外排泵msrA在表皮葡萄球菌生物被膜对红霉素耐药性中的作用

目的:探讨外排泵msrA在表皮葡萄球菌生物被膜对红霉素耐药性中的作用.方法:从野生菌株中克隆msrA基因全长,并通过穿梭载体pBT2电转化至限制缺陷菌株金黄色葡萄球菌RN4220,提取质粒后再转化S.epidermidis 1457(ica ,产膜阳性菌),得到S.epidermidis 1457-msrA.实时荧光RT-PCR检测S.epidermidis 1457-msrA和野生株S68浮游菌、生物被膜内细菌红霉素作用24 h前后msrA mRNA的表达.结果:表葡膜内菌msrA的表达在红霉素(10倍MIC)作用前后未见统计学差异.结论:提示膜内菌对红霉素耐药性的增加可能与外排泵基因的上调无关.     

导管分离表皮葡萄球菌生物被膜形成能力相关研究

目的：探讨导管分离表皮葡萄球菌的生物被膜形成能力和耐受应激环境能力。方法采用结晶紫半定量法和细菌计数法检测表皮葡萄球菌的生物被膜形成能力和应激环境耐受能力。结果表皮葡萄球菌1457菌株和5株导管分离菌株均具有生物被膜形成能力,菌株之间生物被膜形成能力差异无统计学意义（ P＞0．05）;导管分离菌株与1457菌株的游离细菌和被膜细菌的生长能力、对高分子材料的黏附能力、对过氧化氢的氧化应激耐受能力和对乙醇耐受能力差异无统计学意义（P＞0．05）。结论表皮葡萄球菌导管分离菌株与产生生物被膜的表皮葡萄球菌1457菌株具有相近的生物被膜形成能力和耐受应激环境能力。     

SigB (Q225P)突变促进金黄色葡萄球菌生物被膜形成

目的 探讨金黄色葡萄球菌SigB(Q225P)突变对其生物被膜形成能力的影响.方法 比较临床分离金葡菌(XQ株)与实验室传代获得菌落颜色变白之XQW株的生物学特性,通过结晶紫染色法以及激光共聚焦检测菌株的生物被膜形成.进行XQ及XQW全基因组测序,比较相关基因,寻找突变位点.分别扩增sigB(Q225P)基因及其上游片段,经酶切后连接穿梭载体pBT2,构建同源重组质粒pBT2-sigB(Q225P),电转化至金葡菌RN4220,再将经RN4220修饰后的质粒电转入Newman.利用pBT2质粒对温度敏感的特点筛选Newman-sigB(Q225P).利用同样的方法构建sigB敲除菌株Newman-△sigB,并构建回补菌株Newman-△sigB/sigB以及Newman-△sigB/sigB(Q225P).比较这些菌株的生物被膜形成差异.结果 XQW株在液体培养基中呈絮状生长,结晶紫法以及激光共聚焦检测结果显示其生物被膜形成能力显著强于野生株,全基因组测序和比较发现XQW的sigB基因发生(Q225P)突变.构建的同源重组质粒pBT2-sigB(Q225P)及pBT2-△sigB转化金葡菌Newman后,经筛选,获得Newman-sigB(Q225P)及Newman-△sigB菌株;回补质粒pLI50-sigB及pLI50-sigB (Q225P)转化Newman-△sigB,筛选获得回补菌株Newman-△sigB/sigB及Newman-△sigB/sigB(Q225 P).经过结晶紫染色法及激光共聚焦测定生物被膜,发现Newman-sigB(Q225P)较野生株的生物被膜形成能力显著升高,与XQW的生物被膜形成能力强于XQ野生型的表型相一致;Newman-△sigB/sigB(Q225P)的生物被膜形成能力明显高于Newman-△sigB/sigB.结论 SigB (Q225P)具有促进金葡菌生物被膜形成的能力.     

