蛋白激酶C在腺苷A1受体调控缺氧心肌细胞线粒体通透性转换孔开放中的表达和作用

目的 观察腺苷A1受体的活化能否影响缺氧心肌细胞线粒体通透性转换孔的开放及蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)在其中的作用.方法 将原代培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞分为5组:对照(常氧)组(A组),缺氧组(B组),缺氧 腺苷A1受体激动剂组(C组),缺氧 腺苷A1受体阻断剂组(D组),缺氧 腺苷A1受体激动剂 PKC阻断剂组(E组).缺氧6 h后以免疫荧光和免疫印迹法分析A、B、C、D 4组PKC的表达变化,用酯化钙黄绿素和氯化钴共孵育法检测5组线粒体通透性转换孔(MPTP)开放,用CCK-8法检测细胞活力.结果 缺氧6 h后,B、D、E 3组MPTP显著开放,细胞活力降低,而C组能明显减少MPTP的开放,减轻细胞损害,并能使PKC的表达量增加.结论 缺氧可引起MPTP开放增加,腺苷A1受体激动剂可上调PKC表达,减少缺氧导致的MPTP开放,维持细胞活力.PKC通路可能是腺苷A1受体调控缺氧心肌细胞MPTP开放的重要途径.     

微管损伤与缺氧心肌细胞线粒体损害的关系研究

目的探讨心肌细胞在缺氧条件下微管损伤与线粒体损害的关系。方法常规方法分离培养W istar乳鼠心肌细胞,分为正常对照组、缺氧组及缺氧微管解聚组,分别于缺氧30 m in、1 h对3组进行缺氧处理,并对缺氧微管解聚组进行特异性微管解聚剂秋水仙素解聚微管后采用流式细胞仪定量检测α-微管蛋白荧光强度变化,激光共聚焦显微镜检测α-微管蛋白及线粒体形态、分布及荧光强度变化。结果与正常对照组比较,缺氧组α-微管蛋白免疫荧光强度明显减弱(P<0.01);微管断裂,分布紊乱,线粒体分布亦出现紊乱,规律性基本丧失。与缺氧组比较,缺氧并微管解聚组微管断裂、分布紊乱、荧光强度减弱明显(P<0.01);线粒体分布弥散,完全失去规律性,基质变淡显著,荧光染色强度亦明显降低(P<0.01)。结论心肌细胞缺氧早期(30 m in)即出现微管损伤,说明微管损伤可能是导致心肌细胞线粒体损害的因素。     

羟基红花黄色素A抗心肌细胞缺氧复氧损伤的线粒体相关机制

目的：探讨羟基红花黄色素A（hydroxysafflor yellow A,HSYA）能否通过阻止线粒体通透性转换孔的开放从而保护心肌缺氧复氧损伤以及一氧化氮（NO）在线粒体机制中的作用。方法：采用酶解法分离大鼠心肌细胞模型,台盼蓝拒染法测定心肌细胞存活率;荧光染料四甲基罗丹明乙酯测定线粒体膜电位,分离线粒体测定其通透性转换孔开放程度。结果：HSYA（0.1 mmol/L）预处理5 min可明显提高缺氧复氧心肌细胞的存活率,对抗缺氧复氧引起的线粒体膜电位的去极化。在分离心肌线粒体模型上,HSYA（0.1 mmol/L,5 min）显著减弱CaCl2诱导的线粒体肿胀。一氧化氮合酶（NOS）抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯减弱了HSYA对缺氧复氧心肌细胞、线粒体肿胀和对线粒体膜去极化的保护作用。结论：HSYA预处理具有抗缺氧复氧损伤的作用,这种保护作用可能与其抑制线粒体通透性转换孔的开放有关。NO机制参与了HSYA的抗缺氧复氧损伤的保护作用。     

