CpG ODN抑制EB病毒复制的体外研究

目的:探讨CpG寡脱氧核苷酸链(CpG ODN)体外对EB病毒(EBV)复制的抑制作用.方法:CpG ODN体外预处理人外周血单个核细胞(PBMC)后感染EBV,用荧光定量PCR和ELISA分别检测培养后PBMC中EBV拷贝数和培养上清液中γ干扰素(IFN-γ)的水平,了解不同剂量、不同时间CpG ODN预处理PBMC中EBV复制和PBMC产生IFN-γ之间的关系.结果:(1)不同浓度CpG ODN预处理组的EBV拷贝数均低于未处理组( P <0.05),其中10 mg/L CpG ODN预处理组EBV拷贝数最低,为(3.85±0.37)×10 8基因拷贝/L;(2)CpG ODN预处理48 h组的EBV拷贝数(11.32±0.83)×10 8基因拷贝/L低于其余各预处理时间组的EBV拷贝数( P<0.05);(3)不同浓度CpG ODN预处理组培养上清液中的IFN-γ均高于PBMC组和PBMC+EBV组( P <0.05),其中 10 mg/L CpG ODN处理组IFN-γ量最高(66.27±6.29)ng/L;(4)CpG ODN预处理48 h的PBMC+CpG ODN+EBV组培养上清液中IFN-γ(51.74±4.09)ng/L高于其余各预处理时间组和PBMC组及PBMC+EBV组( P <0.05).结论:CpG ODN作为一种新型的免疫调节剂,在体外能有效抑制EBV复制,其作用机制可能与诱导PBMC产生IFN-γ有关.     

不同因素对非甲基化CpG ODN佐剂活性的影响

cpG ODN即含有胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸的寡脱氧核苷酸，研究发现，非甲基化的CpG ODN能够显著促进机体的特异性及非特异性免疫应答，是一种高效的THl型疫苗佐剂，它的佐剂活性与其结构有着密切的关系。我们综合考虑了可能影响CpG CDN佐剂活性的6个因素，即骨架是否进行了硫代修饰、是否具有回文结构、CpC基序侧翼序列的种     

CpG ODN作为乙型肝炎疫苗佐剂的研究进展

随着对含有CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)的结构、功能以及作用机理的深入研究，CpG ODN已经应用于疾病的治疗和预防等许多方面。本文就CpG ODN作为乙型肝炎疫苗佐剂的研究进展做一综述。     

CpG ODN的体外免疫活性及其作为乙肝疫苗佐剂的研究新进展

为了增强乙肝疫苗的免疫效力,开发研制新型疫苗佐剂是当前国内外学者研究的热点之一。近年来的研究表明：含CpG基序的寡脱氧核苷酸（CpG ODN）在体外实验中,对人和鼠的多种免疫细胞有活化作用;在动物实验中,CpG ODN不仅可增强乙肝疫苗的体液免疫应答,还可增强其细胞免疫应答,这正是铝佐剂所达不到的,且CpG ODN与铝佐剂具有协同效应,今后可考虑双佐剂联合乙肝疫苗接种,能提高接种人群的应答率,刺激机体产生更有效的保护作用;动物实验还显示,CpG ODN能增强HBV转基因小鼠对乙肝疫苗的免疫应答和抗病毒效应,说明乙肝疫苗辅以CpG ODN可望作为临床上免疫治疗慢性HBV感染的可行性途径;Ⅰ期临床试验表明CpG ODN对人体较安全。     

CpG ODN作为乙型肝炎疫苗佐剂的研究进展

随着对含有CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)的结构、功能以及作用机理的深入研究,CpGODN已经应用于疾病的治疗和预防等许多方面。本文就CpG ODN作为乙型肝炎疫苗佐剂的研究进展做一综述     