葡萄球菌对大环内酯类抗生素耐药性检测

目的检测临床分离的葡萄球菌(金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌)对大环内酯类抗生素的耐药性。方法用琼脂稀释法测定328株葡萄球菌(金葡菌185株,表皮葡萄球菌143株)对红霉素、罗红霉素、阿奇霉素、克林霉素的最低抑菌浓度(MIC)值,用D实验检测红霉素对克林霉素的诱导耐药性。结果耐甲氧西林金葡菌对红霉素、罗红霉素、阿奇霉素和克林霉素的耐药率分别为90·7%、96·9%、97·9%和84·5%;甲氧西林敏感金葡菌对红霉素、罗红霉素、阿奇霉素和克林霉素的耐药率分别为79·5%、75%、76·1%和72.7%。耐甲氧西林表皮葡萄球菌对红霉素、罗红霉素、阿奇霉素的耐药率均为100·0%,对克林霉素的耐药率为99·1%;甲氧西林敏感表皮葡萄球菌对红霉素的耐药率为94·1%,对罗红霉素、阿奇霉素、克林霉素的耐药率均为97·1%。19株对红霉素耐药、克林霉素敏感的金黄色葡萄球菌,D试验阳性9株(9/19);2株对红霉素耐药、克林霉素敏感的表皮葡萄球菌,D试验均阴性。结论葡萄球菌对大环内酯类抗菌药物耐药显著,此类药物不宜用于葡萄球菌感染的治疗。     

trap基因表达在表皮葡萄球菌生物膜形成及附属基因调节（agr）系统活化中的作用

目的研究表皮葡萄球菌trap基因表达与生物膜形成的相关性及其对agr系统的活化作用。方法采用微量板半定量法检测表皮葡萄球菌生物膜表型，二维电泳和高灵敏度的基质辅助激光解吸附飞行时间质谱分析比较表皮葡萄球菌标准株蛋白质表达谱，实时定量逆转录PCR检测trap基因和RNAⅢ的转录水平，CLUSTALX对表皮葡萄球菌trap基因与金黄色葡萄球菌序列进行分析．Mega软件构建进化树。结果比较分析形成生物膜的表皮葡萄球菌ATCC35984株与不形成生物膜的ATCC12228株生长中期的蛋白质组，发现ATCC35984株的TRAP蛋白量明显高于ATCC12228株。转录水平的检测显示ATCC12228株和生物膜阳性临床SE1457、SE671株的trap基因均低转录，但RNAⅢ的转录水平未降低。SE1457株agr系统突变后，RNAⅢ的转录明显降低，trap基因的转录无变化．RNAⅢ的转录随细菌生长变化而增加，trap基因转录保持不变．trap序列分析显示其在表皮葡萄球菌与金黄色葡萄球菌中较为保守，但存在明显的进化距离。结论在本论文所研究的表皮葡萄球菌菌株中，trap基因的转录和翻译与细菌生物膜的形成不存在直接的调控相关性；并提示TRAP蛋白不是表皮葡萄球菌agr系统活化所必需的细菌产物；表皮葡萄球菌trap基因序列与金黄色葡萄球菌之问存在差异，可能与其功能差异相关。     

