固氮螺菌突变株CWV-22对提高小麦固氮量的初步研究

固氮螺煎突变株CWV-22与玉米、小麦联合体的固氮作用经采用纯培养物和密闭培育装置试验已被证实。在此基础上进行了盆栽(砂培)试验,结果表明：在无NH+4存在下,接菌CWV-22和接菌Sp7的小麦联合体对比,小麦苗期每克干物质中的含氮量,前者比后者高2．1倍;在30mmoi／L NH}存在下,前者比后者高46mg;而在30mmoI／L。‘N埘存在下,小麦苗期植株中吸收的“N量,接菌CWV一22的比接菌Sp7的小麦联合体高13μg。     

固氮螺菌CWV-22突变株与玉米、小麦联合体的固氮作用

应用乙炔还原法和同位素15N示踪技术证明固氮螺菌CWV-22是具有耐高铵、泌铵能力的突变株。它在含有50mM NH+4浓度的纯培养固氮试验中,吸收”N量为135μg／mg蛋白,不接种的对照吸收“N量为零,接种Sp7的只有1／~g]mg蛋白,在测试允许误差之内,证明Sp7的固氮作用是不耐铵的。在密闭培育装置中,用15N示踪植物试验：1．种植玉米或小麦,接种不耐铵的。P7或耐铵的CWV一22菌株,不论在有或无NH,Ac的条件下,植物吸收的生物固定”N量均远远高于不接种细菌的对照植物,达4．5—9．0倍;2．接种耐铵CWV一22菌株不受NH(Ac存在的抑制,接种不耐铵sp7菌株则受到显著的抑制,但仍有一定的固氮作用,并将固定的”N输送到植物根、茎、叶里。经检测,在有NH．Ac条件下,根际砂中含nil+量降低到l--2mM(远离根际的砂中含N时为29．1raM),低于对。P7菌株的抑制浓度,可能是。P7仍有固氮活性。     

固氮螺菌耐高铵突变株的选育

应用亚硝基脏(N-nitrosoguanidine,NTG)诱变剂对固氮螺菌菌株Ma241、Ma99、Sp7和G14进行诱变处理后,在掭加了铵的类似物乙撑二胺(ethyleae diamina)的D6bcreiner无氯培养基中进行筛选．反复纯化,获得了在4 5 n、M NH}浓度以上,保持固氯酶活性的耐铵突变株共9株。突变株22的耐铵固氮酶活性最强,在75mM NH+4浓度下,固氮酶活性达到464n mol乙烯／mg蛋白·小时,在200m M NH+4浓度下,固氯酶话性仍有32nmol/mg蛋白·小时。     

巴西固氮螺菌Yu62nifA基因克隆、测序及功能分析

用TD-PCR法克隆了巴西固氮螺菌(Azospirillun brasilense)Yu62的nifA基因.序列分析表明它与巴西固氮螺菌Sp7的nifA序列高度同源(96.5%),其编码的产物NifA蛋白与Sp7菌株NifA的氨基酸序列同源性为97.6%.该基因可以完全互补巴西固氮螺菌Sp7 nifA-突变株的Nif-表型.研究了NH4+和O2对Yu62 nifA基因的表达及NifA活性的影响.结果表明mfA基因在Yu62菌株中是部分组成型表达的,氨和氧不能完全阻遏其表达,在5mmol/LNH4Cl与微氧(0.5%O2)条件下表达最高;NifA蛋白在0.4%～0.5%O2时活性最高,氧分压降低和提高都使NifA活性下降,1mmol/L NH4Cl足以抑制NifA的活性.     

