根瘤菌吸氢酶基因转移的研究

通过三亲本杂交将含有花生根瘤菌吸氢基因的质粒pZ 55(Tcr)转入不吸氢的花生根瘤菌Ra 34等菌株 (Hup- ,Nif+,Apr)中 ,筛选到既具有吸氢又具有固氮能力的花生根瘤菌结合株Rz34 2。在自生和共生条件下 ,结合株均可表达高吸氢和高固氮活性。以结合株Rz34 2接种的花生植株叶片的干重比不接种的、接种受体株Ra34(Hup- )和接种对照菌株L8 3(Hup+,Nif+)的分别高 6.2 %、7.6%和 6.3% ;种子的含氮量分别高 8 9%、1.00 %和 6.0 % ;产量分别高 188%、1 0 5%和 1 0 7%。研究结果表明 ,以含吸氢基因的结合株接种花生能提高根瘤菌与花生的共生固氮效率 ,增加作物的产量。     

固氮螺菌氢代谢与固氮作用的关系III．转座子Tn5诱变的 Azospirillum brasilense 吸氢活性缺陷株的筛选

以携带有自杀性质粒pR64：：Tn5的大肠杆菌(E．Coil RL29)为供体菌株,与受体菌巴西固氮螺菌W251-10(Azospirillura brasilense W251-10)进行杂交,在选择性平板上测得卡那霉素抗性菌落与受体菌菌落之比为5．0x 10-7。受体菌W251-10的卡那霉素抗性自发突变频率小于1.14×10-9。经气相色谱仪分析测得一株丧失吸氢酶(Hydrogen Uptake Hydrogenase)活性的突变株(编号为 Azospin llum brasilense WG15),同时发现其固氮酶(Nitrogenase)话性也已丧失。 DNA分子点杂交结果表明,所获得的突变株WGl5的总DNA中存在有’n5的序列,而w251—10呈阴性结果,从而证实了WGl5吸氢活性的丧失是由于Tn5在DNA中的插入引起的,同时也揭示了巴西固氯螺菌的吸氢酶基因(缸p)和固氮基因(nr,) 在遗传学上有着连锁的关系。     

五株大豆根瘤菌噬菌体的普遍性转导

本文研究了5种烈性大豆根瘤菌噬菌体在大豆根瘤菌菌株间的普遍性转导。噬菌体psc和psx能在慢生大豆根瘤USDA110菌株间转导营养缺陷型标记和卡那霉素抗性标记。快生大豆根瘤菌MD3菌株间可通过噬菌体pfm转导营养缺陷标记和卡那霉素抗性标记。噬菌体pfc和pfx可在快生豇豆根瘤菌ANU240及其变种ANU265间转导抗性基因和定位于共生质粒（sym质粒）上的结瘤基因（common nod）。所有转导频率均在10-6~10-7之间。用紫外线处理噬菌体裂解液可以相应提高转导频率。     

慢生型大豆根瘤菌氨基酸营养缺陷型的共生性质

经亚硝酸或转座子Tn5诱变慢生型大豆根瘤菌,分离到了23株氨基酸营养缺陷型菌株。11株需要色氨酸,7株需要组氨酸,2株需要亮氨酸,1株需要脯氨酸,1株需要异亮氨酸的不完全营养缺陷型和1株需要色氨酸和组氨酸的双重营养缺陷型。检测了这些氨基酸营养缺陷型菌株的结瘤和固氮表型。2株亮氨酸营养缺陷型和异亮氨酸不完全营养缺陷型菌株为Nod~+和Fix~+,11株色氨酸营养缺陷型中的3株虽然不能固氮,却能作为营养缺陷型结瘤。其余色氨酸、脯氨酸和组氨酸营养缺陷型只能形成无效根瘤,以这些菌株接种所形成的根瘤中仅包含原养回复突变型。双重营养缺陷型菌株TA5H5不能形成任何类似根瘤的结构。     