免疫调节性寡聚脱氧核苷酸筛选方法的建立、优化和应用

目的:建立一套合理而便捷的实验体系,为开发新型免疫调节性寡聚脱氧核苷酸(ODN)提供筛选方法。方法:利用含有CpG基序的免疫刺激性寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)作为刺激物,将人外周血单个核细胞(PBMC)作为研究对象,分别以细胞的增殖程度和刺激上清的抗病毒活性作为检测指标,优化各项实验条件,综合评定寡聚脱氧核苷酸的免疫调节活性。结果:成功建立了由阳性免疫调节性ODNA151抑制CpG ODN诱导的人PBMC增殖及抗病毒活性的筛选方法。结论:免疫调节性ODN筛选方法的成功建立,为下一步研究开发新型免疫调节性ODN奠定了基础。     

CpG寡脱氧核苷酸对外周血单个核细胞功能的影响：1型糖尿病患者与健康者对照

背景：有研究表明CpG寡脱氧核苷酸可增强外周血单个核细胞的功能,但对1型糖尿病患者的影响至今少有报道。 目的：观察CpG寡脱氧核苷酸对1型糖尿患者患者与健康志愿者外周血单个核细胞γ干扰素、白细胞介素12,10表达的影响。 方法：将1型糖尿病患者与健康志愿者的外周血单个核细胞根据刺激物不同分为空白对照组、CpG寡脱氧核苷酸组。用RT-PCR法检测外周血单个核细胞γ干扰素、白细胞介素12 mRNA和白细胞介素10 mRNA的表达。 结果与结论：1型糖尿患者γ干扰素和白细胞介素12 mRNA的表达明显低于健康志愿者(P < 0.01)。1型糖尿患者与健康志愿者外周血单个核细胞经CpG寡脱氧核苷酸组刺激后,γ干扰素和白细胞介素12 mRNA的表达增高(P < 0.01),白细胞介素10 mRNA的表达无差异(P > 0.05)。结果提示,CpG寡脱氧核苷酸可促进1型糖尿患者外周血单个核细胞表达γ干扰素和白细胞介素12。     

CpG-ODN气道内应用抑制哮喘小鼠过敏性气道炎症及GATA-3的表达

目的　研究气道内应用CpG寡脱氧核苷酸 (CpG ODN)对小鼠哮喘模型气道过敏性炎症的治疗作用及对肺内GATA 3表达的影响。方法　鸡卵蛋白 (OVA)免疫BALB c小鼠建立哮喘模型 ,激发后 1h气道内滴入 10 0 μgCpG ODN ,处死动物后观察支气管肺泡灌洗液 (BALF)中白细胞总数、嗜酸性粒细胞百分比 (EOS % )的变化及IL 4、IL 5、IL 12、IFN γ的含量变化。取肺组织行病理切片HE染色、AB PAS染色检查 ,观察小鼠气道炎症情况 ,免疫组化染色观察CpG ODN对小鼠哮喘模型肺部GATA 3表达的影响。结果　CpG ODN治疗组BALF中IL 12和IFN γ的产生增加 ,IL 4、IL 5的产生减少 ,BALF中细胞总数及嗜酸性粒细胞比例降低 ,肺部炎症情况明显减轻 ,肺血管周围及支气管周围表达GATA 3的细胞数较哮喘模型组及对照寡核苷酸治疗组明显减少。结论　哮喘小鼠激发阶段气道内滴入CpG可能通过诱导IL 12、IFN γ产生 ,抑制GATA 3的表达 ,导致TH2型细胞因子的产生减少 ,从而减轻哮喘气道过敏性炎症。     

IDO调节Th1/Th2平衡的研究进展

吲哚胺2,3双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)是色氨酸代谢的限速酶,在人和动物的许多组织和细胞中,如树突状细胞(DC)、巨噬细胞、上皮细胞、嗜酸性粒细胞及肿瘤细胞等均可见IDO的表达[1-4].一些细胞因子如IFN-γ、脂多糖(LPS)和CpG寡脱氧核苷酸(ODN)等可通过Toll样受体(TLR)信号途径及CTLA-4-B7的相互作用诱导其高表达[5-7].     

