解淀粉芽孢杆菌YN-1抑菌蛋白TasA基因的克隆及原核表达

本文以解淀粉芽孢杆菌YN-1菌株为研究对象,利用PCR方法从基因组DNA中扩增出编码TasA抑菌基因的全长DNA,并构建pGEX-4T2/TasA原核表达载体,获得TasA-GST融合表达的抑菌蛋白。测序结果表明,解淀粉芽孢杆菌YN-1TasA基因核苷酸序列全长为786bp(GenBank登录号:EU131674),编码261个氨基酸残基;同源性分析表明,它与解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens FZB42(YP_001421886)序列的同源性最高,达98%,预测蛋白分子量为31kD。SDS-PAGE分析表明,TasA基因能在大肠杆菌BL21中表达,Western印迹分析pGEX-4T2/TasA原核表达载体,检测到约57kD的TasA-GST融合外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小相符。表达产物细胞裂解液上清经Ni柱层析,表明浓度为500mmol/L咪唑洗脱缓冲液时获得较高浓度和纯度的纯化蛋白。进一步抑菌活性分析表明表达产物对黄瓜灰霉病病原菌检测平板上显示出较好的抑菌活性。本研究结果将为今后深入研究TasA抑菌蛋白基因以及抗病转基因工程提供了参考。     

烟夜蛾泛素延伸蛋白基因的克隆与表达

应用RT-PCR技术，从烟夜蛾(Helicoverpa assulta)幼虫脂肪体组织总RNA中反转录扩增泛素延伸蛋白基因的cDNA片段，扩增得到的片段全长390bp，编码一个长为129个氨基酸残基的蛋白质，预测分子量14.8kDa。同源性分析表明，此cDNA序列为ubiquitin-53aa extension protein(ubi-53，UBE)基因，在泛素蛋白后融合了一个核糖体L40蛋白(ribosomal L40 protein)。使用Clustal W软件，对cDNA编码的氨基酸序列进行了同源性分析，分析表明：烟夜蛾的泛素延伸蛋白氨基酸序列与其他真核生物泛素延伸蛋白氨基酸序列高度同源（90%－98%），与棉铃虫核多角体病毒(HaSNPV)泛素的同源性为69%。将烟夜蛾的UBE基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG进行诱导表达，电泳检测到一条约40kDa大小的外源蛋白，用鼠抗GST抗体进行Western blot检测表明原核表达蛋白是目的蛋白。     

玉米大斑病菌G蛋白β亚基编码基因的克隆与表达

玉米大斑病菌（Setosphearia turcica）属半知菌亚门丝状真菌，是严重威胁玉米生产的重要植物病原真菌。本研究克隆了玉米大斑病菌G蛋白β亚基编码基因Stgb-1。Stgb-1基因全长1296bp，由5个外显子和4个内含子组成；开放阅读框（ORF）为1056bp，编码351个氨基酸，蛋白质计算分子量为39.081kDa。STGB1蛋白推导氨基酸序列与Cochliobolus heterostrophus（100%）、Cryphonectria parasitica（80%）、Aspergillus fumigatus（81%）等丝状真菌的G蛋白β亚基编码基因均具有较高的同源性。同时，利用RACE技术和Genomic Walking技术获得了Stgb-1基因3’-末端cDNA和DNA的3’端侧翼序列，BlastN结果表明其cDNA 3’-UTR为136bp，poly(A)由9个A构成。此外，构建了pET28a-Stgb-1原核表达载体，SDS-PAGE检测和Western blot鉴定结果表明，目的蛋白在E.coli BL21菌株中已成功实现了诱导表达，为进一步研究蛋白结构与功能的关系奠定了基础。     

茶树黄酮醇合成酶基因的克隆与原核表达

本研究采用EST测序技术和RT—PCR技术,获得了一个茶树茶多酚代谢中的重要基因——黄酮醇合成酶（FLS）基因,在GenBank登录（GenBank accession No．EF205150）,其序列全长1317bp,其中开放阅读框长996bp,编码331个氨基酸,3]端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为37．5kD,理论等电点为5．80。序列分析表明它与葡萄FLS基因序列的亲缘关系比较近。将该基因重组到表达载体pET-32a（＋）中进行原核表达,经IPTG诱导、SDS-PAGE检测,结果表明茶树黄酮醇合成酶基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约61kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。用Ni-NTA亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,得到了纯度在90%以上的纯化蛋白,为进一步研究PET-FLS融合蛋白的活性及功能奠定了基础。     

