脂肪来源干细胞诱导分化为神经元样细胞的实验研究

目的： 研究脂肪来源干细胞（ASCs）的分离、纯化、扩增以及在体外定向分化为神经元样细胞的能力。 方法: 获取并培养正常人的ASCs，倒置显微镜下观察其形态；流式细胞仪检测其免疫表型。全反式维甲酸（ATRA）诱导ASCs在体外分化为神经元样细胞，倒置显微镜观察神经元样细胞的形态，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测巢蛋白基因的表达；免疫组织化学染色法和Western blotting法检测神经丝蛋白（NF）和神经元烯醇化酶（NSE）的表达。 结果: ASCs呈纤维样贴壁生长，体外培养易扩增；ASCs表达相关抗原CD29和CD105，不表达CD31、CD34、CD45和HLA-DR；不同扩增代数的ASCs经诱导剂的作用可呈现典型的神经元样细胞形态，巢蛋白基因及NF、NSE均呈阳性表达。 结论: 脂肪组织中分离培养的ASCs具有体外大量扩增并保持低分化状态的特性，以及定向分化为神经元样细胞的能力, 是一种可用于神经系统疾病治疗的种子细胞。     

定向诱导小鼠原始生殖细胞向肝细胞分化的研究

目的探索诱导小鼠原始生殖细胞向肝细胞定向分化的最佳条件。方法分离提取小鼠的原始生殖细胞，体外培养扩增后，接种到6孔培养板中。向不同孔中分别加入不同浓度的bFGF、EGF、β-NGF、RA、肝细胞提取液和与胎肝组织分隔培养，进行诱导分化。用靛青绿摄入试验和α-1-抗胰蛋白酶（AAT）、白蛋白（ALB）免疫细胞化学染色鉴定原始生殖细胞向肝细胞分化的状况。结果与胎肝组织分隔培养2d，可见原始生殖细胞向肝样细胞分化，分化细胞呈圆形和星形，圆形细胞多呈簇状，可以摄入靛青绿呈绿色，并呈AAT和ALB免疫阳性着色，培养12d时分化率达80％。肝细胞提取液也可诱导原始生殖细胞向肝样细胞分化，12d时分化率达70％以上；0．5g／L和1g／L的肝细胞提取液的诱导分化率无显著差异；但是0．5g／L提取液诱导组圆形细胞较多；而1g／L肝提取液诱导组，星状分化细胞多。β-神经生长因子（β-NGF）诱导4d，可见肝样细胞出现，随诱导时间延长，分化细胞增多，圆形分化细胞较多，12d时分化率达60％以上；20μg/L和50μg/L两种浓度的β-NGF诱导分化率无显著差异。bFGF、EGF、RA诱导组未见ALB免疫反应阳性细胞。RA可以增强β-NGF的诱导分化作用，使星状细胞增多明显。结论β-NGF和肝细胞因子可诱导原始生殖细胞向肝细胞定向分化。     

人脐血间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞

目的从人脐血中分离单个核细胞(MNCs)、体外培养扩增间充质干细胞(MSCs)并研究其生物学特性和定向诱导能力。方法无菌条件下采集脐血,肝素抗凝,分离单个核细胞。用DMEM/F12培养基进行纯化和扩增培养,分别向神经元样细胞诱导,获取MSCs,显微镜下观察它的形态、尼氏体染色;取扩增2、5、7代的MSCs,免疫细胞化学法检测nestin表达和神经元样细胞特异性标记。结果诱导扩增后的MSCs尼氏体染色阳性,第2、5、7代MSCs的nestin的阳性表达率分别为(51.2±3.2)%、(34.6±2.7)%、(11.3±3.3)%;神经元特异性烯醇化酶(NSE)在原代细胞无表达,而在2、5、7代MSC的阳性表达率分别为(11.4±2.3)%、(21.78±3.1)%、(40.7±3.4)%。结论人脐血MSCs具有神经干/祖细胞的特性,在一定条件下能向神经元样细胞分化。     