增强CpG免疫刺激作用途径的研究进展

<正>CpG基序(CpG motifs)是指含有非甲基化的胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)核苷酸核心的寡聚脱氧核苷酸(ODN)序列,又称为免疫刺激序列,一般为6个寡聚核苷酸。1995年,Krieg等[1]研究发现非甲基化的CpG二寡聚核苷酸是病原体DNA免疫刺激活性的结构基础,自此,对CpG基序的各种研究得以展开,包括CpG基序免疫刺激机制、CpG基序个数及结构对免疫刺激活性影响、CpG寡聚脱氧核苷酸作为佐剂使用等。含有非甲基化CpG二核苷酸的寡聚脱氧核苷酸作为一种免疫增强剂,在体内和体外均表现免疫刺激作用,可以引起先天性免疫反应。CpG在体内能引起明显且多样化     

CpG ODN生物学活性和免疫作用的研究进展

CpG ODN为人工合成的含胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸的寡聚脱氧核苷酸,能与Toll样受体9(TLR9)结合而发挥作用.CpG ODN能直接或间接激活树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞以及B淋巴细胞、NK细胞、T淋巴细胞等,使之分泌许多生物活性因子和细胞因子,从而在感染性疾病和肿瘤的免疫治疗中发挥重要作用.     

C型CpG单链寡核苷酸对肿瘤疫苗抑瘤效果的增强作用

目的：研究C型CpG单链寡脱氧核苷酸（CpG ODN）对肿瘤疫苗抑瘤效果的增强作用.方法：利用体外淋巴细胞增生实验和病毒保护实验确定新C型CpG ODN, 采用小鼠体内抑瘤实验观察CpG ODN对肿瘤疫苗HSP65-MUC1重组蛋白抑制MUC1阳性肿瘤生长的增强作用, 并对小鼠血清中抗HSP65-MUC1抗体的类型进行了初步鉴定.结果：自行设计的CpG ODN BW005能刺激人PBMC和小鼠脾细胞增生,其刺激后的培养上清具有保护Vero E6细胞免受VSV感染的作用, 属于新型C型CpG ODN.将BW005与HSP65-MUC1联合应用于C57BL/6小鼠后, MUC1阳性肿瘤的发生明显延缓（平均44.8 d）, 其终末肿瘤发生率最低（33.33%）;荷瘤小鼠的生存期明显延长（平均49.5 d）, 其终末生存率最高（66.67%）.小鼠血清中抗HSP65和抗MUC1的IgG2a抗体水平增加.结论：C型CpG ODN可以增强肿瘤疫苗HSP65-MUC1的抑瘤效果, 考虑与小鼠体内Th1环境的形成有关.     

CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)协同促进脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞增殖与迁移

目的探讨CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞增殖与迁移能力的影响及机制。方法使用1 mg/L LPS处理小鼠RAW264.7巨噬细胞建立体外炎症细胞模型,采用CCK-8法检测CpG ODN(500 nmol/L)对LPS诱导的巨噬细胞增殖的影响,采用Transwell~(TM)实验检测CpG ODN对细胞迁移能力的影响;采用Western blot法检测p38丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)、 c-Jun氨基末端激酶(JNK)、胞外信号调节激酶(ERK)、核因子κBp65(NF-κB p65)的蛋白磷酸化水平,同时使用以上通路的抑制剂SB203580、 SP600125、 PD98059、 BAY11-7082,探讨CpG ODN发挥效应的机制;采用实时定量PCR检测CpG ODN对LPS诱导产生的单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、环加氧酶2(COX2)mRNA水平的影响。结果 CpG ODN协同促进LPS诱导的巨噬细胞增殖与迁移,并促进COX2、 MCP-1的转录,增强JNK、 ERK信号通路蛋白的磷酸化水平,并且JNK与ERK信号通路激酶抑制剂可有效降低CpG ODN的协同效应。结论 CpG ODN可通过JNK与ERK途径协同促进LPS诱导的巨噬细胞增殖与迁移并促进COX2、 MCP-1的转录。     

体外联合应用CD80和CD28/CpG ODN共刺激活化人外周血单个核细胞 对胃癌细胞株MKN45有靶向杀伤作用吗?