Tn5-Mob系统诱导根瘤菌属之间耐盐和共生性状的转移

本实验通过质粒pSUP501l及其辅助质粒RP4将Tn5-Mob随机插入苜蓿根瘤菌(Rhizo-bium meliloti 042B)的基因组中,得到86株接合子SR。随机选取4株SR,通过辅助质粒R68．45的三亲本杂交,将它们的DNA片段引入慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium,japo—nicum USDA 110),获得106株接合子BSR。大部分BSR菌株获得了生长快速的特性和耐盐性,一般能耐0．3—0．5m01／L Nacl,其中有些菌株能产生黑色素。将9o株BSR回接大豆和苜蓿植株,发现47株能在大豆和苜蓿植株结瘤,但在苜蓿卜无固氮活性;26株只能在大豆植株结瘤固氮;13株只能在苜蓿植株结瘤而不固氮;4株在大豆和菖蓿植株均不结瘤。其中,获得了4株耐盐性和固氮酶活性强的接合子。     

重组质粒pHN32对花生根瘤菌固氮的影响

通过三亲本杂交将大豆根瘤菌高效基因工程菌株HN32所携带的增效重组质粒pHN32引入一株快生型花生根瘤菌菌株85-7和另一株慢生型花生根瘤菌菌株co2-5中。花生盆栽结瘤试验结果统计分析表明:p的HN32载体质粒pLAFR1对根瘤菌85-7和co2-5的固氮功能没有影响;pHN32对85-7固氮影响不论在植株干重方面还是在固氮酶活方面统计学上都不显著;而对co2-5则植株干重提高了25.7％,存在极显著差异,固氮酶活尽管提高了51.8％,但统计学上不显著。根瘤中分离的Tc~r根瘤co2-5(pHN32)中的pHN32EcoR1酶切分析表明:pHN32没有发生结构上的变化且固氮增强作用可能由3.7kb外源片段引起。     

磁场对大豆共生固氮的效应

恒定磁场处理慢生大豆根瘤菌“005”和接种后的大豆植株,发现磁场可以提高根瘤的固氮活性。在一定的磁场强度(70—100mT)下,固氮活性平均可以提高4—5倍,植株的结瘤数和根瘤重量平均提高2—3倍。从这样的根瘤中所分离出的根瘤菌,由慢生型转变成快生型,在100植株中有17株的根瘤分离出快生菌。生长世代时间和培养溶液中的pH值与慢生型不同,而与快生型相同。     

Tn5—Mob转座系统对紫云英根瘤菌SR72的诱变和诱动作用

通过接合作用将携带有转座子 Tn5—Mob 的“自杀”性载体质粒 pSUP5011引入紫云英根瘤菌 SR72,得到卡那霉素抗性(Km~r)菌落的频率为6.99×10~(-6),测得受体菌的 Km~r 自发突变频率<10~(-8)。从对1071个 Km~r 突变体进行的植物砂培结瘤试验中筛选出结瘤不固氮(Nod~ ,Fix~-)突变株17个,不结瘤(Nod~-)突变株4个。另外,还从近3000个 Km~r 突变体中选出腺苷营养缺陷型突变株3个。通过 Tn5探针进行的菌落原位杂交试验证明:这21个共生固氮突变株中均含有 Tn5序列,进一步通过接合作用将协助质粒 RP4—4(Tc~r)引入 Nod~ ,Fix~ 突变株,获得了含有 Tn5—Mob 和 RP4—4的新突变株 SR72ZR(Km~r,Tc~r),但试图通过它们的协同作用将SR72中的大质粒诱动转移到根癌农杆菌 A136的试验未获成功.     

宋内氏福氏2a双价志贺氏菌芳香族氨基酸营养缺陷型减毒株的研究:Ⅰ.减毒株的构建

FS54是本室构建的宋内氏福氏2a双价志贺氏菌杂交株,有与志贺氏菌毒株相同的毒力。本研究通过遗传重组技术,给FS54株引入了aroD基因的转座子Tn10插入失活物(aroD∶∶Tn10),构建了FS54株的芳香族氨基酸营养缺陷型减毒株,并进一步去除了Tn10所携带的四环素抗性和宋内氏Ⅰ相大质粒(pSS120∶∶Tn5)上Tn5所携带的卡那霉素抗性,得到了宋内氏福氏2a双价志贺氏菌芳香族氨基酸营养缺陷型减毒株FS54—7b。     

耐盐高效大豆根瘤菌株的构建

快生型大豆根瘤菌RT19是一株耐盐而固氮能力差的菌株,在含有0．3 mol／L Nacl的YM培养液中生长良好,代时为3．5h,甚至在0．6mol／L NaCl条件下仍可生长。慢生型大豆根瘤菌USDA110对盐敏感,在含有0.1 mol／L Nacl的YM培养液中不生长,但结瘤固氮能力强。     

