HIV-1 CHLJBF06044包膜特性分析

目的 分析黑龙江省Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)原代分离株CHLJBF06044包膜糖蛋白的变异性及表型特征.方法 从一名HIV阳性感染者外周血单个核细胞提取DNA,采用保守引物进行HIV病毒包膜直接克隆,进行序列分析及系统树分析.构建一株带该包膜蛋白的伪病毒并利用表达CXCR4和CCR5的靶细胞进行感染实验,观察该病毒包膜利用辅助受体的表型特征.结果 共获得2个有功能全Env克隆,分别命名为CHLJBF06044c7和CHLJBF06044c8.获得2个有完整包膜基因的克隆,用全Env氨基酸序列与国内分离株进行系统发育分析结果 表明,该株为B'亚型.对包膜蛋白结构分析结果 显示,分离株CHLJBF06044c7和CHLJBF06044c8包膜在抗原性和亲水性上没有明显差别.感染性检测结果 显示该病毒只能感染U87.CD4.CCR5细胞,不能感染U87.CD4.CXCR4细胞.结论 黑龙江省一名HIV-1阳性者克隆到HIV-1 CHLJBF06044病毒的包膜基因,该病毒属于B'亚型(泰国亚型),为CCR5亲嗜性毒株.     

AT-2灭活HIV-1病毒及纯化回收鉴定

目的 制备具备完整空间构型且纯度在90%以上的灭活HIV-1病毒,用于HIV疫苗研究.方法 应用化学制剂2,2'-dlthiodipyridine(aldrithiol-2;AT-2)灭活HIV-1病毒,对灭活的病毒超速离心浓缩并洗涤去除灭活用的化学制剂AT-2.采用分子筛技术去除灭活病毒中残存的杂质蛋白质.结果 250μmoL/L AT-2与HIV-137℃作用1 h可以彻底灭活病毒的感染性,同时保留病毒的免疫原性.灭活的病毒纯化后检测不到AT-2的残留,检测牛血清蛋白残余量低于50 ng/mL.结论 灭活的HIV-1病毒经过纯化后纯度达到95.6%,可以满足作为HIV疫苗研究的免疫刺激剂的使用要求.     

光敏式病毒灭活仪杀灭RNA包膜病毒的实验研究

目的 研制出可在体外杀灭RNA包膜病毒的新型仪器。方法 与亚甲蓝最大吸收波长相匹配的单波长发光二极管组成的单个或点阵式发光体为光源系统，以日本脑炎病毒和登革热病毒为RNA包膜病毒灭活效果评估的指示病毒，采用空斑法测定病毒滴度，获得不同浓度亚甲蓝工作液以及光源不同光照度、光照时间和距离等参数条件下灭活病毒的动力学参数。结果 光敏式病毒灭活仪主要由亚甲蓝喷雾器、二极管电路和发光二极管点阵组成；光照时间≥5min，光照度光照距离≤2．5m的条件下，1．0μg／ml和2．0μg／ml的MB工作液灭活病毒的效力均为100％。结论 光敏式病毒灭活仪可有效地灭活RNA包膜病毒，同时，与MB最大吸收波长相匹配的光源系统提高了亚甲蓝／光化学法灭活病毒的效率。     

深圳地区120株HIV-1膜区和结构蛋白区基因变异分析

目的研究深圳地区HIV-1病毒株在膜区和结构蛋白区基因变异情况,比较不同亚型毒株之间基因离散率的差异。方法收集HIV-1感染者新鲜血浆,提取血浆中HIV-1病毒株RNA,RT-PCR套式扩增env区和gag区基因,基因测序后进行序列比对和分析,构建基因进化树,计算基因离散率。结果各亚型毒株在env区相互之间基因离散率最大的是B亚型和07-BC亚型,最小的是07-BC亚型和08-BC亚型;各亚型毒株在gag区相互之间基因离散率最大的是01_AE亚型和07-BC亚型,最小的是07-BC亚型和C亚型。结论 07-BC、08-BC及C亚型在两个基因片段上基因距离均最近,说明这三个亚型可能有共同的起源。     