巴西固氮螺菌Yu62 nifA基因克隆、测序及功能分析

用TD－PCR法克隆了巴西固氮螺菌（Azospirillun brasilense)Yu62和nifA基因。序列分析表明它与巴西固氮螺菌Sp7的nifA序列高度同源（96．5％）,其编码的产物NifA蛋白与Sp7菌株NifA的氨基酸序列同源性为97．6％。该基因可以完全互补巴西固氮螺菌Sp7 nifA^-突变株的Nif^-表型。研究了NH4^ 和O2对Yu62 nifA基因的表达及NifA活性的影响。结果表明：nifA基因在Yu62菌株中是部分组成型表达的,氨和氧不能完全阻遏其表达,在5mmol/LNH4Cl4与微氧（0.5%O2)条件下表达最高;NifA蛋白在0.4%-0.5%O2时活性最高,氧分压降低和提高都使NifA活性下降,1mmol/L NH4Cl足以抑制NifA的活性。     

肺炎克氏杆菌的nifA基因产物在巴西固氮螺菌中的功效

通过三亲本杂交将质粒pCK3{携带改变了启动子的肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneuma-niae)nifA 基因]引入巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62菌株中,由此获得的转移接合子巴西固氮螺菌Yu62-4菌株在6．0 mmol/L以上NH+4浓度下,能表现出微弱的固氮酶活性(相当于无NH+4时活性的0．3-0．5％),而野生型Yu62则全部丧失固氮酶活性。固氯酶的丙烯酰胺凝胶电泳和铁蛋白的免疫杂交实验表明,转移接合子Yu62-4在高NH+4(50mmol／L)下,虽有铁蛋白合成,但合成量比无NH+4时少得多,而且有一部分铁蛋白未被共价修饰;野生型菌株Yu62在此NH+4浓度下无铁蛋白合成。实验结果表明：外源(来自肺炎克氏杆菌)的基因产物在巴西固氮螺菌Yu62中不能有效地解除NH+4对该菌固氮酶合成的阻遏作用。本文分析了出现这种现象的原因。     

pH、温度、NH4+和盐度对圆果雀稗内生固氮菌固氮特性的影响

采用乙炔还原法对从圆果雀稗(Paspalum orbiculare)根、茎中分离到的5株内生固氮菌(POJy11、POG12、POGy22、POGy612、POG4)的固氮特性进行了研究。结果表明,POGy612、POG4固氮的pH适应范围是6.0-10.0,其余3株菌为6.0-8.0;POGy22固氮的最适温度为35℃,其余4株菌为30℃;随着NH4 浓度和NaCl浓度的升高,菌株固氮活性总体呈下降趋势,其中POGy22的固氮活性受NH4 抑制最明显,NH4 浓度为1.0 mmol/L时,已无固氮活性,但POGy612在NH4 浓度为2.5 mmol/L时的固氮活性最高,达到1 045.0 nmol ml-1h-1,POJy11、POGy22在NaCl浓度为0.5%时的固氮活性最高,分别达到735.5 nmol ml-1h-1、703.0 nmol ml-1h-1。     

马桑共生固氮根瘤及其内生放线菌

马桑型非豆科内生放线菌的共生固氮根瘤的含菌组织与桤木型不同。前者为一马蹄形整体,围绕着中柱维管束;后者完全包围中柱,其中含菌细胞和不含菌细胞交错存在或形成分散的含菌细胞组织团。尼泊尔马桑(Coriaria nepalensis Wall.)根瘤的内生放线菌菌丝形态与桤木根瘤的内生菌形态相同,具有一层电子密度很高的单层壁和具有单层壁的横隔膜。菌丝分枝,具有中间体。成熟的含菌细胞内有一围绕着中央液泡的栅栏排列的柱形泡囊,它们是菌丝的顶端细胞,其电子密度比菌丝高。含菌组织的衰老部分有颗粒体,颗粒体有双层壁,内层壁与菌丝的相同,外层壁比内层壁厚数倍,电子密度低。     