背景:启动维持并调节活化级联反应,决定了T细胞是活化增殖或转变为无反应状态甚至凋亡。B7分子与CD28的结合能有效协同T细胞受体途径活化T细胞,增强T细胞的增殖活性。目的:初步分析CD80和CD28/含CpG的寡脱氧核苷酸(CpG containing oligodeoxynucleotides,CpG ODN)共刺激活化的人外周血单个核细胞对胃癌细胞株MKN45的杀伤作用。方法:Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,加入白细胞介素2及CD28,CpG ODN共刺激活化培养1~5d。取MKN45细胞,设立4组:CD28/CpG ODN共刺激组、CD80联合CD28/CpG ODN共刺激组、单纯CD80组、空白对照组。以MTT法检测细胞杀伤率,电镜观察凋亡的MKN45细胞超微结构,流式细胞仪检测MKN45细胞凋亡率。结果与结论:单纯CD80组对MKN45细胞无明显杀伤作用;与CD28/CpG ODN共刺激组比较,CD80联合CD28/CpG ODN共刺激组对MKN45细胞的杀伤作用显著增强(P0.05),效应细胞与靶细胞之比达15︰1时即可达到半数杀伤率。电镜下效应细胞作用24h,MKN45细胞就部分发生坏死,部分细胞可见凋亡。与空白对照组比较,单纯CD80组MKN45细胞凋亡率显著升高(P0.01)。提示CD80与共刺激活化的外周血单个核细胞合用,可提高活化的外周血单个核细胞对MKN45细胞的靶向性杀伤作用。     

CpG ODN激活慢性HBV感染者外周血单个核细胞和CD4+T细胞功能的研究

目的 探讨人工合成硫代修饰的含CpG基序的寡脱氧核苷酸(ODN)作为佐剂对慢性HBV感染者PBMC和CD4+T细胞产生免疫应答的影响.方法 将入选慢性HBV感染者20例分成两组,免疫耐受组和免疫清除组各10例,用CoG ODN、HBsAg、M[CpG ODN+HBsAg]分别与同一感染者的PBMC和CD4+T细胞孵育,采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测两种细胞IFN-γ的分泌情况,以斑点数的多少来评价细胞分泌IFN-γ的能力.结果 CpG ODN、HBsAg、MECpG ODN+HBsAg]与PBMC孵育后IFN-γ斑点数是3±8、339±429、375±496;与CD4+Tcell孵育后IFN-γ斑点数是1±4、5±16、5±12.在免疫耐受组,CpG ODN、HBsAg、M[CpG ODN+HBsAg]与PBMC孵育后IFN-γ斑点数是3±8、361±153、375±276;与CD4+ Tcell孵育后IFN-γ斑点数是0±2、2±2、4±4.在免疫清除组,CoG ODN、HBsAg、M[CoGODN+HBsAg]与PBMC孵育后IFN-γ斑点数是3±21、289±345、405±656;与CD4+ Tcell孵育后IFN-γ斑点数是2±14、8±40、7±30.PBMC与HBsAg、M孵育后IFN-γ斑点数比较统计分析P=0.720;CD4+ Tcell与HBsAg、M孵育后IFN-γ斑点数统计分析P=0.890,两种不同细胞中与M孵育后IFN-γ斑点数比较统计分析得P=0.000.结论 在免疫耐受组和免疫清除组,CpG ODN不显著增加HBsAg刺激PBMC和CD4+ T细胞分泌IFN-γ,但CpG ODN对PBMC刺激效果优于CD4+T细胞.     

CpG ODN核心序列改变对其生物学活性的影响

目的：观察含CpG基序寡核苷酸（CpG ODN）核心序列改变后对其细胞内化和免疫活性的影响。方法：人工合成6-FAM标记的CpG ODN，将其核心序列CpG二核苷酸的胞嘧啶（C）甲基化（mCpG ODN）、胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）顺序颠倒（GpC ODN），在RAW264.7细胞培养体系中加入不同的ODN后，应用流式细胞术和激光共聚焦显微镜观察ODN的细胞内化与定位，ELISA法检测ODN对细胞释放TNF-α的影响。结果：CpG ODN核心序列的改变不影响其在细胞内的聚集，激光共聚焦术检测发现6-FAM ODN被内化进入RAW264.7细胞，绿色荧光小体呈散点状分布于细胞中；胞嘧啶甲基化后，mCpG ODN促细胞释放TNF-α的作用显著降低（P<0.01），仅保留部分刺激活性，但是GpC ODN几乎丧失了促细胞释放TNF-α的作用。结论：CG序列对CpG ODN的生物活性至关重要，胞嘧啶C甲基化不影响CpG ODN在细胞内的定位，但能部分抑制CpG ODN的免疫活性。     