鸡胚生殖嵴中原始生殖细胞的分离培养

目的　在鸡胚孵化的 19期以Ficoll密度梯度离心和酶解离两种方法分离生殖嵴中的原始生殖细胞 (PGCs)。探索在生殖嵴中PGCs分离、培养的适宜方式 ,以获得较多数量与较高活力的PGCs作介导生产转基因鸡。方法　在倒置显微镜下进行形态观察 ,台盼蓝染色比较存活时间 ,PAS特异染色法识别鉴定PGCs。结果　两种分离方法均能分离到一定数量的PGCs细胞。与Ficoll密度梯度离心法相比 ,酶解离法分离到PGCs的相对数量较多 ,存活时间较长 ,是一种较可行的分离方法。在鸡胚孵化的第 19期 ,PGCs大量聚集在肢体后端的生殖嵴原基处 ,此时的生殖嵴大小已达一定程度 ,分离其中的PGCs操作简便 ,有较强的可操作性。结论　提取的PGCs为转基因鸡的生产提供了介导材料。     

鸡胚胎原始生殖细胞对不同冷冻体系适合性的研究

目的研究鸡胚胎原始生殖细胞（EPGCs）对不同冷冻体系的适合性. 方法对发育至第19期和第28期胚胎性腺PGCs,采用二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇、聚乙二醇为冷冻保护液,在不同组合、不同浓度、不同的冷冻程序下进行超低温冷冻保存.结果1.采用同一种冷冻保护液,10%浓度与15%浓度之间,除DMSO＋乙二醇（冷冻保护液Ⅳ）外,其他类型的冷冻液对EPGCs保存后存活率的影响差异不显著（P＞0.05）;20%浓度的各种冷冻保护液对EPGCs保存后的存活率最低,且与10%和15%浓度相比差异显著（P〈0.05）或极显著（P〈0.01）;2.采用同一种冷冻保护液,浓度为10%时,冷冻程序Ⅰ（2～4℃平衡45～60min,-4～-6℃诱发结晶45min,悬挂液氮面1 h以上,投入液氮保存）和冷冻程序Ⅱ（2～4℃平衡90～120 min,悬挂液氮面1 h以上,投入液氮保存）对EPGCs冷冻后存活率差异显著（P〈0.05）或极显著（P〈0.01）;3.采用冷冻程序Ⅰ,浓度为10%时,不同的冷冻保护液对EPGCs保存后的存活率影响显著（P〈0.05）或极显著（P〈0.01）,DMSO＋乙二醇（冷冻保护液Ⅳ）显示出最好的保护效果;4.第19期和第28期性腺中的EPGCs在相同的冷冻条件下冷冻后,存活率差异不显著（P＞0.05）. 结论采用冷冻程序Ⅰ,在10%的DMSO＋乙二醇（冷冻保护液Ⅳ）的保护下对鸡EPGCs冷冻较为适合.     

卵泡抑素诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

本实验观察了卵泡抑素(follistatin)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞分化的影响。利用Percoll密度梯度离心法及贴壁筛选法分离培养和扩增成人的BMSCs,通过流式细胞术分析鉴定BMSCs的纯度,用follistatin诱导第三代生长良好的MSCs向神经元转化,观察分化过程中细胞形态的变化,利用RT-PCR方法检测诱导前后BMSCs的神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经干细胞标记物巢蛋白(Nestin)的表达情况。结果显示:流式分析获得了纯度较高的BMSCs,细胞表达CD29、CD44、CD106和CD166,不表达CD34和CD45。诱导10d后,细胞呈现双极、多极和锥体形的典型神经元细胞形态,并且在mRNA水平证明诱导分化后的细胞与对照组比较NSE和Nestin的表达增加(P<0.05)。上述结果表明follistatin可以在体外诱导人的BMSCs分化为神经样细胞。     