trap基因表达在表皮葡萄球菌生物膜形成及附属基因调节(agr)系统活化中的作用

目的研究表皮葡萄球菌trap基因表达与生物膜形成的相关性及其对agr系统的活化作用。方法采用微量板半定量法检测表皮葡萄球菌生物膜表型，二维电泳和高灵敏度的基质辅助激光解吸附飞行时间质谱分析比较表皮葡萄球菌标准株蛋白质表达谱，实时定量逆转录PCR检测trap基因和RNAⅢ的转录水平，CLUSTALX对表皮葡萄球菌trap基因与金黄色葡萄球菌序列进行分析，Mega软件构建进化树。结果比较分析形成生物膜的表皮葡萄球菌ATCC 35984株与不形成生物膜的ATCC 12228株生长中期的蛋白质组，发现ATCC 35984株的TRAP蛋白量明显高于ATCC 12228株。转录水平的检测显示ATCC 12228株和生物膜阳性临床SE1457、SE671株的trap基因均低转录，但RNAⅢ的转录水平未降低。SE1457株agr系统突变后，RNAⅢ的转录明显降低，trap基因的转录无变化。RNAⅢ的转录随细菌生长变化而增加，trap基因转录保持不变。trap序列分析显示其在表皮葡萄球菌与金黄色葡萄球菌中较为保守，但存在明显的进化距离。结论在本论文所研究的表皮葡萄球菌菌株中，trap基因的转录和翻译与细菌生物膜的形成不存在直接的调控相关性；并提示TRAP蛋白不是表皮葡萄球菌agr系统活化所必需的细菌产物；表皮葡萄球菌trap基因序列与金黄色葡萄球菌之间存在差异，可能与其功能差异相关。     

mgrA基因与金葡菌耐药性关系简述

mgrA基因是新近发现的与金黄色葡萄球菌耐药有关的一个基因.它是一个全面调节金葡菌耐药性的基因,在各项有关研究中证明它通过调节细菌fmtB、norA、norB、tet38、sigB、sarX等基因影响细菌细胞壁合成、外排系统、生物膜合成、毒力、青霉素结合蛋白（PBP）等.     

铜绿假单胞菌Ⅰ类整合酶基因在生物被膜的表达

目的 研究携带Ⅰ类整合子的铜绿假单胞菌在浮游状态和生物被膜状态Ⅰ类整合酶基因(intI1) mRNA的表达水平,探讨生物被膜中整合子相关的基因转移的分子机制.方法 采用竞争RT-PCR方法定量检测intI1在两株临床分离的铜绿假单胞菌(PA10和PA39)生物被膜菌和浮游菌中mRNA的表达水平.首先用PCR方法从Ⅰ类整合子阳性铜绿假单胞菌全基因组DNA中扩增竞争体DNA (cDNA),再以cDNA为模板体外转录合成竞争体RNA (cRNA);再将不同稀释度的cRNA分别与铜绿假单胞菌的浮游菌和生物被膜菌的总RNA提取物进行竞争RT-PCR,产物经电泳分析,以已知cRNA的量确定待测样本中intI1 mRNA的表达量.结果 两株铜绿假单胞菌在其浮游状态和生物被膜状态都有intI1 mRNA表达;两菌的浮游菌和生物被膜菌intI1 mRNA表达量分别近似相等;但两菌生物被膜菌intI1 mRNA的表达量都较其浮游菌高(约15倍).结论 铜绿假单胞菌在生物被膜状态下Ⅰ类整合子intI1 mRNA的表达上调是耐药性广泛传递和多重耐药性形成的可能原因之一.     

盐酸小檗碱对表皮葡萄球菌生物被膜形成及相关基因表达的抑制作用

目的 通过检测盐酸小檗碱单用或联合抗菌药物对表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,Se.)形成生物被膜及所需基因的抑制作用.方法 体外构建表皮葡萄球菌生物被膜模型,盐酸小檗碱单用或联合万古霉素、环丙沙星、红霉素分别干预生物被膜的形成,采用CRA平板法检测药物对Se.生物被膜的抑制作用,荧光定量RT-PCR方法检测约物作用前后表皮葡萄球菌icaA基因和agr基因的表达变化.结粜盐酸小檗碱对icaA基因和agr基因的影响作用不及万古霉素、环丙沙星、红霉素;当不同浓度的盐酸小檗碱分别与万古霉素、环丙沙星、红霉素联用时,随着盐酸小檗碱的浓度增加,联合用药对icaA基因和agr基因的抑制作用逐渐减弱.结论 中药单体(盐酸小檗碱)对Se.形成生物被膜及所需关键基因的表达有一定的抑制作用,但抑制作用不及抗生索(万古霉素、环丙沙星、红霉素),并且不能与抗生索(万占霉素、环丙沙星、红霉素)联合用药,它们之间存在拮扰作用.     

