鲭鱼中组胺降解酶产生菌的分离筛选和基本酶学性质研究

鲭鱼亚目的海洋鱼类在捕获后易产生组胺,导致鲭鱼中毒．为研究组胺消长与微生物的关系,通过平板分离和摇瓶发酵,以荧光光度法测定酶活力,从鲭鱼（Pneumatophorus japonicus）皮肉、内脏和腮中分离筛选组胺降解菌,并对所产组胺降解酶的酶学性质进行研究和分析．结果表明：自内脏中分离筛选到一株组胺降解酶活力较高的革兰氏阴性杆菌,从生长产酶曲线推测该酶为初级代谢产物．该酶反应的最适温度为35℃,最适pH为7．2．在pH6．0～8．0和温度20～35℃范围内有较好的稳定性．Mn^2＋、Ca^2＋、Na^-、Mg^2＋、K^＋等金属离子存在时酶活力增加。Zn^2＋、Al^3＋、Fe^3＋、Fe^2＋、Cu^2＋等金属离子存在时,酶活力下降,在EDTA存在条件下酶活力完全丧失．对其动力学研究表明,在甘氨酸-NaOH缓冲反应体系中,最大反应速度Vmax=156．25U·mL^-1,米氏常数Km=0．22mg·mL^-1．组胺降解菌国内还朱见报道,研究结果对进一步研究水产品组胺生物控制技术具有重要意义．     

阳离子交换色谱-抑制电导检测法测定过渡金属

采用离子色谱抑制电导检测若干过渡金属离子．由于淋洗液抑制后成中性,过渡金属离子易发生水解形成氢氧化物沉淀而无法采用抑制电导检测,实验中采用在常规强酸淋洗液中加入两性离子,用于控制抑制后淋洗液的pH值．经过实验,在Waters IC-Pak CM／D柱上（150mm×3．9mm,ID）确定淋洗液条件为6．5mmol·L^-1甲基磺酸（MSA）和10mmol·L^-1 4-羟基乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）,Co^2＋、Ni^2＋、Zn^2＋和Cu^2＋等4种过渡金属离子在抑制电导检测下得到了检测信号并与碱金属、铵离子和碱土金属离子获得了较好的分离．在该实验条件下,方法具有较好的灵敏度（检测下限1．31～31．2μg·L^-1）和重现性（时间RSD小于0．86％,峰面积RSD小于5．09％）．     

一种水稻愈伤组织特异性启动子的克隆及其应用

筛选标记基因是一种用于植物遗传转化后阳性转化子筛选的有效手段,但目前介导标记基因表达均采用组成性启动子.这些启动子虽然在植物遗传转化得到了广泛应用,但由于是组成性表达,在转基因的生物安全性存在标记基因的安全性担忧.为了克服这一缺点,本文从水稻基因组内克隆了水稻半胱氨酸蛋白酶基因(Cyctein protease,CP)的启动子,通过gus转基因的验证,该启动子只在愈伤组织表达,不在水稻根、茎、叶等组织表达,为愈伤组织特异性表达启动子(Callus-specific Promoter,CSP).将该启动子用于介导筛选性标记基因的表达,通过对筛选性标记基因潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的密码子优化,明显提高了CP启动子在水稻转基因选择的转化效率,质粒转化效率和阳性植株率均达到了pCAMBIA1301的35S启动子介导标记基因hpt的选择效果.     