线粒体通透性转换孔在慢性心力衰竭中的作用及n-3PUFA的保护机制

目的 观察线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeablity transition pore, MPTP)在慢性心力衰竭模型中的作用,并初步探讨n-3PUFA的干预作用及其可能机制。方法 采用阿霉素腹腔注射Wistar大鼠建立心力衰竭模型。正常对照组10只,青年和老年心力衰竭组各20只(安慰剂组和n-3PUFA组各10只)。进行超声心动图心功能检测和心肌病理组织学检查;ELISA法检测各组大鼠血清中BNP的表达;提取心肌线粒体,检测膜电位和MPTP孔活性;TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数;免疫组化法检测各组大鼠左心室心肌细胞Cleaved-Caspase3的表达。结果 n-3PUFA治疗组与安慰剂组相比,各项心功能指标均明显改善,LVEDD和LVESD明显降低,LVEF及LVFS明显升高(P<0.05),而且心肌损害明显减轻,血清BNP明显降低(P<0.05)。心力衰竭组与对照组相比,心肌线粒体膜电位降低,MPTP孔活性增加,通透性增强,心肌细胞凋亡指数增加,心肌Cleaved-Caspase3蛋白表达升高(P<0.05)。n-3PUFA治疗组与安慰剂组相比,心肌线粒体膜电位增加,MPTP孔活性降低,通透性降低,心肌细胞凋亡指数降低,心肌Cleaved-Caspase3表达下调(P<0.05)。结论 n-3PUFA可能通过抑制心肌线粒体MPTP孔活性,抑制心肌细胞凋亡,有效改善年心力衰竭模型的心功能。     

线粒体膜通透性转换孔及其受线粒体ATP敏感性钾通道开放的影响作用机制

线粒体膜通透性转换孔(MPTP)开放是引起线粒体死亡的关键事件,多种因素可引起MPTP开放,其中线粒体ATP敏感性钾离子通道开放对MPTP的影响作用尤其受到学者的关注,在心肌细胞缺血损伤的不同时间作用不同,其作用介质与细胞内Ca2+浓度、线粒体跨膜电位、活性氧簇等有一定关系.     

AC960对微管蛋白聚合—解聚活性的影响

通过动物实验，观察了ＡＣ９６０对微管蛋白聚合－解聚活性的影响，结果显示：ＡＣ９６０能明显抑制微管蛋白聚合，其作用略弱于秋水仙碱，且同时抑制微管蛋白解聚作用。说明ＡＣ９６０抗癌机理可能在于影响微管蛋白的聚合－解聚活性，破坏纺缍丝形成，从而抑制癌细胞有丝分裂，促进其凋亡。     

LPS预处理对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的探讨14-3-3γ基因在LPS预处理对抗心肌细胞缺氧/复氧(A/R)损伤中的作用。方法构建pSU-PER/14-3-3γRNA干扰重组质粒,转染入心肌细胞,分为5组:对照组、A/R组、LPS+A/R组、pSUPER+LPS+A/R组、pSUPER/14-3-3γ+LPS+A/R组。Western blot检测14-3-3γ蛋白表达,生化自动分析仪测定乳酸脱氢酶(LDH)活性,MTT法测定细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡,线粒体肿胀实验检测线粒体通透性转换孔(mPTP)开放。结果 A/R损伤使细胞存活率下降,LDH升高,细胞凋亡增加,mPTP开放;LPS预处理可使14-3-3γ表达明显增加,通过抑制mPTP开放,对A/R损伤的细胞有保护作用;pSUPER/14-3-3γRNA干扰重组质粒通过抑制14-3-3γ蛋白表达,取消LPS预处理的保护作用。结论 LPS预处理可对抗心肌细胞缺氧/复氧损伤,其机制与上调14-3-3γ,从而抑制mPTP开放有关。     

腺嘌呤核苷酸转移酶与凋亡的研究进展

线粒体是机体的能量工厂,机体所需 ATP 的 95%由线粒体内氧化磷酸化作用而产生;而线粒体膜通透性转换是调控细胞凋亡的关键步骤和限速步骤.腺嘌呤核苷酸转移酶(adenine nucleotide translocase,ANT)作为细胞线粒体上含量最丰富的能量转运载体蛋白,既是将细胞的产能和耗能过程耦联起来的主要载体,也是组成线粒体膜通透性转换孔复合物(mitochondrial permeability transition pore complex,mtPTPC)的关键组分,参与调节线粒体膜通透性转换孔的开放,与细胞凋亡紧密相关.     

