氢气对野生型及Nrf2 基因敲除型脓毒症小鼠血脑屏障损伤和认知功能障碍的影响

目的:探讨H2是否通过Nrf2信号途径保护血脑屏障(BBB)减轻脓毒症相关脑病(SAE)。方法:将152只雌性野生型(WT)和152只Nrf2基因敲除(Nrf2-/-)C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为假手术组、假手术+氢气组、脓毒症模型组和氢气治疗组。采用盲肠结扎穿刺法(CLP)制备小鼠脓毒症模型,假手术组和假手术+氢气组仅行开腹。假手术+氢气组和氢气治疗组分别在术后1 h和6 h开始吸入2%氢气60min。术后24h,每组随机选取20只小鼠观察并记录各组的7天存活率;每组随机挑选4只小鼠,采用EB外渗法检测BBB损伤程度;每组随机挑选4只小鼠,切取其大脑皮质,采用Western blotting法检测黏附连接蛋白(VE-cadherin)和紧密连接蛋白(ZO-1)的表达水平。于术后4天将每组余下10只小鼠进行连续7天的Morris水迷宫实验,以评价其认知功能。结果:在WT小鼠中,氢气治疗组小鼠的7天存活率为60%,较脓毒症模型组的35%显著提高(P0.01);其血管外EB外渗量为[(3.68±0.18)μg/g],较脓毒症模型组[(5.24±0.06)μg/g]显著降低(P0.01);其第6～10天的逃逸潜伏期分别为[(20.86±4.99) s、(15.01±4.43) s、(15.45±4.95) s、(15.81±6.65) s、(12.37±4.15)s],较脓毒症模型组各时点[(41.62±12.94) s、(39.37±12.74) s、(36.95±9.64) s、(34.55±13.57) s、(29.45±9.13) s]显著延长(均P0.01);氢气治疗组穿越平台次数[(4.10±0.99)次]较脓毒症模型组[(1.20±0.79)次]显著增多(P0.01);氢气组治疗组小鼠大脑皮质中VE-cadherin表达水平(0.37±0.02)较脓毒症模型组(0.18±0.01)显著增高(P0.01),ZO-1水平(0.46±0.02)较脓毒症模型组(0.20±0.01)显著增高(P0.01)。以上指标差异在Nrf2-/-小鼠中均无显著差异(均P0.05)。结论:吸入2%氢气可通过Nrf2依赖途径降低微血管内皮通透性来保护BBB,从而降低小鼠SAE发生,改善认知功能。     

氢气对脓毒症小鼠急性肺损伤的影响

目的 评价氢气对脓毒症小鼠急性肺损伤的影响.方法 雄性C57BL/6小鼠112只,体重20～25 g,5周龄,采用随机数字表法,将其随机分为4组(n=28):假手术组(A组)、假手术+氢气组(B组)、脓毒症组(C组)和脓毒症+氢气组(D组).采用盲肠结扎穿孔法(CLP)制备脓毒症模型.B组和D组于CLP或假手术后1、6h时分别吸入2％氢气.每组取20只小鼠,记录CLP后7d内生存情况.每组取8只小鼠,于CLP后24 h时处死,采集静脉血样,取肺组织,测定血清及肺组织超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)及8-异前列腺素F2α(8-iso-PGF2α)水平,测定支气管肺泡灌洗液(BALF)蛋白浓度和肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性,进行肺损伤评分,计算肺湿干重比(W/D).结果 与A组比较,C组生存率、血清和肺组织SOD和CAT活性降低,肺损伤评分、W/D、BALF蛋白浓度、肺组织MPO活性、血清和肺组织8-iso-PGF2α水平升高(P＜0.05);与C组比较,D组生存率、血清和肺组织SOD和CAT活性升高,肺损伤评分、W/D、BALF蛋白浓度、肺组织MPO活性、血清和肺组织8-iso-PGF2α水平降低(P＜0.05).结论 氢气可减轻脓毒症小鼠急性肺损伤,其机制与抑制氧化应激反应有关.     