杏渣色素的提取工艺及稳定性研究

以加工杏浓缩浆副产品-杏渣为原料提取色素,对色素的提取工艺及稳定性进行研究,结果表明：杏渣色素的最大吸收波长λmax=410nm,最适宜的提取剂为乙醇,最佳的提取条件为：提取剂浓度为70％,提取时间为2．5h,提取温度为70℃．该色素耐光、耐热性好、抗氧化性、抗还原性较强,在碱性条件下较稳定,常用的食品添加剂蔗糖、葡萄糖、苯甲酸钠、Vc以及金属离子Fe^3＋、Mg^2＋、Al^3＋、Ca^2＋、Cu^2＋对该色素无明显影响．而食盐和柠檬酸对该色素有一定的增色作用．     

一种新的烟草钙调素结合蛋白的分离鉴定

用^35S标记的钙调素(^35S-CaM)作探针，从烟草cDNA文库中筛选到一个cDNA克隆pTCB40．DNA测序表明，分离的cDNA片段具有的开放阅读框编码233个氨基酸的多肽链．所编码钙调素结合蛋白TCB40(CaM—binding protein，CaMBP)与离子通道蛋白的同源性高达81％．凝胶覆盖实验结果证明其表达的蛋白具有依赖Ca^2 的钙调素结合活性。缺失分析表明钙调素结合位点于其蛋白的C端。Northern blot分析发现，TCB40在烟草茎，叶和花中均表达，但在叶中的表达量明显高于其他器官。     

尿酸介导OPRD1基因低甲基化影响阿尔茨海默病（英文）

探讨OPRD1基因甲基化与尿酸及阿尔茨海默病的相关性,并在细胞实验中证实尿酸可影响OPRD1基因甲基化水平.采集阿尔茨海默病组、高尿酸血症组及健康对照组的静脉血,检测OPRD1基因甲基化水平,并探讨与尿酸水平的相关性.细胞实验中,采用不同尿酸浓度先后处理细胞,分别检测OPRD1基因甲基化水平.结果表明,高尿酸血症组OPRD1基因pos2、pos4位点甲基化水平低于健康对照组,阿尔茨海默病组pos4位点甲基化水平高于健康对照组,尿酸水平与OPRD1基因甲基化水平负相关,高浓度尿酸下细胞OPRD1基因pos2、pos3、pos4位点的甲基化水平更低.由此得出尿酸可能通过介导OPRD1基因pos4位点的低甲基化修饰,从而影响阿尔茨海默病的发病.     

灰绿藜耐盐基因CgNHX转导新疆陆地棉的初步研究

以新疆陆地棉为实验材料,通过花粉管通道法向优质棉花高代材料中导入了灰绿藜耐盐基因CgNHX．经过三年连续转导的结果显示：①大田注射期间的天气状况对转导成功影响较大．当昼夜温差较大且有露水时,花和铃的状态较好,导致结铃率、卡那霉素检测阳性率增加;②棉叶基因组DNA的提取质量与棉叶采后冷藏的时间有一定相关性．采后一周内提取的棉叶DNA质量较好,PCR检测获得30％的阳性率,而两周及以后的棉叶DNA质量降低,PCR检测未获得阳性结果;③在mRNA水平上检测转基因植株的表达较为困难．本实验中PCR检测阳性的30份样品,在RT—PCR检测中均未获得目的基因的明显特异扩增条带,只有部分样品在目的条带的位置出现弥散带型．本研究初步显示外源基凶CgNHX已导入棉花受体中,但其表达情况还需进一步检测验证．     

根癌农杆菌的高效电激转化

利用电激法将双元载体质粒ＰＢＩ１２１导入根癌农杆菌ＡＧＬ－１并获得较高转化效率．探讨了不同电激条件对转化效率的影响，并检测了ＣａＭＶ３５Ｓ启动子启动ＧＵＳ基因在根癌农杆菌中的表达．结果表明：根癌农杆菌电激转化的最适电激条件为１１ｋＶ／ｃｍ，２１．５μＦ，电场强度是影响转化效率的关键因素．当质粒ＤＮＡ浓度从０．２ｍｇ／Ｌ增加至０．６ｍｇ／Ｌ时，转化效率呈线性增加．细菌密度对转化效率也有一定影响．最高转化效率为每μｇ质粒ＤＮＡ１．７×１０５转化子．组织化学反应证实ＣａＭＶ３５Ｓ能启动ＧＵＳ基因在根癌农杆菌中表达．     

