山东1.66%、河北0.39%、安徽0.54%。本实验所建立的方法简单、准确,能为评价半枝莲的内在质量提供一定的依据。     

枸杞多糖对亚健康小鼠免疫功能及抗疲劳作用的影响

目的探讨枸杞多糖对亚健康小鼠机体免疫功能及抗疲劳作用的影响及其作用机制。方法采用复合因素建立亚健康小鼠模型,随机分为模型组、枸杞多糖高剂量组(400 mg/kg体重)和低剂量组(200 mg/kg体重),另设对照组(未建模),经小鼠灌胃给药,每天1次,灌胃21 d,对照组和模型组给予等量蒸馏水。对建模小鼠进行行为学评价;检测各组小鼠的免疫功能(脾脏和胸腺指数、T和B淋巴细胞增殖能力及CD4+/CD8+值)和抗疲劳能力(游泳力竭时间、下丘脑5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)和多巴胺(Dopamine,DA)含量及海马区谷氨酸受体NR2A m RNA表达水平)。结果模型小鼠体重、自主活动次数、挣扎时间及游泳力竭时间明显低于对照组(P0.05),避暗穿梭次数明显高于对照组(P0.05)。模型组小鼠的胸腺、脾脏指数、B淋巴细胞增殖能力、CD4+/CD8+值、游泳力竭时间、下丘脑DA含量及海马区NR2Am RNA的表达均显著低于对照组(P0.05),5-HT含量明显高于对照组(P0.05);枸杞多糖高剂量组小鼠胸腺指数、脾脏指数、B淋巴细胞增殖能力、CD4+/CD8+值、游泳力竭时间、下丘脑DA含量及小鼠海马NR2A m RNA的表达均显著高于模型组(P0.05),且5-HT含量明显低于模型组(P0.05);各组间T细胞增殖能力无明显变化。结论成功建立亚健康小鼠模型,枸杞多糖可提高亚健康模型小鼠的免疫功能及抗疲劳作用,为枸杞多糖的临床应用提供了实验依据。     

甲壳素高脱乙酰基反应的研究

以自制甲壳素为原料,探讨了不同的反应方式(搅拌、不搅拌、连续法、间歇法),对不同粒径大小(约15×15mm2,5×5mm2,1.5×1.5mm2)的甲壳素的脱乙酰基反应的影响因素:浓度、反应时间、反应温度、投料比等进行了实验研究.结果表明,在140℃、45%NaOH水溶液、30min间歇反应3次,即可得到99%以上的高脱乙酰度的壳聚糖.     

白细胞滤板中T淋巴细胞的分离培养及其免疫原性

目的从成份血浆除白细胞过滤板中分离T淋巴细胞,并检测其免疫原性。方法以白细胞过滤板为原料,从白细胞滤板中分离培养T淋巴细胞,计数单核细胞数量,并检测细胞活力。去除细胞中的红细胞和血小板,纯化后,对T淋巴细胞进行诱导、分化和培养,并检测其对猪的免疫原性。结果从每个白细胞滤板中平均可分离3.94×107个单核细胞,细胞平均存活率达93.18%。纯化后T淋巴细胞在体外增殖培养8~10 d处于增殖高峰期,14 d后达平衡期;增殖倍数最高可达100倍,平均为38.5倍。用分离的淋巴细胞免疫猪后,具有较强的免疫反应,致1头猪死亡;E玫瑰花抑制试验显示,有1头猪合格;淋巴细胞毒试验结果显示,有1头猪合格。结论成份血浆除白细胞过滤板中能分离培养T淋巴细胞,初步分离培养的淋巴细胞可产生免疫原性,但结果并不理想,其免疫条件和检测方法有待进一步优化。本研究为今后用分离培养的淋巴细胞制备猪抗人淋巴细胞免疫血浆提供了参考。