广东菲牛蛭水蛭素基因的克隆和序列测定

目的：研究地理因素对水蛭素基因结构变异的影响。方法：抽提广东菲牛蛭基因组DNA，根据已发表的水蛭素基因设计一对引物，从基因组DNA扩增出一特异性的大约700bp片段，再回收，克隆和测序。结果：广东菲牛蛭水蛭素基因全长为642bp，基因有4个外显子，被三个内含子隔开，与马尼拉菲牛蛭水蛭素基因Hm1,Hm2的同源性分别为90％与88．6％，结论：地理因素会影响菲至蛭水蛭素基因结构的变异。     

凝血酶滴定法测定云南菲牛蛭中水蛭素含量的改进研究

目的 改进原云南省菲牛蛭质量标准中水蛭素的含量测定方法。方法 考察白瓷板法代替原试管方法、两种浓度的凝血酶溶液、几种滴定体积对含量测定的影响;用原方法和改进后的方法分别对五批样品进行滴定比较。结果 改进后,用白瓷板法测定,配制两种浓度的凝血酶溶液（40NIH·mL-1与20NIH·mL-1）,采用几种滴定体积（1～5μL）,每1min滴加1次,先滴加高浓度凝血酶溶液初测消耗的凝血酶溶液体积后,再用两种浓度的凝血酶溶液重新进行精确测定;增加空白对照实验,限定反应时间为10min;菲牛蛭样品浓度在0.00678～0.0597g·mL-1（r=0.9983）内与消耗的凝血酶单位量呈线性相关;五批样品的含量为156.68～234.25U·g-1,RSD均小于5%;含量供试品溶液在4℃下24h内稳定。结论 改进后的方法简便、快速,重复性和准确度较原方法好,可作为一种新的云南菲牛蛭水蛭素含量测定方法。     

菲牛蛭素体内外抗凝实验研究

目的:研究广西菲牛蛭中提取的两种菲牛蛭素--菲牛蛭素A(Bufrudin A,BA)和菲牛蛭素B(Bufrudin B,BB)在人体外及动物体内的抗凝作用.方法:观察菲牛蛭素在人体外及动物体内对部分活化凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)的影响.结果:在体内外实验中,BA、BB均能明显延长活化部分APTT、PT及TT,但两者的三个指标有明显差异性,其中BA对TT的作用最显著,BB则对PT的作用更强.结论:广西菲牛蛭中的抗凝物质BA、BB在体内外均有较强的抗凝活性.     

广西菲牛蛭提取物抗动物血栓形成的作用

目的:研究菲牛蛭提取物对抗动物血栓形成的作用.方法:采用家兔动脉血栓和大白鼠静脉血栓模型,静脉注射菲牛蛭提取物每千克60个抗凝血酶单位 (60ATU /kg),用生理盐水作阴性对照.测定其对动脉及静脉血栓形成的作用. 结果:给药后,菲牛蛭提取物对动脉血栓、静脉血栓湿重和干重均有明显减轻作用,与生理盐水对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论:菲牛蛭提取物有较强的抗动物血栓形成作用,具有潜在的临床应用价值.     

广东菲牛蛭生长和生殖的研究

目的研究室内菲牛蛭生长动态和生殖,为人工饲养菲牛蛭提供基础资料.方法在同一个卵袋产下的幼蛭,放入盛有天然水的80 cm×60 cm×50 cm的玻璃缸内饲养,每10 d称牛蛭体重1次,每天记录水温,每月换水一次,每次在野外采回的水要检测10种化学成分.在活兔身上吸血,每次称出吸血量.观察生长发育变化、记录交配产卵过程.结果从孵化出的幼蛭经14个月时间,吸血5,6次,生长发育达到性成熟,第1,2,3次吸血为幼体阶段,第4次吸血后进人亚成体阶段,第5次吸血后,部分个体达到性成熟,有的个体第6次吸血后进人性成熟.生长动态曲线是一跳跃曲线.记录了交配、产卵过程.结论阐明牛蛭生长动态和生殖过程.在室内饲养牛蛭成功.     

菲牛蛭素对血管新生作用的研究

目的：通过菲牛蛭素刺激人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管,研究其对血管新生的影响.方法：体外培养HUVEC,以血管内皮生长因子（VEGF）作阳性对照药,采用四甲基噻唑蓝（MTT）比色法测定菲牛蛭素对HU-VEC细胞活力的影响,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测菲牛蛭素对HUVEC培养液中VEGF释放含量的影响;制备CAM模型,生理盐水作对照,观察不同浓度菲牛蛭素对血管生成的影响.结果：菲牛蛭素终浓度0.25 U/mL时细胞活力最强,与空白对照组比较增殖率为28.4％,且在此浓度培养液中VEGF含量最高,比空白对照组高出80.7％;与生理盐水对照组比较,CAM血管总数明显增加,大、中血管数增加显著（P＜0.01）,小血管数变化不明显（P＞0.05）,其中以22 U/mL剂量组增生作用最明显.结论：菲牛蛭素对血管新生具有促进作用,这可能为缺血性疾病治疗提供依据.     