临床分离表皮葡萄球菌的大环内酯耐药性与生物膜形成能力、icaA基因型的关系

目的 研究68株临床分离表皮葡萄球菌大环内酯耐药性与生物膜形成能力、icaA基因型之间的关系,初步预测采用大环内酯抗菌药物预防表皮葡萄球菌生物膜感染的有效性.方法 以琼脂平板稀释法测定菌株的最小抑菌浓度,采用微孔测定法考察临床分离表皮衙萄球菌生物膜形成能力,通过PCR法测定icaA基因型,探讨三者之间的关系.结果 临床分离表皮葡萄球菌对大环内酯耐药程度较高(88.2%),且耐药菌生物膜形成能力较敏感菌显著增强(P<0.05),耐药菌与敏感菌的icaA阳性比率没有统计学差异(P>0.05).结论 红霉素、阿奇霉素、克拉霉素等常用的大环内酯类药物可能难以有效地预防表皮葡萄球菌生物膜感染.     

Penetration of erythromycin through Staphylococcus epidermidis biofilm

Background The catheter related infection caused by Staphylococcus epidermidis biofilm is increasing and difficult to treat by antimicrobial chemotherapy. The properties of biofilms that give rise to antibiotic resistance are only partially understood. This study aimed to elucidate the penetration of erythromycin through Staphylococcus epidermidis biofilm.

Methods The penetration ratio of erythromycin through Staphylococcus epidermidis biofilms of 1457, 1457-msrA, and wild isolate S68 was detected by biofilm penetration model at different time points according to the standard regression curve. The RNA/DNA ratio and the cell density within the biofilms were observed by confocal laser microscope and transmission electromicroscope, respectively.

Results The penetration ratios of erythromycin through the biofilms of 1457, 1457-msrA, and S68 after cultivation for 36 hours were 0.93, 0.55 and 0.4, respectively. The erythromycin penetration ratio through 1457 biofilm (0.58 after 8 hours) was higher than that through the other two (0.499 and 0.31 after 24 hours). Lower growth rate of the cells in biofilm was shown, with reduction of RNA/DNA proportion observed by confocal laser microscope through acridine orange stain. Compared with the control group observed by transmission electrmicroscope, the cell density of biofilm air face was lower than that of agar face, with more cell debris.

Conclusions Erythromycin could penetrate to the Staphylococcus epidermidis biofilm, but could not kill the cells thoroughly. The lower growth rate of the cells within biofilm could help decreasing the erythromycin susceptibility.

     

临床分离表皮葡萄球菌生物膜形成与其耐药性的相关性分析

目的分析临床分离的表皮葡萄球菌对抗菌药物的耐药性与生物膜形成能力的关系。方法收集成都地区两家医院非重复临床分离表皮葡萄球菌45株,用半定量黏附实验检测其生物膜形成能力,采用K-B法以统一方案进行抗菌药物药敏试验,按CLSI2009版判断结果,用χ2检验分析表皮葡萄球菌耐药性与生物膜形成能力之间的关系。结果 45株表皮葡萄球菌中18株为生物膜形成株,其中12株来源于分泌物标本,6株来源于其他无菌体液。来源于分泌物和其他无菌体液的表皮葡萄球菌生物膜形成能力差异无统计学意义（P〉0.05）;45株表皮葡萄球菌除对万古霉素、利奈唑胺、喹奴普丁/达福普丁有较高的抗菌活性外,对青霉素、氨苄西林/克拉维酸、苯唑西林、头孢唑啉、复方新诺明、林可霉素、环丙沙星、红霉素、庆大霉素、亚胺培南的耐药率均〉50%,特别是苯唑西林耐药表皮葡萄球菌（MRS）高达88.9%.可形成生物膜和不可形成生物膜的菌株对抗菌药物耐药率差异无统计学意义（P〉0.05）。结论表皮葡萄球菌对抗菌药物的耐药性与其生物膜形成能力无相关性。     