集胞藻PCC6803脂肪酸脱饱和酶基因desD在转基因水稻中的表达

为了提高水稻的耐冷性，从集胞藻PCC6803中克隆酰基脂肪酸脱饱和酶基因desD与植物表达载体pCAMBIA1301连接，构建了重组质粒pCdesD。采用农杆菌介导的水稻愈伤组织转化系统将desD基因成功地导入粳稻中花11号和朝鲜的平壤21号中，获得一批转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析，证明外源基因已导入并整合到水稻的基因组中；分子检测外源基因单拷贝整合的转化体在T1代呈现3：1的分离。Northern杂交结果表明该基因在mRNA水平上获得表达。低温胁迫处理后，对转基因水稻进行脂肪酸成分和光合生理分析，结果表明转基因水稻提高了不饱和脂肪酸含量，光合生理也得到了改善，水稻的耐寒能力明显增强。     

亚硒酸钠诱导HeLa细胞凋亡机理

对亚硒酸钠诱导人宫颈痛细胞（HeLa）凋亡进行了研究，分别用荧光倒置显微镜和流式细胞仪进行凋亡形态分析和DNA片断分析．研究发现Na2SeO3对HeLa细胞的凋亡作用呈现浓度依赖性，当Na2SeO2的浓度分别为21．42，63μmol／L时，流式细胞仪检测到的细胞凋亡率分别是18．9％，33．0%，58．95．为了进一步说明凋亡过程的分子机理，分别使用Frua-2／AM和DCFH-DA两种荧光染料检测了用Na2SeO3诱导的细胞内游离Ca^2＋含量和活性氧（ROS）水平的变化。发现在凋亡过程中伴随有明显的胞内Ca^2＋和ROS水平丌高，且呈现Na2SeO3浓度卡相关性，这表明Ca^2＋和ROS在Na2SeO3诱导的HeLa细胞捌亡过程中起着重要的信号传导作用。     

棉铃虫核型多角体病毒朝鲜分离株BamHI-Ⅰ片段的核苷酸序列分析

对在朝鲜首次分离得到的棉铃虫核型多角体病毒朝鲜株(HaSNPV-KO)基因组BamHI-Ⅰ片段的全序列进行了测序与分析．该片段全长1．895kb．包括p26基因．p10基因及p74基因的3′末端序列．p26基因位于户10基因的上游．排列方向与p10基因相同，该基因的编码区大小为803bp，编码267个氨基酸，p10基因的编码区大小为261bp，编码87个氨基酸．p74基因的排列方向与p10和p26基因相反．棉铃虫核型多角体病毒朝鲜株与棉铃虫核型多角体病毒中国株(HaSNPV-g4株)的p26基因序列的同源性为99．8％，两个分离株的p10基因序列完全相同，而p74基因3′末端序列的结果有99．4％的同源性．朝鲜株与美洲株(HzSNPV)的p26和p10基因序列的同源性分别为98．8％，98．7％，而p74基因3′末端序列有97．9％的同源性．     

伪狂犬病毒糖蛋白H基因片段的克隆、序列测定和分析

对伪狂犬病毒湖北地方株(PRVHB株)糖蛋白H基因片段进行了扩增、克隆、序列测定和分析,比较了该序列与PRVKa株及NIA-3株三者之间的同源性.结果显示,克隆片段长1396bp,G+c含量75.6%,包括糖蛋白H(gH)N端283个氨基酸编码区及上游调控序列和胸苷激酶(TK)C端136个氨基酸编码区.gH基因ORF上游调控区存在有TATA框和CAT框的真核启动子特征结构.PRVHB株gH基因片段序列与PRVKa株和N1A-3株相应序列的核苷酸同源性相同,为99.6%.推导的gH多肽N端第1～30位氨基酸组成的肽段富含疏水性氨基酸,具有真核信号肽的序列特征.     