诸葛菜OvCYP86MF基因的克隆及其特性分析

为进一步阐明细胞色素P450基因CYP86MF在诸葛菜发育中的分子机理,本文根据已知同源基因保守序列设计特异引物,利用RT-PCR和RACE技术从诸葛菜中获得一个细胞色素P450基因(OvCYP86MF)全长cDNA序列,该序列全长为1876bp,含有1605bp的完整开放阅读框,可编码534个氨基酸,分子量和等电点分别为61.4kDa和6.90,具有细胞色素P450蛋白的典型特征,即保守结构域FNAGPRLCIG;原核表达显示该基因的融合蛋白在体外可以诱导表达;DANSTAR和Clustal W软件分析表明该基因的全长cDNA序列及其编码氨基酸序列与十字花科物种拟南芥相似性很高,达到80%以上,亲缘关系最近;与CYP86C亚家族成员在氨基酸水平上的相似性均高于50%,因此推断该基因属于CYP86C这个亚家族。Northern杂交分析表明该基因在花蕾中特异表达。     

甘蔗Lea基因cDNA全长克隆及表达特性

本研究从甘蔗叶片全长cDNA文库中获得了甘蔗Lea基因cDNA全长序列,命名为Sc-Lea。该基因全长921 bp, 含有一个495 bp编码164个氨基酸的的开放阅读框(open reading frame, ORF), 5’端非编码区（untranslated region,UTR）长64 bp,3’端UTR长362 bp,且在3’端UTR有明显的polyA结构, 起始密码子周围为CCCCAGCCATGGC, -3、+4位为G,C是该段序列的偏好碱基,符合Kozak规则。目的基因原核表达产物分子量大小约为17.9kD。同时还利用定量PCR技术研究了该基因在水杨酸（SA）、H2O2 PEG和NaCl等四种外源非生物胁迫因子作用下的表达特性。研究结果表明,甘蔗Lea基因的表达,会受到PEG和NaCl的强烈诱导,以及H2O2的抑制,同时也会受SA的影响。推测甘蔗Lea基因在甘蔗的抗旱和抗盐机制中发挥作用。     

Overlap-PCR克隆秦川牛HCRTR1基因及其在大肠杆菌中的表达分析

通过Overlap-PCR方法克隆了秦川牛的HCRTR1基因编码区全长,获得1278 bp编码区全长序列,将其克隆至pMD-18T载体上,经测序表明获得的cDNA序列与GenBank公布的序列同源性均为98%。提取阳性克隆的质粒经BamHI和HindⅢ双酶切后,回收到1278 bp的目的片段,定向克隆到pET32a（+）表达载体上,连接产物转化Bl21(DE3)感受态大肠杆菌,对长出的菌落进行菌落PCR和质粒酶切鉴定正确后,用IPTG诱导目的蛋白的表达。SDS-PAGE表明秦川牛HCRTR1基因在大肠杆菌中不表达,生物信息学分析表明,HCRTR1基因的表达产物为具有7个跨膜螺旋的G蛋白偶联受体,可能是此类蛋白在原核系统的表达将会影响细菌本身存活,因此原核表达系统也成为研究此类蛋白的瓶颈。     

花生生长素抑制蛋白基因AhARP的表达分析

种子休眠性是花生重要的农艺性状。为了挖掘控制花生种子休眠的重要基因,以花育52号为试材,通过转录组测序获得生长素抑制蛋白基因的全长,该基因全长为918bp,开放阅读框为363bp,编码121个氨基酸,推导出的蛋白质分子量为13.44 k Da,理论等电点p I=9.64。序列比对表明,该序列与花生生长素抑制蛋白基因Ah ARP一致,确认该c DNA序列为编码花生生长素抑制蛋白基因的全长c DNA序列。荧光定量PCR结果表明,Ah ARP基因在种子休眠阶段表达量较高,种子休眠解除后表达量降低;乙烯利释放吸涨种子休眠过程中,Ah ARP基因受到明显诱导;说明Ah ARP基因可能与花生种子休眠有关。Ah ARP基因的序列、结构、性质以及功能的初步分析,为进一步研究该基因在花生种子休眠中的功能机制奠定了基础。     