铜对大叶相思-根瘤菌共生固氮体系的影响

报道了两种根瘤菌 (大叶相思、美丽胡枝子 )对Cu2 + 的耐受性以及植物 根瘤菌共生固氮体系在Cu2 + 胁迫下结瘤、固氮和生长的变化 ,讨论了大叶相思在矿山尾矿废弃地作为先锋植物结瘤固氮的可能性 .结果表明 ,大叶相思根瘤菌对Cu2 + 离子的耐受性较强 ,可以耐受Cu2 + <0 80mmol的离子浓度 ,Cu2 +对它的半致死浓度为 0 12 9mmol.在无菌砂培无重金属影响条件下 ,其固氮酶活性为 2 7C2 H4 ·μg·g-1·h-1,当Cu2 + >0 12 5mmol会导致大叶相思固氮酶活性急剧下降 ,其有效半抑制浓度 (EC50 )为0 15 1mmol,Cu2 + 为 0 5 0mmol完色抑制大叶相思固氮酶活性 ,不阻碍结瘤 ,但严重抑制植物生长发育 ,引起植物叶片白化、植株矮化 .在外加N源不接菌和不加N源接菌两种处理组间 ,Cu2 + <0 12 5mmol时 ,以不加N接菌处理对大叶相思生长有利 .大叶相思对Cu2 + 吸收积累根部高于地上组织 .     

巴西固氮螺菌Yu62的EGFP标记及其在小麦体内的定殖研究

以质粒pEGFP-C1为模板,采用PCR方法特异性扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因全长序列,将其与原核表达载体pVK-100连接,构建成重组载体pVK-EGFP.利用电转化法将重组载体导入巴西固氮螺菌Yu62中,得到EGFP标记菌株.用EGFP标记菌接种小麦'小偃107'种子,室内限菌条件下培养10 d后,用荧光显微镜观测标记菌在小麦体内的定殖规律并观察接菌植株的田间生长状况.结果显示,巴西固氮螺菌Yu62能定殖于小麦根毛区、茎组织的细胞间隙等部位,而且接菌小麦'小偃107'植株在根系发育、株高、分蘖数等方面比对照有较明显的优势.研究表明,巴西固氮螺菌Yu62能够定殖于小麦根茎内,并具有促进植物生长的作用.     

甘蔗器官固氮酶活性及其对接种固氮菌的响应

以巴西固氮甘蔗品种B1、B8和广西主栽甘蔗品种ROC22和ROC16为材料,通过桶栽砂培方法,研究不同品种甘蔗及接种固氮菌R16SH后不同生育期和不同器官(根、茎、叶片、叶鞘)的固氮酶活性.结果显示,4个品种甘蔗及接菌后各器官的固氮酶活性均在伸长初期或伸长盛期达到高峰,且以根和茎较高,叶、叶鞘次之;B1、B8根的接菌效果最佳,其固氮酶活性分别比对照增加13.22%和12.42%,而B1和ROC16茎的固氮酶活性分别比对照提高12.19%和12.02%,叶片提高了8%~9%,叶鞘的固氮酶活性变化最小;4个品种甘蔗固氮酶活性表现为B8>B1>ROC22>ROC16,且品种B8与ROC22和ROC16存在显著或极显著差异;相对于品种ROC22和ROC16,固氮菌R16SH对B1与B8的株高以及B1的茎径有更好的生长诱导效应,且在伸长期表现最明显.研究表明,甘蔗的固氮酶活性在品种、器官及生育期间均存在明显差异,接种固氮菌能不同程度提高各品种器官的固氮酶活性,且各品种根、茎以及B1和B8的叶片固氮酶活性显著或极显著差异增加;巴西固氮甘蔗品种表现出比广西主栽甘蔗品种更强的固氮酶活性,且对接种固氮菌反应更敏感.     

固氮螺菌氢代谢与固氮作用的关系I.固氮螺菌放氢现象与吸氢能力的研究

本文研究了固氮螺菌(Azosptrillum brastlense)的放氢现象和吸氢酶活性以及与固氮作用的关系。测定了57株固氮螺菌的放氢现象及其固氮酶活性,其中不放氢41株,微放氢14株,其放氢量为2·63—31.00n mol C2H4／ml菌液·小时。放氢量较多的2株R38{和R256A都是从水稻根表上分离获得,其放氢量分别为185.75n mol H2／ml 菌液·小时和547．00 moIH2／ml 菌液·小时。测定了53株螺菌的吸氢酶活性,它们均具有吸氢能力,其吸氢量各异,0-63-27·38n mol H2／ml菌液。小时。生长在含有NH4CI培养基上的固氮螺菌既没有固氮能力,也不产氢。在无氮培养基上所产生的氢是固氮过程中放出的氢。实验结果指出,C2H2抑制氢酶的活性。当吸氢的菌株与放氢菌株混合培养时,其固氮酶活性比单株纯培养高,有氢存在时,固氮酶活性比不加氢时高。     