藻红蓝α亚基脱辅基蛋白基因的克隆和表达

用 Ｐ Ｃ Ｒ技术从层理鞭枝藻总 Ｄ Ｎ Ａ 中扩增藻红蓝蛋白 α亚基脱辅基蛋白的基因（ｐｅｃ Ａ）, 将ｐｅｃ Ａ 克隆于ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ,然后将ｐｅｃ Ａ 基因插入表达载体ｐ Ｇ Ｅ Ｍ Ｄ,形成的重组质粒在 Ｂ Ｌ２１（ Ｄ Ｅ３）中获得了高效表达,表达蛋白形成包涵体．高效表达的蛋白质的分子量为１９×１０３ ,与藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白的分子量一致,经 Ｄｏｔ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 进一步证实该表达蛋白为藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白     

拟南芥AtGLR1.3和AtGLR3.3启动子的GUS基因融合表达

用启动子融合GUS基因的方法,研究了AtGLR1.3和AtGLR3.3基因在拟南芥植株的组织表达.结果表明：这2个基因分别在植株的不同组织和器官内表达,具有组织表达的特异性,其中AtGLR1.3主要在根部的皮层和托叶着生部位表达;AtGLR3.3主要在植株的维管组织中表达,尤其在根部、胚轴和叶的维管组织中.从这2个基因分别在皮层和维管组织中表达,推测它们的功能与Ca2＋吸收和转运相关.     

牙鲆群体Idh-1基因座位杂合型个体选择性优势

利用淀粉凝胶水平电泳法分析了人工牙鲆种苗群体的异柠檬酸脱氢酶同工酶 (IDH) .对牙鲆材料分析得知 Idh- 1基因座位只存在 A、B两个等位基因 ,而且在 2 3个样品群中 ,有 19个样品群呈现 A、B这两个等位基因所决定的基因型的杂合型个体过剩现象 ,表现出杂合基因型的选择性优势 .设定这 19个呈杂合型过剩样品群的死亡率为零 ,即以杂合型 A/ B的成活率为 10 0 %来计算其纯合型的成活率 ,得到纯合型个体 A/ A和 B/ B的成活率分别为 6 9.2 %和 75 .2 % ;从个体的标准体长上看 ,在表现为杂合型个体过剩的 19个样品群中 ,15个样品群的杂合型个体 (A/ B)大于纯合型个体 (B/ B) .其结果反映了牙鲆人工养殖放流群体的 Idh- 1的基因型与成活率及生长存在相关性 .     

一个新的调控人类细胞死亡基因的发现

ａｓｙ基因是最近发现的一个凋亡诱发基因［１］,但诱发细胞凋亡的机制仍不清楚为研究ａｓｙ基因诱发凋亡的机制,本文以ＡＳＹ为诱饵蛋白（Ｂａｉｔ）,采用酵母双杂交系统从人肺细胞系（ＷＩ３８）ｃＤＮＡ文库中筛选ＡＳＹ结合蛋白基因从１×１０６个共转化子中,分离鉴定了３个Ｈｉｓ＋ＬａｃＺ＋克隆,其中一个克隆的插入片段与Ｇｅｎｂａｎｋ全序列比较没有发现同源基因,推测为一个新基因,命名为ａｓｙ相互作用蛋白基因ａｓｙｉｐ（ａｓｙｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）ａｓｙｉｐ基因在人的各种组织中均组成性转…     

腺病毒载体与肿瘤基因治疗

基因导入系统是恶性肿瘤基因治疗中急需解决的问题．由于腺病毒作为载体介导外源效应基因在肿瘤细胞中的高效表达,使其应用日趋增多．用于肿瘤基因治疗的腺病毒可分为复制缺陷型和复制型．常用的效应基因包括：抑癌基因,前药转换酶基因,核酶基因和细胞因子基因等     