自噬在氢气减轻脓毒症小鼠心肌损伤中的作用

目的评价自噬在氢气减轻脓毒症小鼠心肌损伤中的作用。方法清洁级健康雄性C57BL/6J小鼠192只, 6～8周, 体质量20～25 g, 采用随机数字表法分为6组(n=32):假手术组(Sham组)、假手术+氢气组(Sham+H2组)、脓毒症组(S组)、脓毒症+氢气组(S+H2组)、脓毒症+巴佛洛霉素组(S+BafA1组)和脓毒症+氢气+巴佛洛霉素组(S+H2+BafA1组)。采用盲肠结扎穿孔(CLP)法制备脓毒症模型。Sham+H2组、S+H2组及S+H2+BafA1组于CLP后1和6 h吸入2%氢气1 h。S+BafA1组和S+H2+BafA1组于CLP后1 h腹腔注射巴佛洛霉素A1 1 mg/kg。每组随机取20只小鼠, 记录CLP后7 d的生存情况。于CLP后24 h处死小鼠, 光镜下观察心肌组织病理学改变, 进行病理学评分, ELISA法检测血清cTnI浓度, 采用Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)和P62表达水平, 计算LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值。结果与Sham组比较, S组生存率降低, 血清cTnI浓度和心肌组织病理学评分升高, 心肌组织P62表达上调...     

髓系细胞触发受体1慢病毒载体对脆弱拟杆菌脓毒症小鼠促炎因子表达的影响

目的 了解髓系细胞触发受体1(TREM-1)基因重组慢病毒短发夹RNA(vshRNA)载体对脆弱拟杆菌脓毒症小鼠促炎因子表达及小鼠存活率的影响.方法 (1)构建TREM-1 vshRNA载体.经实验确定脓毒症小鼠模型制作条件:腹腔注射2.5×10<9CFU/mL灭活脆弱拟杆菌0.5 mL,刺激12 h.(2)115只小鼠按随机数字表法分为健康对照组(3只)和脓毒症模型组、绿色荧光蛋白(GFP)干扰组、TREM-1干扰组、TREM-1半量干扰组.后4组每组28只,先分别经尾静脉注射等渗盐水、GFP vshRNA、TREM-1 vshRNA 2×108TU、TREM-1 vshRNA 1×108TU;1 h后,将该4组小鼠制成脓毒症模型,健康对照组注射等体积等渗盐水.12 h后处死5组小鼠(每组3只),取血检测血浆TNF-α、IL-1β和IL-6含量;取肝组织标本检测TREM-1 mRNA及其蛋白的表达水平.后4组小鼠每组所余25只用于观察腹腔注射后72 h的存活率.(3)另建立脓毒症小鼠模型125只,其中100只分别于腹腔注射后1、2、4、6 h尾静脉注射TREM-1 vshRNA 2×108TU(每时相点25只),余下25只尾静脉注射等渗盐水为对照组.计算尾静脉注射后72 h小鼠存活率.结果 (1)与脓毒症模型组比较.TREM-1干扰组、TREM-1半量干扰组小鼠血浆TNF-α、IL-1β、IL-6含量均下降(P<0.05),以TREM-1干扰组下降最明显.GFP干扰组中各促炎因子含量与脓毒症模型组接近(P>0.05).(2)与GFP干扰组比较,TREM-1干扰组及其半量干扰组小鼠肝组织TREM-1 mRNA表达均明显下调(P<0.01),以TREM-1干扰组尤为明显(P<0.05).各组小鼠TREM-1蛋白表达情况与此一致.(3)脓毒症模型组、GFP干扰组小鼠腹腔注射后72 h存活率均为16%.TREM-1干扰组及其半量干扰组分别为76%和44%(P<0.05或P<0.01).(4)另建立的125只脓毒症小鼠模型中,对照组及腹腔注射后1、2、4、6 h组其尾静脉注射后72 h存活率分别为16%、72%、56%、40%、16%,其中1、2、4 h组明显高于对照组(P<0.05或P<0.01).结论 运用TREM-1 vshRNA干扰技术,可有效降低脆弱拟杆菌脓毒症小鼠肝组织TREM-1表达水平,抑制炎性反应,提高小鼠存活率.     