青稞OMT1基因克隆及原核表达分析

类黄酮O-甲基转移酶(FOMT)是一种在植物甲基化黄酮代谢合成中有着重要作用的酶,但在中国青藏高原的特色作物青稞中研究较少。为了更好了解该酶及编码基因在青稞中的生理功能及作用,以高总黄酮青稞品系94-19-1为材料,通过RT-PCR扩增、克隆得到青稞OMT1基因的ORF序列。结果表明,该基因ORF长1 071 bp,编码356个氨基酸,预测蛋白分子量为38.65 KDa,等电点为5.33。序列比对分析发现,所克隆的基因与NCBI数据库收录的大麦Hv OMT1基因有99.44%的一致性,氨基酸序列存在5个残基差异,编码的蛋白序列具有OMT蛋白家族典型的保守结构域。进一步将该基因连接到原核表达载体转化大肠杆菌,最终成功将该基因所编码的蛋白在大肠杆菌诱导表达,并利用亲和层析柱分离技术,将该表达蛋白进行了纯化。这为进一步研究该酶蛋白功能和选育高品质青稞品种奠定了基础。     

水稻黑条矮缩病毒玉米分离物基因组S8和S9的序列分析及其原核表达

通过RT-PCR获得了玉米粗缩病病毒湖北分离物(Hbm)基因片段S8和S9的全长cDNA克隆，并测定了它们的全序列。S8全长1936bp，其编码链只含1个ORF，编码1个由591个氨基酸组成、分子量约为68kD蛋白；S9全长l900bp，含有两个非重叠的ORF，分别编码由347个和209个氨基酸组成、分子量分别约为40kD和24kD蛋白。序列分析表明，Hbm-S8和S9与水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)中国不同分离物之间的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94．4％～98．9％和96．0％~99．0％，且与日本RBSDV的序列同源性高于与玉米粗缩病毒相应片段的序列同源性，进一步证明了引起我国玉米粗缩病的病原为RBSDV。SDS-PAGE分析表明，经IPTG诱导，RBSDV8和9编码的蛋白可在大肠杆菌(Escherichia coil)中高效表达。以这些蛋白为抗原，制备了抗血清。用Western blot方法在感病的玉米(Zea mays)植株中可检测到RBSDV-Hbm S8和S9 ORF1编码的蛋白。     

总状毛霉(Mucor racemosus)甲壳素脱乙酰酶全长cDNA的克隆及序列分析

用保守的特异引物进行PCR扩增,结合RACE技术,分离和克隆到了总状毛霉(Mucorracemosus)甲壳素脱乙酰酶(CDA)的全长cDNA,并进行了全序列测定,提交GenBank登陆号DQ538514。研究结果表明:(1)总状毛霉CDA基因全长为1506bp,包括67bp5'非翻译区,1344bp阅读框以及95bp3'非翻译区,3'非翻译区包含Poly(A)加尾信号AATAAA。总状毛霉的CDA基因共编码448个氨基酸,在该基因中部还包含一个144氨基酸的多糖脱乙酰酶结构域,约占CDA基因全长的32%。(2)总状毛霉CDA基因与其它相近种米根霉(Rhizopusoryzae)、卷柄根霉(Rhizopuscircinans)的CDA1和CDA2、鲁氏毛霉(Mucorrouxii)、卵形孢球托霉(Gongronellabutleri)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)、布拉克须霉(Phycomycesblakesleeanus)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的CDA1和CDA2的基因序列同源性分别为:75%、58%、56%、56%、48%、39%、39%、17%和16%;相应的氨基酸序列的同源性分别为:69%、57%、59%、55%、47%、30%、32%、18%和21%。表明CDA基因在不同的真菌中有着不同的亲缘关系。(3)根据总状毛霉CDA基因的氨基酸序列构建的不同真菌的系统树,与采用经典分类法构建的系统树基本一致。(4)通过生物信息学的方法,预测该基因所编码的蛋白质三级结构,验证了该蛋白质具有甲壳素脱乙酰酶完整的功能性结构,并包含一个多糖脱乙酰酶结构域,两者具有相似的空间结构。     