全长和截短的δ内毒素cryIAc基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

在昆虫病毒转移载体ＰＶＬ１３９３多角体基因启动子下游克隆了全长的苏芸金杆菌δ内毒素基因ｃｒｙＩＡｃ，得到了重组转移载体ｐＴｈＹ１，用ＫｐｎＩ将ｃｒｙＩＡｃ基因进行了截短，得到了重组转移载体ｐＶＬＹ２．随后在两种重组转移载体ｃｒｙ基因的下游引入了ＩＥ１启动于驱动的ｎｅｏ基因作为筛选标记和ＳＶ４０小ｔ抗原终止区作为ｃｒｙ基因的终止信号，得到了重组转移载体ｐＶＬＹｌｎｅｏ和ＰＶＬＹ２ｎｅｏ，分别用两种重组转移载体ＤＮＡ与野生型ＡｃＮＰＶＤＮＡ共转染昆虫Ｓｆ９细胞，用Ｇ４１８筛选后经有限稀释法纯化，得到了携带全长和截短。ｒｙＩＡｃ基因的两种重组病毒ｖＶＬＹ１ｎｅｏ和ｖＶＬＹ２ｎｅｏ，分别在昆虫细胞中表达了分子量为１３３３００和８２０００的ｃｒｙ蛋白，大小分别与ｃｒｙＩＡｃ晶体蛋白和预计的截短蛋白相同，并均具有与原晶体蛋白相同的免疫活性，生物测定表明两种表达产物均具有杀虫活性，和昆虫病毒一起产生协同增效毒性．     

ltB-ureB融合基因原核表达系统的构建及其产物免疫性和佐剂活性的鉴定

构建ltB-ureB融合基因原核表达系统并对其表达产物的免疫性和佐剂活性进行鉴定.采用PCR和T-A克隆法从幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)临床菌株Y06和大肠杆菌44851株DNA中获得了ureB和ltB全长基因扩增片段及其克隆,并构建了ltB-ureB融合基因及其原核表达系统pET32a-ltB-ureB-E.coli BL21DE3.在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,并用Hp全菌抗体的Western blot、ELISA以及GM1ELISA分别证实了目的重组蛋白(rLTB-UreB)的免疫性和佐剂活性.与报道的相关序列比较,所克隆的ureB和ltB核苷酸序列同源性分别为96.88%～97.82%和99.12%～99.71%,氨基酸序列同源性为99.65%～99.82%和97.58%～99.19%.0.1～1.0 mmol/L的IPTG均能有效地诱导目的重组蛋白rLTB-UreB的表达,该蛋白主要以包涵体形式存在,其产量约为细菌总蛋白的35%.Western blot结果证实rLTB-UreB不仅能与商品化的Hp全菌抗体结合,免疫家兔后也能产生特异性抗体,表明rLTB-UreB有良好的免疫反应性及抗原性.GM1-ELISA结果显示rLTB-UreB能与牛GM1结合,表明rLTB-UreB有佐剂活性.以兔抗rLTB-UreB为一抗,发现所检测的109株Hp临床分离菌株均表达UreB;以rLTB-UreB为包被抗原,发现所检测的125例Hp感染者血清中均存在UreB抗体;表明UreB广泛存在于不同的Hp菌株中,并有很强的抗原性,也提示rLTB-UreB确有自然表达UreB的抗原特异性.本文成功地构建了LTB-UreB融合基因原核高效表达系统,所表达的LTB-UreB融合蛋白有良好的免疫性和佐剂活性,为Hp基因工程疫苗的产业化奠定了坚实的基础.     

H9N2亚型禽流感病毒细胞适应株细胞致病性和HA、NA基因序列分析

对分离自中国南方的H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Guangxi/KMⅢ/99(H9N2)进行了MDCK细胞的连续传代和NA基因序列的初步分析.研究发现,病毒接种细胞36 h左右出现细胞病变(CPE),细胞肿胀变圆,聚集,脱落.流感病毒经MDCK细胞连续传代19代后,HA效价与亲代病毒相当.将传代获得的第19代病毒进行基因克隆,与亲代病毒进行序列比较,发现经传代后其HA1羧基端的分子特征是:R-S-S-R,仍属于非低致病力毒株.