复氧前后抑制线粒体通透性转换对心肌细胞低氧/复氧损伤的影响

目的观察复氧前后抑制线粒体通透性转换（MPT）对心肌细胞低氧/复氧损伤的影响。方法新生SD大鼠心肌细胞原代培养48h后按孔随机分为空白对照组、低氧/复氧组、复氧前处理组和复氧后处理组,分别在复氧前、后10min给予1μmol/L环胞菌素A,复氧50min后用激光共聚焦显微镜观察MPT,复氧120min后采用流式细胞术和western blotting法分别观察心肌细胞凋亡和线粒体Cyt C释放。结果与低氧/复氧组比较,复氧前处理组细胞MPT明显减弱,细胞凋亡程度明显减轻,线粒体Cyt C释放显著减少。而复氧后处理组与低氧/复氧组比较差异无统计学意义。结论复氧前抑制线粒体通透性转换可以减轻心肌细胞低氧/复氧损伤,复氧后抑制线粒体通透性转换不能产生细胞保护作用。     

蛋白激酶C信号传导通路在缺氧性心肌细胞凋亡中的作用

目的　研究蛋白激酶C信号通路在心肌细胞缺氧性凋亡中的作用。方法　将培养的大鼠心肌细胞随机分成 8组 :(1 )对照组 ;(2 )缺氧 6h组 ;(3)缺氧 1 2h组 ;(4 )缺氧 2 4h组 ;(5 )PMA1 0nM组 ;(6 )PMA1 0 0nM组 ;(7)CHE1 μM组 ;(8)CHE1mM组。对照组常氧培养 2 4h。缺氧培养即将心肌细胞 95 %N2 ～ 5 %CO2 下 37℃缺氧培养。 (5 )和 (6 )组即于缺氧培养前 ,加入PKC激动剂PMA(Phorbol 1 2 myristate 1 3 acetata) ,使其终浓度分别为 1 0nM、1 0 0nM ,预处理 1 0min后再缺氧 2 4h。 (7)和 (8)组即于缺氧培养前 1 0min ,加入PKC抑制剂CHE(chelerythrine) ,使其终浓度分别为 1 μM、1mM ,然后再缺氧培养 2 4h。其余各组缺氧不同的时间。终止培养后分别检测细胞的凋亡率和活性。结果　单纯缺氧能引起心肌细胞的凋亡和坏死 ,以缺氧 2 4h最显著。PMA1 0nM预处理能明显减少心肌细胞缺氧性凋亡 (P <0 .0 5 ) ,而PMA1 0 0nM组和CHE1 μM组心肌细胞凋亡率明显增加 (P <0 .0 5 )。PMA和CHE对 2 4h缺氧诱导的心肌细胞坏死无明显影响。结论　蛋白激酶C信号传导通路参与了抗心肌细胞缺氧性凋亡的信号传导 ,但可能与抗缺氧性坏死的信号传导之间存在差异     

低氧对小鼠骨骼肌离体线粒体膜通透性转换孔功能的影响

目的:探讨低氧对小鼠骨骼肌离体线粒体膜通透性转换孔(MPTP)功能的影响。方法:雄性SPF级C57BL/6小鼠32只,随机分成低氧组和常氧组,每组16只。两组均用差速离心法分离线粒体。低氧组放入低氧环境中,常氧组置于空气中,30 min后用荧光分光光度计检测骨骼肌离体线粒体膜电位,酶标仪检测MPTP开放程度,ELISA法检测细胞色素C(CytC)含量,分光光度计法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量。结果:低氧组骨骼肌离体线粒体膜电位降低,差异有统计学意义(P<0.05);MPTP开放增加,CytC含量增加,SOD活性降低,GSH含量降低,MDA含量增加,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:低氧可导致小鼠骨骼肌离体线粒体MPTP功能异常,促进MPTP开放、释放CytC,这可能与低氧导致的氧化应激有关。     