广东菲牛蛭中有效抗凝物质的分离纯化

目的从广东菲牛蛭鲜体中分离纯化有效抗凝物质,并对其生化性质进行测定。方法用水提醇沉、离子交换、反相层析法等分离纯化广东菲牛蛭中的抗凝物质,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其蛋白的分子质量,并运用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI—TOF—MS／MS）进行分析。结果从广东菲牛蛭中分离出得到一种电泳纯的活性多肽,其相对分子质量为19．2kDa。所得菲牛蛭抗凝活性多肽每克蛋白所含单位抗凝活性≥2548000ATU,活性回收率约为53％。结论从广东菲牛蛭鲜体中分离出的活性抗凝多肽对凝血酶具有极强的抑制作用,开发应用前景广阔。     

广东菲牛蛭生活水体的化学环境

蛭类俗称蚂蟥,是传统中药。《本草纲目》对水蛭的药理、疗效、使用方法作了较全面记载。现代药理实验表明水蛭注射液能使肿瘤细胞坏死、消失,对网状内皮细胞有增强作用。与非吸血蛭类比较,吸血的菲牛蛭唾液腺含有较丰富的抗血液凝固水蛭素,在医药学上有重要价值。有关吸血蛭类繁殖饲养研究,国内谭恩光(2002)曾报道广东菲牛蛭H irud inariam an illensis Lesson的生长和生殖,及吸血山蛭的生态分布、生长、摄食和生殖[1~3]。国外K eegan(1968)对东南亚的菲牛蛭生活习惯进行观察[4]。1992年Steiner从产自马尼拉的菲牛蛭中分离纯化新的水蛭素,…     

水蛭素衍生物基因的克隆及其在哺乳类细胞中的表达

设计特异性更高的水蛭素新突变体。化学合成编码水蛭素基因，并融合了ＲＧＤ３编码序列，通过连接，克隆、酶切筛选、ＤＮＡ序列分析，得到真核表达质粒ｐＡＰＲ－ＨＤ，表达质粒转染ＣＨＬ细胞，经Ｇ４１８筛选，获得表达克隆。     

菲牛蛭对实验性高脂血症血脂及血液流变学的影响

目的：研究菲牛蛭对高脂血症鹌鹑血脂及血液流变学的影响。方法：在高脂饲料喂饲鹌鹑2周后,用药组再同时灌服3个不同剂量的菲牛蛭（0.075g/kg、0.15g/kg、0.3g/kg）4周,6周后测定血脂水平及血液流变学指标。结果：菲牛蛭各组的TC、TG、LDL-C均显著低于模型对照组（P〈0.01）。菲牛蛭0.15g/kg、0.3g/kg剂量组的全血黏度（高切）红细胞刚性指数显著低于模型对照组（P〈0.05或P〈0.01）。菲牛蛭0.3g/kg剂量组的全血黏度（中切）、红细胞压积显著低于模型对照组（P〈0.05或P〈0.01）。结论：菲牛蛭可降低血脂,同时对血液流变学有改善作用。     

人芳香族氨基酸脱羧酶基因的克隆及测序

[目的]用RT-PCR法获得人类神经元性芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)基因全序列,并建立优化方法.[方法]从人嗜铬细胞瘤中提取组织总RNA,自行设计引物,采用两步RT-PCR法扩增出长约1550bp的基因片断,凝胶回收后与高效克隆PCR产物的新型载体T-载体连接,并转化入大肠杆菌,通过蓝白斑反应筛选出重组体,质粒提取后进行重组体的酶切鉴定及基因测序.[结果]BamHⅠ和HindⅢ酶切证实了目的基因同克隆载体进行了有效的连接,基因测序证实了所克隆的片断为人AADC基因.[结论]本实验通过对引物,Taq酶的选择及反应条件的优化,保证了扩增的有效性和特异性.新型的克隆载体明显提高了克隆效率.基因测序证实了AADC基因扩增的成功.本研究为AADC基因治疗帕金森病等多巴胺能缺乏疾病的研究打下了基础.     

小鼠内皮抑素基因的克隆及序列测定

目的 获取小鼠内皮抑素（endostatin)基因并进行序列测定,为今后研究其机制及应用创造条件。方法 以小鼠肝脏总RNA为模板,用RT-PCR法从中扩增endostatin基因,并将所得基因重组入pUC19载体质粒,采用自动测定仪及荧光素标记引物,测定目的基因序列。结果 从小鼠肝组织中成功扩增endostatin基因,莘成功克隆入pUC19载体。经酶切鉴定正确后,命名为pUC-Endo。经测序证实所获基因序列与已知的endostatin基因序列一致。结论 成功构建小鼠endo-statin基因的重组克隆pUC-Endo,为今后利用endostatin进行胶质瘤的抗血管生成治疗研究奠定了实验基础。     

HBV前S区的基因克隆及序列测定

获取ＨＢＶ前Ｓ区基因,并进行序列测定,为今后研究其机理及应用创造条件。方法：用ＰＣＲ方法从含ＨＢＶ基因组的模板中扩增ＰｒｅＳ基因,重组入Ｂｌｕｅ－ｓｃｒｉｐｔ载体,用自动测序仪,采用荧光素标记的引物,测定基因的序列,结果：成功地扩增到ＰｒｅＳＡＱ ＷＧ ＴＡ ＡＤ     