肠道菌群异质性与脓毒症小鼠获得性肌无力的关系

目的评价肠道菌群异质性与脓毒症小鼠获得性肌无力的关系。方法 SPF级健康雄性C57BL/6小鼠80只, 体质量18～20 g, 6～8周龄。取小鼠40只, 采用腹腔注射LPS 10 mg/kg的方法制备脓毒症模型, 筛选脓毒症敏感型小鼠(建模后24 h内出现濒死状态甚至死亡)和脓毒症抵抗型小鼠(生存7 d并恢复活跃状态), 建模前收集小鼠粪便制备粪菌液。取小鼠40只, 采用随机数字表法分为4组(n=10):对照组(C组)不予以任何处理;抗生素组(ABX组)灌胃复合抗生素1次/d, 连续5 d;抵抗组(Res组)灌胃复合抗生素5 d后, 灌胃脓毒症抵抗型小鼠粪菌液150 μl, 1次/d, 连续3 d, 随后腹腔注射LPS 15 mg/kg;敏感组(Sen组)灌胃复合抗生素5 d后, 灌胃脓毒症敏感型小鼠粪菌液3 d(方法同Res组), 随后腹腔注射LPS 15 mg/kg。脓毒症建模后24 h时进行脓毒症严重程度评分。于粪菌移植后以及脓毒症建模后24 h时测定四肢抓力。脓毒症建模后24 h时测定腓肠肌复合肌动作电位(CMAP), 随后取血液标本, 采用ELISA法测定血清IL-1、IL...     

丰富环境对脓毒症相关性脑病小鼠认知功能的影响及NPAS4/BDNF相关机制

目的观察丰富环境对脓毒症相关性脑病小鼠认知功能的影响,并探讨神经元PAS结构域蛋白4(NPAS4)/脑源性神经营养因子(BDNF)的相关机制。方法成年雄性C57BL/6小鼠60只随机分为三组:假手术+标准环境组(SS组,n=12)、盲肠结扎穿孔(CLP)+标准环境组(CS组,n=24)和CLP+丰富环境组(CE组,n=24)。术毕三组分别饲养在标准环境和丰富环境中29d,术后29d行条件性恐惧实验,并采用免疫印迹法、高尔基染色分别检测NPAS4、BDNF及海马树突棘密度的改变。结果与SS组比较,CS组的场景性僵直时间、树突棘密度、NPAS4、BDNF水平明显降低(P0.05);与CS组比较,CE组场景性僵直时间、树突棘密度、NPAS4、BDNF水平明显升高(P0.05)。三组条件性僵直时间差异无统计学意义。结论丰富环境可明显改善脓毒症相关性脑病小鼠的认知功能损伤,这可能与其上调海马NPAS4/BDNF表达,增强海马突触可塑性有关。     

帕瑞昔布钠对脓毒症小鼠肠黏膜屏障的保护作用

目的研究帕瑞昔布钠对脓毒症小鼠肠黏膜屏障功能的影响及可能机制。方法 21只C57BL/6小鼠随机分为三组:假手术组(Sham组)、脓毒症模型组(CLP组)、脓毒症模型+帕瑞昔布钠2mg/kg治疗组(P组),每组7只。术后24h用襻环结扎法检测各组小鼠小肠通透性。另21只C57BL/6小鼠随机分为三组,分组及治疗同前,术后24h处死小鼠,收集小鼠回肠。小肠组织行HE染色观察肠病理损伤。采用Western bolt法检测小肠ZO-1、Occludin、Claudin-1等紧密连接蛋白的表达。采用ELISA法检测小肠黏膜IL-6、PGE2的浓度。结果与Sham组比较,CLP组小鼠小肠明显损伤,门静脉血内FD4浓度明显升高,小肠黏膜内ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白表达明显减少、IL-6与PGE2浓度明显升高(P0.05)。与CLP组比较,P组小鼠小肠损伤明显减轻(P0.05),门静脉血内FD4浓度明显降低(P0.05),小肠黏膜内各蛋白表达水平明显增加、IL-6与PGE2浓度明显降低(P0.05)。结论帕瑞昔布钠治疗可以明显降低脓毒症导致的肠黏膜屏障功能损伤,其机制可能与降低肠组织炎症水平,增加肠紧密连接蛋白表达相关。     