毛竹液泡膜Na+/H+逆向运输蛋白基因克隆及表达分析

植物Na+/H+逆向转运蛋白具有稳定细胞质内Na+浓度和调节pH值的功能,对植物的耐盐性具有重要的作用。利用RT-PCR和RACE技术分离出毛竹(Phyllostachys pubescens)Na+/H+逆向转运蛋白编码基因PpNHX1的cDNA序列,全长2290bp(GenBank登录号为GU295174)。该基因的编码蛋白PpNHX1包含545个氨基酸残基,进行BLASTp比对,发现其与芦苇(Phragmites communis)PcNHX1、水稻(Oryza sativa)OsNHX1的序列同源性分别为89%和88%。系统发育分析表明,PpNHX1蛋白与禾本科植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的亲缘关系较近,与质膜型Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系较远。以半定量RT-PCR检测PpNHX1基因的表达情况,发现PpNHX1受到200mmol/L NaCl胁迫的诱导,在4h内的表达量随NaCl处理时间延长持续增强,其中根部的表达增强幅度明显高于茎和叶;但4h后,PpNHX1在根与叶中的表达量均有所下降。推断PpNHX1基因在盐胁迫下的表达调控与毛竹耐盐能力密切相关。     

甜高粱蔗糖合成酶基因（Susy2）的克隆及结构和功能分析

本研究以甘蔗蔗糖合成酶基因(susy2)cDNA序列为探针,对高粱EST数据库进行同源检索,将获得的4条与甘蔗相似性很高的EST序列进行拼接,后经基因组PCR、分子克隆和序列分析验证获得了甜高粱(sorghum bicofor)蔗糖合成酶基因DNA序列(Susy2,GenBank登录号为FJ513325).该序列全长4587 bp,起始密码子至终止密码子序列长4350 bp,包含一个2409 bp的开放读码框.该序列包含15个外显子和14个内含子,剪接方式都为GU/AG模式.Susy2编码的蛋白由802个氨基酸组成,分子量大小为91.7 kD,等电点pI为6.15.保守结构域分析表明,此蛋白含有一个475个氨基酸的GTI糖基化酶保守结构域(275～759),有4个ADP结合位点,能催化6-磷酸果糖和UDPG形成6-磷酸蔗糖.     

草鱼胞浆谷胱甘肽过氧化物酶cDNA全长的克隆与分析

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidases,GPXs,EC1.11.19)是生物体内抗氧化防御系统的重要组成部分。本文从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)克隆到胞浆谷胱甘肽过氧化物酶基因(GPX1)cDNA全长序列。该序列全长890bp(GenBank accession No.EU828796),包括完全开放阅读框(ORF)576bp、5'非编码区(5'-UTR)17bp和3'-UTR297bp。其ORF编码191个氨基酸残基,包含一个由"UGA"(通常为终止密码子)编码的硒代半胱氨酸(selenocysteine,Sec40)残基,并与另2个残基(Glu75和Trp153)构成酶活性中心。同时,草鱼GPX1cDNA的3'-UTR中具有保守的硒代半胱氨酸插入序列(selenocysteine insertion sequence,SECIS)元件。氨基酸序列相似性比较显示,草鱼GPX1cDNA的推测氨基酸序列(GenBank accession No.ACF39780)与斑马鱼GPX1(GenBank accession No.NP_001007282)的相似性...     

