乳链菌肽(nisin)抗性机制的研究进展

乳链菌肽(nisin)是某些乳酸乳球菌产生的一种羊毛硫细菌素。其对包括食品腐败菌和致病菌在内的许多革兰氏阳性菌具有强烈的抑制作用,是目前世界上唯一被允许用作食品添加剂的细菌素。nisin的广泛使用虽未引发大范围的抗性,但在自然界或实验室的选择压力下,某些非nisin产生菌也获得了抵御nisin攻击的抗性机制。nisin抗性机制通常涉及两种方式,即非特异性的生理适应机制和特异性蛋白酶介导的主动防御机制。本文综述了近年来nisin抗性机制的研究进展。     

钙蛋白酶抑制蛋白功能结构域Ⅳ在大肠杆菌中的表达、纯化及其抗血清的制备

为了研究钙蛋白酶系统在细胞发育及其它生理过程的功能 .应用 PCR从鼠钙蛋白酶抑制蛋白 ( calpastatin) c DNA中扩增了保守的具有功能的结构域 ( 40 4 bp) ,克隆于 p GEX- KG载体 .重组质粒 p GEX- Calp4在大肠杆菌中经 IPTG诱导可表达分子量约 4 5 k D融合蛋白 GST- Galp4 .诱导表达后的菌体超声裂解液经谷胱甘肽 - Sepharose4 B亲和层析柱得到纯化的 GST- Calp4融合蛋白 ,纯度达电泳纯 .纯化的 GST- Calp4免疫兔 8周后 ,抗血清的效价达 1∶ 64 .Western- blot分析表明制备的抗血清确实可以与肌细胞中分子量为 1 4 0 k D左右蛋白 (亦即完整 calpastatin)发生特异的免疫交叉反应 ,此表明实验获得了高特异性多克隆抗体     

重组C8orf32蛋白的表达、纯化及抗体制备

C8orf32是一种功能未知基因,其mRNA含量在乳腺癌组织中显著高于正常乳腺组织。将其开放式阅读框插入pGEX-6P1原核表达载体T7启动子控制下的GST编码基因下游,构建了C8orf32蛋白表达质粒pGEX-6P-C8。表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,成功表达了GST- C8orf32融合蛋白。经带有GST标签的位点特异性蛋白酶切割除去GST-C8orf32融合蛋白的GST标签,获得了N端带有8个多余氨基酸残基的C8orf32蛋白,蛋白纯度为95%左右。N端氨基酸序列分析表明该蛋白N端氨基酸序列正确,质谱鉴定进一步证明所表达C8orf32蛋白的正确性。用制备的C8orf32蛋白免疫新西兰白兔,获得了能够正确识别C8orf32蛋白的抗血清。该蛋白及其抗体的成功制备,为进一步研究C8orf32蛋白的结构功能和体内分布打下了基础。     

重组人MBD4蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析

为获得重组人MBD4蛋白,将编码MBD4的开放式阅读框（ORF）插入原核表达载体pGEX6P1 GST基因下游的多克隆位点（MCS）.将获得的表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3) 菌株扩大培养并用IPTG诱导融合蛋白的表达.用谷胱甘肽琼脂糖凝胶 4B亲和介质从菌体裂解液中纯化了GST-MBD4融合蛋白.经过Prescision protease专一性裂解成功去除了融合蛋白上的GST标签.通过Mono Q阴离子交换层析获得了纯度达94%以上的MBD4蛋白,该蛋白具有甲基化DNA结合和糖苷酶生物活性.     

重组人FS315C末端蛋白表达及其抗体制备

构建FS315C末端肽原核表达载体pGEX-FS315C,表达重组人卵泡抑素315(FS315)C末端肽,制备抗FS315C末端抗体。实验结果显示,重组pGEX-FS315C表达质粒在E.coli BL21中高表达GST-FS315C融合蛋白,采用亲和层析与电泳纯化GST-FS315C免疫家兔,获得抗FS315C末端抗体,Western blot检测显示该抗体只与FS315结合,而与FS288无交叉反应。ELISA检测显示抗FS315C末端抗体与FS315特异结合,而与FS288、inhibin及activin A等蛋白均无交叉反应。利用该抗体进行的免疫组化染色显示巨噬细胞FS表达阳性,与以往报道一致。实验采用重组GST-FS315C免疫家兔,成功地制备了抗FS315C末端特异抗体。     