镉对人肝细胞WRL-68离体线粒体结构及功能的影响

目的 研究氯化镉(CdCl2)对离体肝细胞线粒体结构及功能的影响.方法 从培养肝细胞(WRL-68)中提取线粒体,各组分别用0、1、5、10靘oL/L CdCl2进行处理.采用分光光度法检测线粒体膜通透性转运孔(MPTP)的开放程度;电镜下观察线粒体的形态改变;罗丹明123检测线粒体膜电位(MMP)的变化;测定线粒体内ATP酶LDH、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及丙二醛(MDA)的含量.结果 随着CdCl2浓度的增加MPTP开放程度增加,并且MPTP的开放可被环孢霉素A(CsA)所抑制;电镜观察发现,线粒体经CdCl2处理后出现不同程度的肿胀变形;CdCl:诱导MMP显著降低;同时引起SOD、GSH-Px、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶LDH活性趋于下降,5、10靘oL/L CdCl2显著下调了各种酶的活性(P＜0.05);CdCl2处理组MDA含量升高,10靘oL/L CdCl2处理组与对照组比较有统计学意义(P＜0.05).结论 CdCl2能引起离体肝细胞线粒体结构的破坏,并致MPTP开放、MMP下降、线粒体酶活性的改变等与细胞凋亡相关过程的发生.     

淫羊藿苷改善高糖培养乳鼠心肌细胞活性的线粒体相关机制

目的研究淫羊藿苷对抗体外高浓度葡萄糖诱导乳鼠心肌细胞的损伤及其潜在的线粒体相关机制。方法SD乳鼠心肌细胞分别在含5.5mmol／L葡萄糖（正常对照组）、5．5mmol／L葡萄糖＋20.0mmol／L甘露醇（高渗对照组）、25.5mmol／L葡萄糖（高糖损伤组）、25.5mmol／L葡萄糖＋10μmol／L淫羊藿苷（低剂量淫羊藿昔保护组）和25.5mmol／L葡萄糖＋100μmol／L淫羊藿苷（高剂量淫羊藿苷保护组）的培养基中进行原代培养48h后,检测细胞活力、细胞培养上清液乳酸脱氢酶（LDH）含量、细胞活性氧自由基（ROS）生成、超氧化物歧化酶（SOD）活性,同时检测心肌线粒体跨膜电位,并检测线粒体通透性转换孔（MPTP）开放值。结果与正常对照组比较,高糖培养组心肌细胞活性、细胞SOD活性及心肌线粒体跨膜电位水平均显著下降（P〈0．01）,而培养上清液LDH含量、细胞ROS生成及心肌细胞MPTP开放值则明显升高（P〈001）。淫羊藿苷干预减轻了高糖对心肌细胞各项指标的损伤,尤其是高剂量淫羊藿苷保护组的细胞活性、LDH漏出量、ROS生成值、SOD活性、MPTP开放值、线粒体跨膜电位均有明显改善。高渗对照组各项指标与正常对照组相比差异无统计学意义。结论淫羊藿苷对体外高糖培养乳鼠心肌细胞具有保护作用,其作用机制可能通过提高细月旬抗眚化能力．减少ROS诱导的心肌MPTP开放程度．维持线粒体正常跨膜电位而实现的。     