金黄色葡萄球菌临床分离株生物膜形成能力及其相关基因的检测

目的： 检测临床分离金黄色葡萄球菌（金葡菌）的生物膜形成能力及其相关基因。方法： 用半定量微量平板法检测临床分离的92株金葡菌生物膜形成能力,并通过扫描电镜观察生物膜形态,用PCR法来检测生物膜形成的相关基因ica和sarA。结果： 92株临床分离金葡菌菌株均可形成生物膜,PCR结果显示100%的分离株均含有sarA基因,78株（84.78%）含有ica基因。结论： 临床分离的金葡菌都具有形成生物膜的能力,生物膜形成的相关基因ica和sarA的携带率较高。     

泛耐药铜绿假单胞菌群体行为与群体密度感应系统基因的相关性分析

目的:探讨泛耐药铜绿假单胞菌(PA)群体行为与群体感应系统(QS)基因的相关性.方法:检测PA群体行为包括弹性蛋白酶、绿脓菌素和生物被膜(BF)等和QS基因表达量,分别在泛耐药PA组和全敏感PA组观察PA群体行为与QS基因表达量的相关性.结果:收集泛耐药PA和全敏感PA各5例病例,各10株PA.泛耐药PA组弹性蛋白酶和绿脓菌素与LasI呈正相关关系(P<0.05),BF与RhlR呈正相关关系(P<0.05);全敏感PA组群体行为与QS基因无相关关系(P>0.05).泛耐药PA组与全敏感PA组第1天收集RhlI和第14天收集LasI、LasR表达量差异有统计学意义(P<0.05),弹性蛋白酶、BF和LasI、LasR治疗前后表达量变化差异有统计学意义(P<0.05).1株泛耐药PA发生氨基酸突变.结论:泛耐药PA群体行为与QS基因相关,且弹性蛋白酶、BF和LasI,LasR表达过高,提示QS基因在PA耐药机制中起重要作用.     

ica操纵子对表皮葡萄球菌在不同骨科植入物表面黏附和生物膜形成的影响

目的 探讨ica操纵子对表皮葡萄球菌在骨科植入物表面黏附和生物膜形成能力的影响,为临床骨科材料的使用提供理论依据.方法 采用PCR扩增表皮葡萄球菌ica操纵子的icaADBC基因,荧光定量PCR检测ica操纵子基因的表达,苯酚-硫酸法检测细胞间多糖黏附素(PIA)的合成,黏附能力检测采用菌落平板计数法,生物膜形成能力检测采用结晶紫染色法.结果 11株表皮葡萄球菌临床菌株扩增出ica操纵子的icaADBC基因,且在菌株中均有表达.ica操纵子基因表达高的菌株其PIA分泌量较高.表皮葡萄球菌在骨组织上的黏附和生物膜形成能力最强,其次为钛合金和不锈钢.icaA基因表达与细菌在3种生物材料上的生物膜形成相关.结论 表皮葡萄球菌在不同骨科植入物上具有不同的黏附和生物膜形成能力,ica操纵子基因通过调节PIA分泌量而影响表皮葡萄球菌生物膜的形成.     

四年中临床分离的表皮葡萄球菌耐药性分析

目的了解2000～2004年我院临床分离的表皮葡萄球菌分布特点及其对常用抗菌药物的耐药性,以指导临床合理用药。方法应用VITEK全自动微生物分析仪以及K-B法对我院2000～2004年临床标本分离的547株表皮葡萄球菌进行鉴定和药敏试验。结果主要来自血液、呼吸道及伤口分泌物中的547株表皮葡萄球菌对万古霉素、亚胺培南具有很高的敏感性;对头孢菌素类、氨基糖甙类以及红霉素、氯霉素、克林霉素的耐药率呈逐年上升趋势;对青霉素的耐药率非常高(>80%)。结论表皮葡萄球菌对临床常用的抗菌药物耐药性严重,对其引起的感染可选用万古霉素或亚胺培南。