诱导小鼠原始生殖细胞向肝细胞样细胞分化的新方法

目的 探索诱导小鼠原始生殖细胞向肝细胞样细胞定向分化的有效方法。方法 分离孕13d昆明小鼠的原始生殖细胞（PGC）,体外培养扩增后,向其培养液中加入新生鼠肝组织提取液和包被有胎肝细胞的微囊共培养,利用微环境诱导法使PGC定向分化,然后免疫细胞化学法标记α-1-抗胰蛋白酶（AAT）和白蛋白（ALB）。结果　在微环境的诱导作用下,可见PGC分化成卵圆形或星形肝细胞样细胞,并且分化细胞的数量随诱导时间延长而增多,培养2周时分化率可达70%以上。分化的肝细胞样细胞,AAT和ALB均呈阳性表达。结论 应用新生小鼠肝组织提取液和包被有胎肝细胞的微囊构成的微环境,可有效诱导PGC向肝细胞方向分化。     

红景天苷体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞*◇

背景：前期实验证明红景天苷能诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向分化,但是具体的影响方式尚不清楚。 目的：以骨髓间充质干细胞为研究对象,进一步探讨红景天苷诱导其向神经元样细胞定向分化的作用方式和分子机制。 方法：选取第2代Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,按照不同的诱导剂分为维甲酸诱导组、红景天苷诱导组和对照组,通过不同的时间点对细胞进行观察。 结果与结论：两诱导组细胞不同时间点神经干细胞标志物巢蛋白、神经细胞分化相关的兔抗微管蛋白和神经微管相关蛋白2表达阳性率均高于对照组(P < 0.01);神经胶质纤维酸性蛋白阳性率维甲酸组显著高于红景天苷组(P < 0.01)。Real Time-PCR结果显示,维甲酸和红景天苷诱导不同时间,两组细胞均有神经细胞相关基因神经元特异性烯醇化酶、神经微管相关蛋白2 mRNA表达,与诱导时间有关且不完全相同,两组间神经胶质纤维酸性蛋白mRNA的高丰度出现于诱导早期;诱导后两组神经元特异性烯醇化酶蛋白的表达随时间延长显著增加,兔抗微管蛋白表达出现于诱导早期。说明红景天苷能促进骨髓间充质干细胞向神经细胞分化,其诱导效应与维甲酸相似,且向神经元样细胞定向分化方面优于维甲酸。      

全骨髓贴壁法分离骨髓间充质干细胞并诱导其定向神经元样细胞的分化

<正>脑卒中和中枢神经系统损伤是神经科学领域的研究热点,如何改善神经元坏死、缺失和神经环路中断导致的神经系统活动及学习记忆障碍是研究的难点。已发现,海马齿状回(dentate gyrus,DG)和侧脑室下区(subventricular zone,SVZ)是成年人脑内源性神经干细胞(neural stem cell,NSC)存在的2个主要脑区[1]。我们前期实验也已经描绘出了成年SD大     

不同时间点人胚胎脑神经干细胞分化为神经元和胶质细胞比率的研究

目的 比较不同时间点人胚胎脑神经干细胞分化为神经元和胶质细胞的比例.方法 取胎龄8～12 周的人胚胎脑海马,机械分离成单细胞悬液,以2×106 个细胞/ml接种到含h-EGF、h-bFGF和h-LIF的DMEM/F12培养液中.用1?S诱导神经干细胞球分化,12 h后行RNA-结合蛋白(musashil)免疫细胞化学鉴定,分别在2、5、7、14和23 d时行β-Ⅲ微管蛋白(β-Ⅲ Tubulin/Tuj1)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和半乳糖脑苷脂(galc)免疫细胞化学鉴定.结果 诱导分化12 h时细胞球中绝大部分细胞为Musashil阳性细胞,第2 d时有少量的β-ⅢTubulin和GFAP阳性细胞,未见galc阳性细胞;第7 d时β-Ⅲ Tubulin阳性细胞数目最多,约为细胞总数的48.2%,以后逐渐下降,而GFAP阳性细胞数目在第2～23 d内呈逐渐增加趋势,到第23 d时达细胞总数的65.3%;随分化时间延长,只能检测到极少量的galc阳性细胞.结论 1?S可促使人神经干细胞分化为中枢神经系统的3种主要细胞类型,且其分化为神经元和胶质细胞的比例在不同时间点上有显著差异.     