绿色荧光蛋白的原核表达、纯化以及抗体制备

用PCR扩增出绿色荧光蛋白(GFP)基因,插入到pGEX-KG表达载体中,并将构建出的重组质粒命名为pKG- GFP。将重组载体导入大肠杆菌DH10β中,经IPTG诱导产生GST-GFP融合蛋白,同时以可溶蛋白和包涵体两种形式存在。 GST-GFP分子量大约为53kDa,与其理论值大小一致,用亲和层析以及凝血酶处理纯化GFP。纯化的产物经证实具有很好的 均一性。以GFP免疫新西兰家兔,制备多克隆抗体,Westernblotting测定抗血清效价。     

人MCM7 N-端融合蛋白的原核表达、纯化及其与AR蛋白相互作用的研究

目的：制备人MCM7 N-端的GST融合蛋白（GST-MCM7N）,研究其是否和雄激素受体（AR）蛋白存在直接的相互作用。方法：利用RT-PCR获得长度为744 bp的人mcm7 基因N-端cDNA碱基片段,把该片段构建到原核表达载体pGEX-5x-3中,转化大肠杆菌BL-21菌株。经IPTG诱导菌株基因表达产生了GST-MCM7N融合蛋白;使用Glutathione Sepharose 4B球珠分离纯化。利用GST pull-down 技术把纯化的融合蛋白分别和前列腺癌细胞LNCaP细胞裂解液及基因工程获得的AR蛋白孵育,检测MCM7蛋白的 N-端是否和AR蛋白直接相互作用。结果：酶切鉴定及基因测序表明,mcm7 基因cDNA的 N-端片段被构建到表达载体pGEX-5x-3中;SDS-PAGE及Western blotting结果分别显示,本研究获得了GST和GST-MCM7N融合蛋白;GST pull-down 结果证实GST-MCM7N和AR蛋白存在相互作用。结论：MCM7蛋白的N-端和AR蛋白至少在体外可以发生直接的相互作用。     

大肠杆菌表达GST-Aβ_(42)融合蛋白的纯化条件及鉴定

目的:为了提高β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptide,Aβ_(42))基因在大肠杆菌中的表达,为深入研究Aβ的作用机制及其疫苗研究奠定基础。方法:大肠杆菌在37℃培养4 h后,以终浓度为1 mmol/L的IPTG在25℃下继续诱导培养2 h,促进GST-Aβ42融合蛋白的可溶性表达。表达产物以SDS-PAGE、Western bloting鉴定。结果:SDS-PAGE表明融合蛋白分子量约为32kD,与预计的一致;Western Blotting进一步分析表明它能与抗Aβ42和抗GST抗体特异反应。结论:GST-Aβ_(42)基因的优化表达为研究Aβ42的作用机理打下了基础,同时也为Aβ42疫苗的研究提供了充分的实验条件。     

重组阳离子抗肿瘤肽AIK的原核表达、纯化及活性测定

利用Gateway克隆技术构建重组抗瘤肽AIK的原核表达体系,建立表达及纯化重组AIK的最优条件,为深入研究和利用AIK奠定基础。首先,设计含AttB重组位点的引物,通过重叠PCR技术扩增出Att B-TEV-FLAG-AIK序列,利用BP重组反应将目的序列TEV-FLAG-AIK克隆到供体载体pDONR223中,构建入门载体,再通过LR重组反应,将目的序列转移到目的载体pDEST15中,构建GST-AIK融合蛋白原核表达质粒。随后,在BL21(DE3)工程菌中优化诱导融合蛋白表达的条件。以谷胱甘肽磁珠纯化GST-AIK融合蛋白,再以rTEV酶切除GST,获得FLAG-AIK重组蛋白。最后以MTS法检测FLAG-AIK对白血病细胞HL-60的细胞毒性。菌液PCR验证和测序分析表明成功构建了重组抗瘤肽AIK的入门质粒和原核表达质粒。在BL21(DE3)工程菌中实现了GST-AIK融合蛋白的高效可溶性表达。并测得在37℃下以0.1 mmol/L IPTG诱导工程菌(OD600=1.0)4 h,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的30%以上。经GST亲和层析、rTEV酶切除GST标签及二次GST亲和层析获得纯度高于95%的FLAG-AIK蛋白。MTS法测得所制备的FLAG-AIK蛋白抑瘤活性与化学合成的AIK相当。总之,本课题应用Gateway克隆系统成功构建了抗瘤肽AIK的原核表达质粒,实现了GST-AIK融合蛋白的高效可溶性表达,经亲和层析获得了有生物活性的重组AIK多肽,为后续深入研究和大规模制备奠定了基础。     