毛萼田菁茎瘤菌(Azorhizobium caulinodans)吸氢活性缺陷株的筛选及特性

利用转座子Tn5随机插入突变法,从毛萼田菁茎瘤菌（Azorhizobiumcaulinodans）中筛选得到两株吸氢活性缺陷突变株（Hup-）R－49和R－309,其固氮酶活性也大大降低,约为野生型固氮酶活性的6％～8％。以带有Bradyrhizobiumjaponicum的5．9kb的hup基因的质粒pHR11为探针与A．caulinodansORS571和B.japonicum122DES（Hup＋）的总DNA进行分子杂交,放射自显影表明,A．coulinodans基因组含有与B.japonicum的hup基因同源的DNA片段,将携带B．japonicumhup基因的嵌合质粒pHR11与A.caulinodansHup-突变株进行体内遗传互补,接合转移子吸氢酶活性可以恢复至野生型的60％,同时固氮酶的活性亦有所提高。     

大豆—根瘤菌共生固氮氢代谢的研究

检测了四株大豆根瘤菌在不同的大豆品种上形成根瘤的放氢、吸氢、固氮活性及豆血红蛋白的含量;同时测定了植株干物质的积累。结果表明,所有固氮根瘤都放氢,自生条件下Hup~-根瘤菌形成的根瘤仍不具吸氢活性,相对固氮率在0.75左右。而Hup~(?)菌株根瘤的相对固氮率在0.91～1之间。寄主植物对Hup~(?)菌株的吸氢活性有影响。相关分析表明,根瘤的豆血红蛋白与吸氢活性呈负相关。干物质积累与固氮酶活性关系最密切,氢酶活性的影响是次要的。     

紫色非硫光合细菌与大豆根瘤菌固氮作用的协同效应

从东北地区水稻及大豆根际分离出的两株紫色非硫光合细菌(球形红假单胞菌菌株N8611和胶质红假单胞菌菌株N84),分别与快生型大豆根瘤菌QB113以及慢生型大豆根瘤菌B16—11C共同培养时,其固氮比活与它们的纯培养菌相比有显著提高,说明这两类菌的固氮活性具有协同效应。两株光合细菌及其胞外组分,以及光合细菌与大豆根瘤菌共同培养时分离出的胞外组分,能显著加强由上述根瘤菌所形成根瘤的固氮活性。可以初步肯定,上述协同效应的原因之一是光合细菌胞外组分的刺激作用。     

快生型大豆根瘤菌在山东嘉祥获得了良好的田间应用效果

中国农业菌种保藏中心从我国九省、市、自治区的11个不同生态环境中收集到57株快生型大豆根瘤菌,通过水培、沙培试验,对其生物学特性进行了鉴定,通过固氮酶活性、植株干重、茎叶含氮量的测定,明确了快生型大豆根瘤菌总的共生特点.快生型大豆根瘤菌大多能与相适应的中国栽培大豆有效共生,固氮酶活性一般在200～300nMC_2H_4/克鲜瘤.分单株干重和茎叶含氮量比不接种对照提高1倍左右,比慢     

转座子Tn5诱变快生型大豆根瘤菌

大豆与其根瘤菌的共生固氮体系由于分布广效率高,在农业上的意义很大。能与大豆结根瘤的细菌有两个属:(1)慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum),目前用作生产菌剂的许多优良菌株都是这一属的成员。(2)快生型大豆根瘤菌(Rhizobium,fredii),是1982年才报道的中国特有资源,具有生长速度快的优点。大多数快生型菌株对大豆重要的生产     

超慢生型大豆根瘤菌的生理生化和共生特性的研究

超慢生型大豆根瘤菌(ESG,extra—slow-gfowing soybean rhizobium)是不同于大豆另两类共生体——慢生型大豆根瘤菌(Bradyhizobium,japonicum)和快生型大豆根瘤菌(Sin-orhizobium fredii)的新类群。它们在生长速率和生理学特性等方面均表现出较大的差异。根瘤类菌体的扫描结果表明,ESG的类菌体形态为杆状,与另外两群相近,但发现有“Y”形类菌体。ESG利用碳源范围较窄,抗生素自然耐受性比慢生型低,在柠檬酸盐培养基上不生长;代时超长,已测定的7个菌株代时为23．3-41．9h。细胞成分N,c分析结果表明,ESG在三个类群中N含量最高,C含量最低。温室盆栽试验证明ESG中大部分菌株的固氮酶活性和植株含氮量与生产用菌株相当。ESG菌株可以在绿豆上结瘤并有固氮酶活性。     