针刺预处理对大鼠缺血心肌线粒体通透孔开放的调节

目的研究电针心俞预处理对大鼠缺血心肌线粒体通透孔开放的调节。方法将大鼠随机分为空白组、模型组、针刺心俞预处理组(实验组)及缺血预处理组(对照组),采用活体大鼠心左冠脉前降支结扎法复制MIRI模型。空白组:造模前固定30 min不针刺,1次/d,连续15 d。模型组:造模前同空白组,MIRI造模。实验组:造膜前15 d开始针刺,1次/d,30 min/次,共15 d。对照组:造模前同空白组,造模行冠脉结扎前先阻断血流5 min,再灌流5 min,连续3次,共30 min缺血预处理。心肌缺血造模成功后即刻、24、48 h检测心肌细胞m PTP开放程度及对Bal-2、Caspase-3表达的影响。结果模型组激光共聚焦显微镜(LSCM)观察心肌线粒体绿色荧光对比空白组明显减弱,表明其m PTP活性显著减低(P0.01)。与模型组比,对照组与实验组即刻组LSCM观察示,心肌线粒体荧光强度明显减低,但对照组与实验组即刻组各项指标差异无统计学意义(P0.05)。实验24、48 h组与对照组及实验组即刻组对照LSCM观察线粒体荧光强度有增强(P0.05或P0.01)。实验组与对照组均可减轻MIRI损伤;且可能实验组24 h组为最佳治疗方案。实验组可下调Caspase-3、上调Bal-2。结论电针心俞预处理对缺血后不同时间心肌的保护作用存在差异,并且治疗作用随时间的改变呈增强-峰值-减弱趋势。电针心俞预处理对心肌MIRI有保护作用,其机制可能是通过调节MIRI过程中心肌m PTP的开放,减少线粒体凋亡,减轻心肌损伤有关。     

热休克预处理抑制过氧化氢所致心肌细胞Smac的释放及细胞凋亡

目的：探讨热休克预处理(heat shock pretreatment，HS)对过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)所致心肌细胞凋亡及促凋亡分子线粒体释放的第二种Caspase激活物(the second mitochondria-deftved activator of easpases，Smac)从线粒体释放的影响。方法：①采用H2O2(0．5mmol／L)导致心肌细胞凋亡；②采用热休克预处理(42℃，1h，恢复12h)诱导热休克蛋白表达；③采用Hoechst荧光染色，观察细胞凋亡发生并计算凋亡核百分率；④采用easpase活性定量检测及Western-blotting观察caspase-3，9的活化；采用免疫荧光及Western-blotting检测细胞成分分离后Smac从线粒体的释放。结果：①H2O2处理2h，Smac从心肌细胞线粒体释放入胞浆；处理4hcaspase-3，9活性升高，12h达高峰；处理24h心肌细胞明显出现凋亡，凋亡核百分率明显升高；②热休克预处理可诱导心肌细胞中HSP90。HSP70及αB-晶状体蛋白的表达增高；抑制Smac释放、caspase-3，9的活化及细胞凋亡的发生。结论：线粒体信号通路在H2O2所致的心肌细胞凋亡中发挥重要作用；热休克预处理通过抑制上述通路而减轻H2O2所致的细胞凋亡，其机制与其诱导热休克蛋白表达、阻断Smac从线粒体向胞浆释放、抑制caspase-3，9的活化有关。     

热休克预处理抑制过氧化氢所致心肌细胞Smac的释放及细胞凋亡

目的 :探讨热休克预处理 (heatshockpretreatment,HS)对过氧化氢 (hydrogenperoxide ,H2 O2 )所致心肌细胞凋亡及促凋亡分子线粒体释放的第二种Caspase激活物 (thesecondmitochondria derivedactivatorofcaspases ,Smac)从线粒体释放的影响。方法 :①采用H2 O2 (0 .5mmol/L)导致心肌细胞凋亡 ;②采用热休克预处理 (4 2℃ ,1h ,恢复 12h)诱导热休克蛋白表达 ;③采用Hoechst荧光染色 ,观察细胞凋亡发生并计算凋亡核百分率 ;④采用cas pase活性定量检测及Western blotting观察caspase 3,9的活化 ;采用免疫荧光及Western blotting检测细胞成分分离后Smac从线粒体的释放。结果 :①H2 O2 处理 2h ,Smac从心肌细胞线粒体释放入胞浆 ;处理 4hcaspase 3,9活性升高 ,12h达高峰 ;处理 2 4h心肌细胞明显出现凋亡 ,凋亡核百分率明显升高 ;②热休克预处理可诱导心肌细胞中HSP90 ,HSP70及αB 晶状体蛋白的表达增高 ;抑制Smac释放、caspase 3,9的活化及细胞凋亡的发生。结论 :线粒体信号通路在H2 O2 所致的心肌细胞凋亡中发挥重要作用 ;热休克预处理通过抑制上述通路而减轻H2 O2 所致的细胞凋亡 ,其机制与其诱导热休克蛋白表达、阻断Smac从线粒体向胞浆释放、抑制caspase 3,9的活化有关。     