人胚胎生殖细胞在人胚胎成纤维细胞饲养层上的生长

目的探讨以人胚胎成纤维细胞为饲养层分离、培养人胚胎生殖细胞的方法和条件。方法分离、培养3～4月胚胎成纤维细胞,取3～15代细胞经丝裂酶素处理后铺板备用;分离6．11周胚胎原始生殖细胞,将其置于人胚胎成纤维细胞饲养层上,在含生长因子、分化抑制因子的培养体系中培养胚胎生殖细胞;用免疫细胞化学方法检测胚胎生殖细胞表面标志SSEA-1和SSEA-4;钙-钴法检测碱性磷酸酶活性;RT-PCR检测转录因子Oct-4的表达。结果人胚胎成纤维细胞可连续传代25代以上(6月),3～15代细胞可以用作饲养层细胞。分离的胚胎生殖细胞在饲养层上可增殖形成典型胚胎生殖细胞集落,并能连续在体外培养超过8代。集落未分化标志检测显示SSEA—1、SSEA-4呈阳性,碱性磷酸酶活性呈强阳性,Oct-4表达阳性。结论用人胚胎成纤维细胞作为饲养层能获得可连续增殖的胚胎生殖细胞。     

小鼠原始生殖细胞体外增殖与分化的研究

目的探讨小鼠原始生殖细胞（PGC）的体外增殖与分化.方法将PGC与睾丸支持细胞（SC）共培养进行PGC的体外增殖.用原代PGC悬浮培养获取类胚体（EB）,将EB贴壁培养,观察自然分化的结果.结果PGC与SC共培养可获得大量PGC集落.组织化学与免疫组织化学法显示,PGC集落碱性磷酸酶（AKP）和阶段特异性胚胎抗原-1（SSEA-1）均呈阳性表达.将PGC悬浮培养可获得EB,EB贴壁生长后,可自然分化形成上皮样细胞、成纤维样细胞和神经样细胞.结论小鼠PGC与SC共培养能在体外大量增殖.并保持干细胞特性.PGC可形成EB,EB自然分化后大多数形成神经样细胞、其次是上皮样细胞和成纤维样细胞.     

人胚胎干细胞表达生殖细胞分化相关基因的研究

目的 探讨人胚胎干细胞(hES)系H1生殖细胞分化相关基因的表达.方法 免疫荧光、碱性磷酸酶检测和核型分析等方法联合鉴定H1的基本生物学特性,RT-PCR方法检测未分化H1的生殖细胞分化相关基因的基本表达模式,分别以人正常睾丸组织和人胚胎成纤维细胞株HFF-1作为阳性和阴性对照组织.结果 H1保持正常核型并维持未分化状态.未分化H1表达减数分裂前生殖细胞标志基因STELLAR、DAZL、FRAGILIS、PUM1、PUM2和GDF3;不表达原始生殖细胞(PGCs)标志基因BLIMP-1、减数分裂特异标志基因SCP1、减数分裂启动标志基因STRA8以及生殖细胞分化后期标志基因VASA.结论 未分化Hl细胞表达生殖细胞减数分裂前标志基因,但不表达分化后期基因,BLIMP-1可能成为区分未分化hES细胞与PGCs的特异性标志基因.     