佛山市登革2型病毒流行株结构基因序列测定及分析

目的对我国登革2型病毒1993年广东省佛山市流行株GD06/93结构蛋白基因进行序列测定及分析,追踪其地域来源、基因组结构与致病性的关系,为研究开发登革病毒新型疫苗奠定基础。方法根据登革2型国际标准株NGC序列,设计2对重叠引物,RT-PCR扩增,分别克隆到pMD18-T载体,转化受体菌DH5α,挑取阳性克隆进行PCR、酶切鉴定及序列测定。结果GD06/93株结构基因序列长度为2325bp,编码775个氨基酸。与其它登革2型病毒株TSV01、Taiwan-1008DHF、NGC、44、ThD2_0038_74、ThNH81/93、gd08/98、04、Cuba165/97及S1进行比较,其核酸序列同源性分别为97%、96%、95%、95%、95%、94%、94%、92%、92%、91%。结论GD06/93病毒株的结构基因序列与已发表的其它登革2型病毒株同源性很高。在比较的6株登革2型病毒株中,GD06/93株与同期在澳大利亚流行的TSV01株同源性最高。     

可溶性白细胞介素—6受体基因的扩增,克隆及序列分析

从Ｈｅｌａ细胞中提取总ＲＮＡ，以此总ＲＮＡ为模板，应用反转录ＰＣＲ方法扩增可溶性白细胞介素－６受体基因，把得到的基因片段重组到质粒ＰＵＣ１９上，经转化、筛选和鉴定得到含有可溶性白细胞介素－６受体基因的克隆。测定其全部９９９ｂｐ核苷酸顺序，测出的核苷酸顺序与文献报道的顺序有二处不同，据此推导出的氨基酸顺序有二处变化。     

大肠杆菌硫氧还蛋白基因的克隆及序列测定

目的：获取大肠杆菌硫氧还氧白基因，并进行序列测定，为今后研究其机理及应用创造条件。方法：用ＰＣＲ法从大肠杆菌ＤＮＡ中扩增ｔｒｘＡ基因编码区，重组人ｐＵＣ１９质粒载体，用双脱氧法测定目的基因序列。结果：从大肠杆菌中成功的扩增到ｔｒｘＡ基因，测出的序列与已知基因序列一致。结论：构建了ｔｒｘＡ基因的重组克隆，为以后的深入研究奠定了基础。     

人蛋白质二硫键异构酶活性片段基因的克隆及序列测定

目的：获取人蛋白质二硫键异构酶活性片段基因，并进行序列测定，为今后研究其机理及应用创造条件。方法：从人胎肝组织中用反转录ｐＵＣ１９质粒载体，用双脱氧法双向测定目的基因序列。结果：从人胎肝组织中成功地扩增到ｈＰＤＩｆ基因，测出的序列与已知基因序列一致。结论：构建了ｈＰＯＩｆ基因的重组克隆，为以后的深入研究奠定了基础。     

球形幽门螺杆菌vacA基因的克隆及序列测定

目的：克隆球形幽门螺杆菌(HpC)vacA基因全长片段，并进行序列分析。方法：采用亚抑菌浓度的抗生素作用，使幽门螺杆菌(Hp)标准株NCTC11637发生球形变异，收集球形Hp。从HpC基因组DNA中特异扩增出vacA基因片段，扩增的目的片段经纯化回收后克隆到pMD-18T中，转化人大肠杆菌JM109。阳性重组质粒用PCR及双酶切鉴定，并进行序列测定。结果：从HpC基因组DNA中扩增出3888bp的vacA基因，构建重组质粒pMD-18T-vacA，酶切产物的大小与预期相符。测序结果显示，HpC与已公布的HpvacA基因序列的同源性达99.8％。结论：成功地对HpC vacA基因进行体外扩增及构建原核重组质粒pMD-18T-vacA，并经酶切及序列分析所验证，证明HpC含有完整的vacA基因，其可能与Hp的致病性有关。     

A型流感病毒HA(H1N1)基因真核表达载体的构建及序列分析

[目的]构建A型流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因真核表达载体,研究其作为DNA疫苗的免疫效果。[方法]从流感病人体内分离流感病毒(A/Guangdong/376/2001/H1N1),提取RNA,用特异引物进行RT-PCR,扩增HA基因,先将其克隆到pMD18-T Vector,进行序列测定和分析;然后将HA基因亚克隆到真核表达载体(pCI-neo),进行鉴定。[结果]获得一个核苷酸长度为1698bp的基因,编码565个氨基酸;同源性比较结果表明:和A/Hong Kong/1131/98(GenBank/NCBI:AF386775)有98％同源,序列分析表明有10个氨基酸出现变异;酶切和序列测定表明HA基因正确插入pCI-neo载体(HA-pCIN)。[结论]HA基因真核表达载体的成功构建,可以进一步研究其免疫功能。