奥利亚罗非鱼3种C型溶菌酶基因的克隆及其序列分析

本研究结合RT-PCR和RACE法获得了奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)三种C型溶菌酶基因C-1,-2和C-3的全长cDNA.3个基因的cDNA分别为581 bp、662 bp和695 bp,各编码143、156和143个氨基酸(GenBank accession No:EU913095,EU913094和EU836689),相互间氨基酸序列的同源性在63.9%~67.8%之间.3个基因均具有与其它物种C型溶菌酶相同的8个保守半胱氨酸残基和2个活性位点Glu~(35)和Asp~(52),可认为它们均为C型溶菌酶基因.在系统进化树中这3个基因首先与同属高等真骨鱼类的聚类,最后再与低等真骨鱼类的聚类,系统进化关系与传统鱼类分类地位相吻合,显示真骨鱼类C型溶菌酶的进化速度与物种的进化速度基本一致.蛋白分析软件分析显示这3个基因均具有C型溶菌酶的典型结构、相似的蛋白二、三级结构,推测应具有与C型溶菌酶相似的生理功能.但3个基因氨基酸序列间存在一定差异,其中C-1的等电点较低且碱性氨基酸较少,因此3种溶菌酶可能具有生理功能上的差异与分工.     

甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶基因ace-3全长cDNA的克隆和序列分析

利用RT- PCR结合RACE技术克隆了甘薯茎线虫（Ditylenchus destructor）乙酰胆碱酯酶基因cDNA,Dd-ace-3,提交GenBank登录号EF583057。该cDNA序列5’端存在反式剪接引导序列SL1,全长2517bp ,包含一个1836bp的开放阅读框;在推导出的611个氨基酸残基的前体蛋白中, N 端的前21个氨基酸残基为信号肽, C-28的位置存在糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定位点,除此之外的562个氨基酸残基是成熟的乙酰胆碱酯酶序列,其预测的分子量为64396.81D。在一级结构中,形成催化活性中心的3个氨基酸残基 (Ser232 ,Glu360 和His479) ,以及在亚基内形成二硫键的6个半胱氨酸完全保守;在电鳐乙酰胆碱酯酶分子的催化功能域中存在14个保守的芳香族氨基酸残基,其中11个在甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶中完全保守。该酶的氨基酸序列与秀丽小杆线虫（Caenorhabditis elegans）ACE-3和ACE-4的同源性达56.1%和50.0%。与其它线虫和物种乙酰胆碱酯酶的聚类分析显示,甘薯茎线虫的乙酰胆碱酯酶与Ш型乙酰胆碱酯酶ACE-3同属一个支系。     

黄颡鱼抗菌肽hepcidin基因的克隆和表达分析

用RT-PCR方法,从黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）肝脏中克隆获得了hepcidin cDNA序列,并对其进行序列测定,在此基础上分析了hepcidin基因在不同组织中的表达差异和不同细菌感染后对其表达的影响。结果表明,黄颡鱼hepcidin的cDNA片段（GenBank登陆号EU257703）长为282bp,编码93个氨基酸,由信号肽(23个氨基酸)、前肽（45个氨基酸）和成熟肽（25个氨基酸）组成,成熟肽含有8个保守的半胱氨酸（cys）残基,可形成4个链内二硫键。与已报道的其他鲶形目鱼类hepcidin核苷酸序列的同源性为80-82%,推导的氨基酸序列的同源性为69-71%。RT-PCR半定量分析显示黄颡鱼hepcidin基因在不同组织中普遍表达,其中肝脏表达水平最高,头肾、肠道、肌肉、脑、胃、鳃、心脏、卵巢表达次之,皮肤、脾脏、肾脏表达较低。感染嗜水单胞菌和腊样芽孢杆菌的黄颡鱼,肝脏hepcidin mRNA水平显著升高。     

茶树生长素抑制蛋白基因CsARP1的克隆与表达分析

从茶树休眠芽抑制消减杂交文库中分离得到生长素抑制蛋白基因的3＇-片段,以休眠芽为材料,利用RACE技术克隆了其cDNA全长,并利用荧光定量PCR研究了该基因在不同休眠阶段芽的相对表达量。结果从茶树休眠芽中获得一个全长为711bp的生长素抑制蛋白基因CsARP1（GenBank登录号为HQ225758）。该基因开放阅读框...