小麦根际联合固氮菌(固氮螺菌,Azospirillum brasilense)田间接种效果的研究

据黑龙江省1990年7个中试点试验证明,小麦根际联合固氮菌田间接种效果在5.2—20.6％,平均为9.8％;每田可增产小麦19.1公斤。小麦根际联合固氮菌能促进小麦本长发育,在生育期间可使株高、鲜重增加,叶色变缘。秋收考种证明,对产量构成因子的平方米穗数、穗粒数和千粒重均有增加。     

厚荚相思根瘤菌对盆栽苗木生长及土壤肥力的影响

从不同立地条件采集到的厚荚相思根瘤分离出9株根瘤菌株,接种于厚荚相思幼茁,6个月后测定苗木生长量及土壤N、P、K含量。试验结果表明：接菌桃株的高生长量、生物量都比对照(未接种根瘤菌)增加,其巾高生长量除R2外,增加幅度为0．89～40．18％,生物量增加52．33～147．67％,接种结瘤率、瘤的生物量也比对照高,结瘤率可达100％,根瘤生物量比对照高163．6～520％。土壤N、P、K元素分析结果表明,接种根瘤菌后土壤的营养元素发生了很大的变化,改善了土壤肥力。通过对接种不同菌株的厚荚相思苗木的茁高、生物量、土壤的全氮、速效磷、速效钾等元素的含量比较分析后筛选出R6和R7菌株为优良菌株。     

转座子Tn916对固氮螺菌Azospirillum brasilense的接合诱变及氨分泌菌株的筛选

以携带质粒pAM120(Ap~r,Tc~r/Tn916)的大肠杆菌(E.coli CG120)为供体菌株,与受体菌巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)采用滤膜接合法进行接合转移,在选择平板上得到具较高频率的接合子(10~(-5)/每个供体菌,选择四环素抗性)。从846株四环素抗性接合子中进一步用奈氏法筛选得到氨分泌突变株3株。在无氮培养基上,其氨分泌量可达7.5～14.0mmol/L。用乙炔还原法分析氨分泌突变株在不同浓度氮源上的固氮活力,发现20mmol/L NH Cl的存在不抑制其固氮活性,固氮活力与无氮条件下野生株的活力相差不多。无选择压力下细胞分裂50代后的稳定性实验证明,转座子Tn916在氨分泌突变株中的稳定性在50％～80％之间。以固氮螺菌氨分泌突变株为供体菌株,对E.coli HBX1进行反向接合转移实验,证实Tn916确实存在于氨分泌固氮螺菌接合子中。     

几种固氮蓝藻的固氮酶活性及其某些特性

对三种固氮蓝藻：固氮鱼腥藻(水生686)、柱孢鱼腥藻和鱼腥藻7120的整细胞及无细胞抽提液的固氮酶活性,进行了比较研究。水生686的整细胞酶活虽然不低(51．9毫米乙烯峰高／光密度／30分),仅次于柱孢鱼腥藻,但其无细胞抽提液的酶活却最低。这可能与它含有大量藻胶有关。研究了Mn^ 、Fe^ 对蓝藻固氮酶的作用,以及测定其在不同酶浓度下的反应动力学表明：柱孢鱼腥藻中不存在象深红螺菌中所看到的那种激活因子。用甲苯-乙醇溶液处理藻细胞,对固氮酶作原位测定,探索了它的氧损伤及氧保护机理。     