离体培养鸡胚脑神经细胞的超微结构研究

本文应用扫描电镜和透射电镜,观察离体培养鸡胚脑细胞的超微结构,侧重描述了神经细胞及其突起间突触连接的形态特征。培养4天后,分化发育成为双极和多极的神经细胞及其突起,彼此已连成网络,并出现初期的突触连接,还见有突触前袋样结构和桥粒样细胞连接。培养7天后,神经细胞之间的轴-树、轴-体和轴-轴等类型的突触连接数目增多,透明突触囊泡密集,结构更完善。培养10天和14天后,神经细胞之间的突触连接仍较多,但已出现神经细胞变性,纤维性神经胶质细胞明显增多。     

人类羊水源类ES细胞多能性干细胞的分离培养

Stem cells are classified into embryonic stem (ES) cells and adult stem cells, which are the progenitors of any cell types of the body or tissues, and have the ability to self-renew and produce one or more differentiated cell types.     

NT-3基因修饰施万细胞促进移植的神经干细胞在损伤脊髓内分化为神经元样细胞

目的探讨神经营养素-3（NT-3）基因修饰施万细胞（SCs）对植入全横断性脊髓损伤处的神经干细胞（NSCs）分化为神经元样细胞的影响。方法将NSCs单独移植或与NT-3基因修饰SCs、LacZ基因修饰SCs和SCs联合移植到全横断性脊髓损伤处,67d后用免疫组织化学方法观测NSCs的分化,并计算其中神经元样细胞的分化率。结果NSCs在损伤脊髓内可分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞,与未基因修饰的SCs的作用相比,NT-3基因修饰的SCs能更有效地提高NSCs向神经元样细胞的分化率,而LacZ基因修饰的SCs与未修饰SCs没有明显区别。结论NT-3基因修饰SCs能促进NSCs在损伤脊髓内向神经元样细胞分化。     

小鼠胚胎大脑皮质与中脑神经干细胞培养与分化比较的研究

目的比较小鼠胚胎脑皮质与中脑来源的神经干细胞在培养与分化方面的差异，为更好的研究和利用神经干细胞提供实验依据。方法无菌条件下分别分离鼠胚大脑皮质与腹侧中脑，经胰酶消化及机械吹打成单细胞后接种于含有B27、bFGF的DMEM／F12培养基，培养扩增；倒置显微镜观察比较生长状况；机械方法传代；10％血清接种分化；免疫荧光细胞化学方法染色鉴定神经干细胞及其子代细胞的分化方向，并作比较。结果小鼠胚胎脑皮质与中脑均存在神经干细胞，其免疫细胞化学鉴定均呈Nestin阳性，并都能分化为神经元和胶质细胞；但皮质部位所含神经干细胞明显多于中脑，也更宜成球；有血清条件下分化，皮质神经干细胞未见分化为酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元；中脑神经干细胞则可少量分化为TH阳性神经元结论同样条件下皮质神经干细胞比中脑神经干细胞更易增殖与培养，两者在有血清条件下分化为TH阳性神经元能力方面有差异。     

体外诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞的初步研究

目的 初步研究诱导胚胎干细胞ES－D3细胞系向神经细胞定向分化可能性,为青光眼等视网膜视神经疾病的治疗提供可能的途径。方法 以Buffalo大鼠肝细胞培养上清进行胚胎干细胞ES－D3细胞系培养,参照Bain等方法进行改良,以视黄酸对ES－D3细胞进行分化诱导,1d后加入阿糖胞苷,相差显微镜下观察细胞生长情况。结果 加入视黄酸后1d,相差显微镜下可见散在1个、2个或多个突起的神经样细胞。加入视黄酸后2d、阿糖胞苷后第1d,可见大量1条、2条或多条突起的神经样细胞,并相连成网络结构。结论 视黄酸辅以阿糖胞苷在体外可成功诱导胚胎干细胞ES－D3细胞系成为神经样细胞,并形成网络,结合我们裸鼠眼内接种ES－D3细胞分化为神经细胞样细胞研究结果,胚胎干细胞定向分化及移植,可望成为青光眼等视网膜视神经疾病治疗的一个新的途径。