GST融合蛋白在杆状病毒系统中表达的可溶性研究

将构建好的可表达ＧＳＴ融合蛋白的重组病毒ＡｃＭＮＰＶ－ＯＣＣ＾－－ＧＳＴ－６ｘＨｉｓ－Ｅｔｐ２８感染Ｓｆ９细胞,一定时间后取感染了病毒的细胞裂解物上清液进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,结果显示５３ｋＤａ的融合蛋白（ＧＳＴ－６ｘＨｉｓ－Ｅｔｐ２８）呈不溶状态。在原有裂解液的基础上,加固体十二烷基肌氨酸钠致终浓度１．５％,并将Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００的比例由１％提高到２％。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示至少有１／     

大肠杆菌表达的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的纯化

对重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）高效表达克隆ｐＺＷ．ＧＭ的表达产物进行了纯化,并对纯化的ＧＭ－ＣＳＦ进行了Ｎ端氨基酸序列分析。人ＧＭ－ＣＳＦ基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在,经过超声破菌、包涵体抽提、凝胶过滤层析、复性、离子交换一系列化步骤,终产物纯度达９９％,按蛋白总量计算回收率达１０％,比活性达１×１０＾７ｕ／ｍｇ蛋白质。通过测定纯化人ＧＭ－ＣＳＦ的Ｎ端１     

胆汁三烯结合蛋白在大肠杆菌中的表达、复性与纯化

目的：合成胆汁三烯结合蛋白（BBP）基因并在大肠杆菌中表达,获得重组BBP纯化制品。方法：根据天然BBP的基因序列和大肠杆菌偏好密码子设计并合成BBP基因的引物,PCR扩增优化的BBP基因序列,克隆至载体pEasy-T3;测序正确后,将该序列克隆至表达载体pET-32a上,构建表达质粒,转化至大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,在IPTG诱导下表达融合蛋白;采用Ni柱纯化融合蛋白。结果：PCR扩增获得了优化后的BBP基因序列,构建了表达载体pET-32a-BBP;SDS-PAGE分析表明表达的融合蛋白相对分子质量为20×10^3,以包涵体形式存在,占全菌蛋白的40%以上;变性、复性后经Ni2＋柱纯化,获得纯度达98%以上的重组蛋白。结论：优化并合成了BBP全基因序列,获得了高纯度重组融合蛋白,为进一步鉴定其生物活性及筛选小分子的研究奠定了基础。     

富含二硫键的膜蛋白p185胞外区在大肠杆菌中的可溶性表达和性质鉴定

Her2/c-erbB-2基因（其产物为膜蛋白p185）是表皮生长因子受体（EGFR）基因家族的一员,在约30％的乳腺癌中发现了其过量表达。为了鉴定抗p185单克隆抗体的抗原表位并进一步研究它们的相互作用,采用PCR的方法从含Her2/c_erbB_2基因的pBabe/erbB_2质粒中扩增了p185胞外区的富含二硫键的第一、二结构域和第四个结构域。产物克隆到pGEX/4T-1载体后,转化大肠杆菌Origami B（DE3）pLysS菌株,用低浓度IPTG进行低温过夜诱导后将菌体压力破碎,SDS-PAGE检测表达上清,得到了可溶性表达的融合有GST的目的蛋白。经ELISA、Western blot等方法鉴定,可溶性表达产物具有完全的抗体结合活性,且当用凝血酶把GST切掉后该活性仍然保留。P185胞外区融合蛋白的成功表达将为二硫键富含类蛋白的表达提供参考;并为将来具有肿瘤细胞生长抑制活性的抗p185单克隆抗体的抗原表位鉴定,以及为EGFR家族受体的结构和功能关系的研究打下基础。     

重组胸腺素α1的纯化及活性

将胸腺素α1基因4串体克隆于pThioHisA融合表达载体(pThioHisA-Tα1④),转化大肠杆菌TOP10。在IPTG诱导下,融合蛋白得到了高效表达。SDS-PAGE分析确定诱导表达的融合蛋白占菌体总蛋白的40%,且表达的融合蛋白主要以可溶形式存在。把用离子交换层析纯化出的目的蛋白进行CNBr化学裂解,经简单的离子交换层析可纯化出胸腺素α1单体,HPLC鉴定胸腺素α1的纯度达98%。利用3H-TdR进行生物活性测定,证实融合蛋白和胸腺素α1单体均具有在致有丝分裂原ConA存在的条件下,刺激小鼠脾淋巴细胞分裂增殖的能力,与化学合成的胸腺素α1相比具有相似的生物活性。     