姜黄素减轻脓毒症小鼠急性肺损伤时SIRT1与铁死亡的关系

目的评价姜黄素减轻脓毒症小鼠急性肺损伤(ALI)时沉默信息调节因子1(SIRT1)与铁死亡的关系。方法 SPF级雄性C57BL/6J小鼠152只, 8周龄, 体质量23～27 g, 采用随机数字表法分为4组(n=38):假手术组(C组)、脓毒症组(S组)、姜黄素组(Cur组)和姜黄素+SIRT1抑制剂EX527组(CE组)。Cur组每日姜黄素200 mg/kg灌胃;CE组每日姜黄素200 mg/kg灌胃, 并腹腔注射EX527 5 mg/kg;C组和S组给予等量溶剂二甲基亚砜。各组连续给药5 d后采用盲肠结扎穿孔术制备脓毒症模型。每组随机取20只小鼠观察造模后7 d生存情况。造模后24 h时, 收集支气管肺泡灌洗液(BALF), 采用ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18浓度;取肺组织, 计算湿重/干重比值(W/D比值), HE染色后行肺损伤评分, 采用比色法检测肺组织还原型谷胱甘肽(GSH)、MDA和铁含量, Western blot法检测肺组织SIRT1、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、酯酰辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)的表达。结果与C组相比, S...     

不同环境条件对脓毒症相关性脑病小鼠认知功能的影响

目的研究不同环境条件对脓毒症相关性脑病(sepsis-associated encephalopathy, SAE)认知功能的影响和机制。方法成年雄性C57BL/6小鼠96只,3～4月龄。采用腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)建立脓毒症相关性脑病模型,分为生理盐水+标准环境(SE)组(NS组)、生理盐水+丰富环境(EE)组(NE组)、生理盐水+恶劣环境(IE)组(NI组)、LPS+SE组(LS组)、LPS+EE组(LE组)和LPS+IE组(LI组)。应用矿场实验检测小鼠运动总距离和中央格停留时间,应用条件恐惧实验检测小鼠场景性僵直时间和条件性僵直时间。检测前额叶皮质和海马炎性因子(TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-10)浓度,脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)含量。结果 NI组和LS组场景性僵直时间明显短于NS组(P0.05);LE组场景性僵直时间明显长于LS组(P0.05);LI组场景性僵直时间明显短于NI组、LS组和LE组(P0.05)。NI组和LS组海马IL-6浓度明显高于NS组(P0.05),海马BDNF含量明显低于NS组(P0.05)。结论恶劣环境可增加脓毒症脑病海马炎性因子的水平,加重认知损伤,而丰富环境可降低炎性因子的水平,改善脓毒症脑病的认知损伤。     

基于RNA-seq的脓毒症相关性脑病小鼠海马转录组分析及竞争性内源性RNA调控网络的构建

目的采用转录组测序技术(RNA-seq)筛选脓毒症相关性脑病(SAE)小鼠海马差异表达的长链非编码RNA(lncRNA)及mRNA, 构建竞争性内源性RNA(ceRNA)调控网络。方法清洁级健康雄性C57BL/6小鼠10只, 6～8周龄, 体质量20～25 g, 采用随机数字表法分为2组(n=5):假手术组(Sham组)和脓毒症组(Sepsis组)。Sepsis组采用盲肠结扎穿孔(CLP)法制备小鼠脓毒症模型, Sham组只开腹不进行盲肠结扎和穿孔。分别于术前1 d及术后3 d时行Morris水迷宫实验和条件恐惧实验检测小鼠认知功能。随后Sham组随机处死3只小鼠, Sepsis组处死认知功能测试最差的3只小鼠, 取海马组织, 通过BGISEQ-500平台行转录组测序, 得到差异表达的mRNA和lncRNA, 测序结果通过深圳华大基因科技服务有限公司提供的Dr.Tom平台行可视化分析, 利用Cytoscape软件构建ceRNA调控网络。结果与Sham组比较, Sepsis组逃避潜伏期延长, 靶向限停留时间百分比和僵直时间百分比降低(P<0.05)。转录组数据分析共获得差异表达的l...