鲁黄1号大豆与根瘤菌的共生匹配性

大豆可与中华根瘤菌属及慢生根瘤菌属的多种根瘤菌共生固氮.研究大豆品种与不同种根瘤菌之间的共生匹配性,对获得高效根瘤菌用于接种,提高大豆的产量及品质有重要的理论和实践意义.本研究使用黄淮海地区的优质高蛋白大豆品种鲁黄1号从当地土壤内捕捉并分离纯化到27株根瘤菌.经持家基因recA的序列分析,发现其中18株属于中华根瘤菌属,9株属于慢生根瘤菌属.选用两个属的代表菌株各一株(Sinorhizobium fredii S6和Bradyrhizobium sp. S10),分别在蛭石、土壤盆栽及大田试验条件下,研究这两株菌单独及混合接种对鲁黄1号大豆的生长、结瘤、固氮活力、产量、种子蛋白含量及含油量的影响.结果表明： 与S10菌株相比,S6菌株对大豆的促生能力更强,对提高产量和品质的效果更好,从而确定S6为与鲁黄1号大豆相匹配的高效根瘤菌,可作为黄淮海地区推广种植鲁黄1号大豆时接种高效根瘤菌的菌种资源.
     

新疆土著大豆根瘤菌种群遗传结构的初步分析*

应用重复序列REP (repetitiveextragenicpalindromic ,重复基因外回文 )和ERIC (ente robaterialrepetitiveintergenicconsensus,肠细菌重复基因间共有序列 )结合聚合酶链式反应(ERP PCR和ERIC PCR)对从新疆采集的 2 7株土著大豆根瘤菌染色体进行指纹分析 ,发现在相似水平 0 5时可基本分为两大聚类群 ,一个类群主要包括慢生型根瘤菌 ,另一类群为快生型根瘤菌 ,来自同一地区的根瘤菌株具有较高的遗传相似性。以上结果     

根瘤菌可溶性蛋白和酯酶的电泳图谱分析

我们分析行了二十株根瘤菌可溶性蛋白和酯酶的电泳图谱。菌株中14株分离自野大豆的快生型大豆根瘤菌和3株慢生型大豆根瘤菌;另外3株根瘤菌分别分离于苜蓿、豌豆和三叶草。根据它们电泳谱带的Rf值,计算了各根瘤菌可溶性蛋白图谱间的相似性系数。快生型大豆根瘤菌的电泳图谱均不同于慢生型大豆根瘤菌和其他根瘤菌。鉴于各菌株有其独特图谱,以此作为根瘤菌分类和鉴定的依据,是较可靠的方法。     

吉林省黑土土著大豆根瘤菌的生态特性及与不同豆种的共生效应

黑土土壤中有丰富的土著大豆根瘤菌,为了稳定和提高大豆根瘤菌在黑土区的接种效果,我们从１９８８年起,对吉林省黑土土著大豆根瘤菌的类型、血清型、固氮酶活性、快慢生型的分布、结瘤竞争能力以及与不同大豆品种的共生效应等进行了测定,并提出了吉林省黑土区高固氮力和低固氮力种质。以菌体本身的固氮酶活性来看,榆树黑土为２４．８１６Ｃ２Ｈ４μｍｏｌ／克干瘤·小时,公主岭黑土为２４．８２７Ｃ２Ｈ４μｍｏｌ／克干瘤．小时．榆树黑土用４０株进行土著大豆根瘤菌血清型的测定,其中３４株属于４４７－２８血清型,６株为其它血清型。公主岭黑土用１６４株进行测定的,有１４３株属４７７－２８血清型,１７株属１１３血清型,有４株属其它血清型。榆树黑土和公主岭黑土中以慢生型大豆根瘤菌为主．共生效应测定结果,吉林２３固氮力最强,固氮量为４．２４９０８ｇ／盆;其次是长８２１０—４,固氮量为２．００９８ｇ／盆;长农５最低,为０．５４１９ｇ／盆。