猪囊尾蚴CE18重组蛋白的复性纯化及抗原性鉴定

猪囊尾蚴CE18重组蛋白(rCE18)在大肠杆菌表达后形成包涵体, 为了获得高纯度的、有生物活性的rCE18, 本研究采用超声破碎菌体, 0.2%、2% DOC(脱氧胆酸钠)逐次洗涤包涵体及0.9% SKL(十二烷基肌氨酸钠)溶解包涵体后, 利用透析与凝胶过滤层析技术相结合对rCE18进行复性和纯化。同时, 采用GST-FF亲和柱层析及SDS-PAGE胶回收蛋白两种方法纯化rCE18, 比较三者的纯化效果。并通过间接ELISA检测复性蛋白的生物学活性。结果表明: 经透析与凝胶层析复性纯化后的rCE18蛋白的纯度可达到60%以上, 活性回收率为41.3%, 间接ELISA证实, 复性后的rCE18蛋白能特异性识别猪囊虫阳性血清, 检测敏感性高达97.2%, 与全囊虫抗原检测的符合率为100%。本试验初步建立了猪囊尾蚴rCE18包涵体纯化及复性的有效方法, 为猪囊尾蚴rCE18蛋白的诊断应用奠定了基础。     

重组蛋白GST-OsCATB的表达特性研究

为了阐明水稻Catalase（CAT）的酶学功能,首先需要获得出足量的、活性的该酶蛋白。本研究克隆了水稻OsCAT_B基因(GenBank accession No.D26484),构建到原核表达载体pGEX-6p-3中形成重组蛋白,继而转入E.coli菌株BL21中进行表达特性研究。结果表明,GST-OsCAT_B融合蛋白在E.coli中进行了过量表达,表达受到诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度和诱导体系等多因素影响;通过谷胱甘肽Sepharose-4B亲合层析,纯化出足量、活性的融合蛋白GST-OsCAT_B,每克表达细胞（干重）中得率为51 mg GST-OsCAT_B。     

人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体-尿激酶融合蛋白在大肠杆菌中的功能性表达

尿激酶是目前临床上广泛使用的一种有效的溶栓制剂 ,但由于尿激酶缺乏对血栓的特异亲和性 ,导致临床上尿激酶的使用剂量较大 ,容易出现全身性出血等副作用。因而开发对血栓特异的导向溶栓制剂是目前溶栓药研制的一个重要方向。本实验室在以前的工作中 ,利用噬菌体表面呈现技术 ,筛选到一种对人纤维蛋白特异的鼠单链抗体[1 ] ,在对该鼠抗体可变区进行结构模建的基础上[2 ] ,对其进行了人源化改造和体外亲和力成熟 ,得到亲和力和特异性较鼠抗体更好的人源化单链抗体[3 ] 。为研制导向溶栓制剂 ,本实验室构建了人源化单链抗体 低分子量尿激酶的…     

TAT-aFGF融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其生物活性测定

构建表达Tat与人酸性成纤维细胞生长因子（acidic fibroblast growth factor, aFGF）融合蛋白的重组质粒pET3c–Tat-aFGF14-154和pET3c-Tat-aFGF27-154,并转化大肠杆菌BL21（DE3）中。37℃,l mmol/L的IPTG诱导4 hrs后,获得分子量约为18 kDa的融合蛋白,表达量分别占菌体总蛋白的42%和24%。利用阳离子交换（CM-Sepharose FF）、肝素亲和层析（Heparin-Sepharose CL-6B）以及分子筛（Sephadex G-25）联用的方法可获得纯度大于95%的目的蛋白,得率分别为93和78 mg/L。Tat-aFGF14-154及其对照蛋白aFGF14-154对Balb/c 3T3细胞有明显促细胞增殖的作用,最佳作用浓度分别为1280 ng/ml和160 ng/ml。而Tat-aFGF27-154 及其对照蛋白aFGF27-154则几乎没有促细胞增殖活性。免疫荧光分析结果表明,Tat-aFGF14-154及Tat-aFGF27-154均能穿过PC12、Balbc/3T3、HaCaT和海马神经元细胞的细胞膜,并主要定位于细胞浆中。此外,四种重组蛋白均能降低Aβ25-35对大鼠海马神经元细胞的毒性,在剂量为1000 ng/ml时,Tat-aFGF14-154、Tat-aFGF27-154、aFGF14-154及aFGF27-154细胞存活率分别为90.66%、81.87%、85.71%和78.02%,而Aβ25-35模型组的存活率仅为56.87%。