HIF-3α在线粒体的表达及意义

  目的  探究低氧诱导因子-3α(HIF-3α)定位至线粒体的现象及其生理、病理意义。  方法  ① 低氧(1%O₂)或脯氨酸羟化酶抑制剂——二甲基乙二酰甘氨酸(DMOG)、氯化钴(CoCl₂)模拟低氧处理人宫颈癌细胞系HeLa和人肾癌细胞系ACHN后,蛋白质免疫印迹(Western blot)和免疫荧光(IF)检测HIF-3α在细胞中的分布及其在线粒体中的表达;②通过酶敏感实验观察HIF-3α的线粒体亚结构定位;③采用Western blot检测HIF-3α在正常小鼠不同器官组织、人肝癌组织线粒体中的表达情况。  结果  ① 在检测的2种细胞系(HeLa和ACHN细胞)中,HIF-3α在常氧及缺氧条件下均可定位至线粒体,且缺氧组HIF-3α在线粒体中的表达高于常氧组;②HIF-3α的消化模式与线粒体外膜蛋白一致;③HIF-3α在小鼠多种器官组织中均可定位线粒体,HIF-3α在人肝癌组织线粒体中的表达高于正常及癌旁组织。结论HIF-3α在常氧及缺氧条件下均可定位至线粒体外膜,低氧可促进其线粒体定位;该现象可能与肝癌的发生发展相关。     

慢性低氧高二氧化碳对小鼠大脑线粒体功能的影响

目的：探讨慢性低氧高二氧化碳对小鼠大脑线粒体功能的影响。方法：雄性C57BL/6小鼠30只,随机分成2组：A组（低氧高二氧化碳组15只）和B组（正常对照组15只）。A组饲养于氧舱中,舱内氧浓度为9%～11%,二氧化碳浓度为5%～6%,每天8h～每周6d,共4周,其余时间与B组一样,生活于正常环境。测量脑组织ATP,ADP,AMP的浓度;线粒体膜电位、COXⅠ和Ⅲ活性。结果：低氧高二氧化碳组小鼠脑组织ATP,AMP浓度显著低于正常对照组（P〈0.01）,线粒体形态明显改变,脑线粒体膜电位低下、COXⅠ和Ⅲ活性受到抑制（P〈0.01）,脑组织SOD、GSH活性降低（P〈0.01）。结论：慢性低氧高二氧化碳可导致小鼠大脑线粒体功能明显异常,其机制可能与氧化应激反应有关。     

低硒心肌损伤与硫氧还蛋白还原酶的关系研究

目的　研究长期低硒心肌硫氧还蛋白还原酶的活性和表达改变 ,探讨硫氧还蛋白还原酶与心肌损伤的关系。方法　用低硒饲料喂养Wistar大鼠 14周 ,通过透射电镜观察心肌的病理学改变 ,采用生物化学方法和Westernblot杂交检测心肌组织中硫氧还蛋白还原酶的活性及蛋白表达。结果　低硒导致大鼠心肌线粒体轻度损伤。低硒组大鼠心肌硫氧还蛋白还原酶活性降低至对照组的 6 3.8% ,经t检验P <0 .0 1。蛋白杂交扫描结果显示 ,常硒组峰面积为 3438,低硒组峰面积为 2 0 6 7。结论　低硒降低硫氧还蛋白还原酶的活性和蛋白表达水平 ,使心肌抗氧化能力减低 ,引起心肌损伤。