转座子Tn916对固氮螺菌Azospirillum brasilense的接合诱变及氨分 …

以携带质粒ｐＡＭ１２０（Ａｐ＾ｒ,Ｔｃ＾ｒ／Ｔｎ９１６）的大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧ１２０）为供体菌株,与受体菌巴西固氮螺菌采用膜接合法进行接合转移,在选择平板上得到具较高频率的接合子（１０＾－５／每个供体菌,选择四环素抗性）。从８４６株四环素抗性接合子中进一步用奈氏法筛选得到氨分泌突变株３株。在无氮培养基上,其氨分泌量可达７．５￣１４．０ｍｍｏｌ／Ｌ。用乙炔还原法分析氨分泌突变株在不同浓度氮源     

氧对固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu 62固氮酶活性的调节作用

本文研究了在好气条件下,在以谷氨酸为氮源的液体培养基中,固氮螺菌(Azospirllumbrasilense)Yu62固氮酶形成的条件及溶氧压对固氮酶活性的影响。厌氧使整体细胞固氮酶迅速失活;而见氧后固氮酶又重新恢复活性。Western blotting实验证实,这种可逆失活的分子基础,是由于固氮酶铁蛋白-亚基被修饰和去修饰。呼吸抑制剂KCN对固氮酶活性的抑制,亦是由于固氮酶铁蛋白被修饰。因此推论细胞内的能量状态可能是启动固氮酶活化酶系统的重要信号。谷氨酰胺合成酶的抑制剂MSX不能去除厌氧和KCN引起的抑制作用。结果表明：固氮酶活性的NH+4和厌氧关闭可能通过不同的机制起作用。     

巴西固氮螺菌中P_Ⅱ和P_Z在固氮调节中的不同作用

在巴西固氮螺菌 (Azospirillumbrasilense)中 ,glnB和glnZ是两个高度同源基因 ,分别位于 3 7kb EcoRI+PstI和 3 7kb SalI的两个不同的染色体片段上。用卡那霉素盒 (Kmr cas sette)插入法 ,对glnB和glnZ分别进行定位诱变 ,并获得相应的突变株 ,即glnB- 和glnZ- 。研究表明 ,glnB- 突变株丧失固氮酶活性 ,表现为Nif- ,而glnZ- 象野生型菌株一样具有固氮酶活性。为了进一步研究这两个基因的功能 ,将glnB和glnZ分别构建在pVK1 0 0载体上形成重组质粒pVK -Ⅱ和pVK -Z ,对glnB- 和glnZ- 突变株进行互补实验 ,进一步证明了glnB与固氮酶活有直接相关性 ,而glnZ无此作用。同时 ,通过三亲接合法将pVK -Ⅱ和pVK -Z分别转移到巴西固氮螺菌野生型Yu62和具有一定抗铵能力的draT- 突变株中 ,使glnB和glnZ的拷贝数增加 ,进一步比较它们的固氮酶活性。结果表明多拷贝的glnB基因 ,能显著提高固氮酶活性 ,而多拷贝的glnZ对固氮酶活性无影响。同时 ,将pVK Ⅱ和pVK -…     

大豆基因工程根瘤菌田间结瘤和共生固氮效应

利用三亲本接合转移方法,将快生型大豆根病菌B_(52)的基因文库克隆转移到受体菌慢生型大豆根瘤菌2210中,获得4株大豆基因工程根瘤菌(32.43、B—2—6、B—3—8)。田间接种试验表明:在大豆分枝期(V2),43和32结瘤效分别比不接种对照增加117.9％和100.4％;在初花期(R_1),32和B—2—6结瘤数分别比对照增加122.5％和91.6％,根瘤固氮酶活性增加233.3％和195.6％;在结荚始期(R3),B—2—6和32结瘤数比对照增加78.5％和70.1％,根瘤固氟酶活性43和B—2—6分别比对照增加53.4％和49.3％。产量统计表明:32、B—2—6和43比对照分别增产16.8％、14.3％和12.2％,亩增收大豆分别为28.2、24.1和20.6公斤。以上三个菌株均比受体菌株2210增产率高。