CpG ODN对rHBsAg免疫小鼠Th1/Th2型免疫应答的影响

目的：初步探讨CpC寡脱氧核苷酸(CpG ODN)与重组乙型肝炎表面抗原(rHBsAg)联合免疫小鼠的Th1／Th2型免疫应答效应。方法：BALB／c小鼠经后腿胫骨前肌免疫2次，ELISA法检测血清乙型肝炎表面抗体(抗-HBs)IgG亚类IgG2a/IgG1的比值；生物活性法检测脾细胞诱生上清中的IFN-γ和IL-2含量；ABC-ELISA法检测小鼠血清中IL-4、IL-10及IL-12含量。结果：加CpG ODN组与单独注射rHBsAg组相比：抗-HBs IgG亚类IgG2a／IgG1比值明显高；Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2的表达增强，抑制Th2型细胞因子IL-4和IL-10的产生。结论：CpCODN能够明显增强rHBsAg免疫小鼠Th1型抗体亚类IgG2a的产生，并且诱导Th1型细胞因子的表达，抑制Th2型细胞因子的表达。     

Immunogenicity and safety of liposome-vaccine encapsulating hepatitis B surface antigen and phosphodiester CpG oligodeoxynucleotides

CpG oligodeoxynucleotides (CpG ODN) as adjuvant have been extensively studied in recent years. Phosphodiester CpG ODN (PO CpG ODN) can perfectly mimic bacterial DNA in enhancing immune response but are vulnerable to nucleases in vivo . This study aimed to evaluate the immunostimulatory potential and safety of phosphodiester CpG ODN encapsulated in nonphospholipid liposomes. BALB/c mice were immunized intramuscularly with different formulations of liposomes,CpG ODN and hepatitis B surface antigen (HBsAg). The results demonstrated that the encapsulated PO CpG ODN were protected against rapid degradation in vivo and retained their adjuvant activity. PO CpG ODN encapsulated with HBsAg in liposomes induced strong Th1-biased or Th1/Th2 mixed humoral immune response in mice with the magnitude similar to their phosphothioate equivalent in the same formulation. High IFN-gamma production induced by this formulation confirmed the generation of strong cellular immune response. Additionally, co-delivery of HBsAg and PO CpG ODN improved the immune response over that obtained with separate delivery. Safety experiment showed that liposome-encapsulaed PO CpG ODN and HBsAg caused mild systemic and moderate local adverse reaction. In conclusion, our data shows that PO CpG ODN encapsulated in liposomes fully exhibit their Th1-type adjuvant activity and act as a potential adjuvant for vaccines.     

CpG ODN促进树突状细胞成熟的实验研究

目的：研究CpG ODN对小鼠骨髓来源的树突状细胞(bone marrow—derived dendritic cells,BMDC)分化成熟的影响。方法：以含非甲基化CpG基序的寡核苷酸(unmethylated CpG motif containing oligonucleotides,CpG ODN)刺激BMDC，流式细胞术检测DC膜表面CD80表达，ELISA检测DC分泌IL-l2水平，MTT法测定CpG ODN活化的DC刺激T细胞培殖能力。结果：CpG ODN可显著刺激DC表达CD80，分泌IL-l2，增强DC刺激T细胞增殖的能力。结论：CpG ODN可以有效促进DC的功能成熟。     

细菌DNA对小鼠脾淋巴转化的影响

近年来发现，细菌DNA具有很强的免疫刺激活性，其可通过激活多种免疫细胞活性，加强机体的先天性防御反应与获得性免疫反应。有关研究显示，细菌DNA的这种免疫刺激活性依赖于DNA中某些特定的非甲基化CpG二核苷酸序列。模仿细菌DNA中的天然CpG序列合成含非甲基化CpG的寡核苷酸(Oligodeoxynucleotides，ODN)也具有强烈的免