HIV-1 GP41第二优势表位簇在大肠杆菌中的高效表达

①目的 构建HIV-1 SF2株跨膜蛋白GP41第二优势表位簇基因的原核高效表达克隆，探讨提高原核表达的途径。②方法 根据密码子的兼并性，利用PCR-定点突变技术扩增，改造目的基因片，将其与原核表达载体PGEX4T-2经EcoR I和SalI双酶切，连接，重组质粒，PGEX4T-2/SE转化表达宿主菌DH5α，经IPTG诱导表达出目的的融合蛋白，经SDS-PAGE与Western-Blot鉴定。③结果 获得了高效表达HIV-1 GP41第二优势表位谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白的重组菌，Western-Blot鉴定表明，重组蛋白蛋白具有良好的抗原性和特异性。④结论 在原核表达体系中可以高效表达HIV-1 GP41第二优势表位簇。     

HIV-1包膜单基因Nest-PCR体系优化及包膜基因准种扩增

目的确定HIV-1包膜(envelope,env)单基因扩增(single genome amplification,SGA)的最优反应体系,获得env单基因扩增产物。方法采用SGA及Nest-PCR扩增HIV-1 env全长基因,并对Nest-PCR反应体系中各成分量进行优化;在此基础上,适当稀释HIV-1感染者cDNA模板进行Nest-PCR,以获得PCR扩增产物阳性率不超过30%的模板稀释度。结果 SGA Nest-PCR扩增HIV-1 env全长基因,引物浓度为0.3μmol/L,dNTP浓度为0.25μmol/L时可获得特异性高的env全长基因;凝胶回收纯化及稀释第一轮PCR产物可有效提高特异性条带的产量。采用优化反应体系成功从一名HIV-1感染者体内扩增出18株env单基因序列。结论优化了HIV-1 env基因SGA Nest-PCR的反应体系,并从HIV-1感染者获得了病毒包膜基因准种,为后续进行准种分析奠定了基础。     

甲醛灭活工艺对By型流感病毒的灭活效果及其抗原稳定性的影响

目的 评价终浓度为100μg/ml甲醛、2～8℃、10 d灭活工艺对2022年四价流感病毒裂解疫苗生产用By(B/Phuket/3073/2013/BVR-1B)病毒毒株灭活的适用性。方法 病毒收获液（鸡胚病毒培养产物）经过澄清过滤,控制蛋白浓度<800μg/ml,温度2～8℃,添加甲醛溶液至终浓度100μg/ml,对病毒收获液进行灭活。在灭活第0、1、2、3、4、5、10天取样,采用鸡胚半数感染剂量（median infective dose,EID50）法检测病毒滴度,采用Reed-Muench法计算lgEID50/ml;采用直接血凝法检测流感病毒血凝滴度;对灭活10 d的样品进行病毒灭活验证试验;灭活10 d后的病毒液经超滤、离心、层析等工艺提纯,取样进行透射电镜观察病毒颗粒完整性。结果 病毒收获液灭活第0、1、2、3、4、5、10天的病毒滴度分别为（8.5±0.4）、（4.2±0.5）、（1.3±0.4）、0、0、0、0 lgEID50/ml,血凝滴度结果均在1∶256～1∶512;病毒灭活验证试验显示,经过10 d的灭活,病毒均已全部灭活;透射电镜观察显示,所得的病毒均...     

病毒灭活血浆的临床应用

为了加强输血安全,减少因输血而传染上经血液传染的疾病,本文对输血存在的风险、病毒灭活血浆的意义、病毒灭活血浆的原理的方法以及病毒灭活血浆的临床应用进行阐述,进一步说明了输血存在的隐患和风险,合理使用病毒灭活血浆,可以降低因输血而传染疾病的意义,指导临床安全用血.     

弓形虫GRA1基因变异及真核表达载体的构建

目的：构建弓形虫致密颗粒抗原1（ GRA1）基因真核表达质粒。方法：根据GRA1基因已知序列,设计一对引物。用PCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA1基因片段,插入pcDNA3质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经酶切及PCR鉴定、测序。结果：从弓形虫RH株基因组中扩增出775 bp的GRA1基因,测序显示该基因存在一135 bp的插入序列,使得所得PCR产物分子量大于预期值（628 bp）。该插入序列造成GRA1基因移码突变。结论：首次报道了变异的弓形虫RH株GRA1基因并构建了该变异基因的重组表达质粒。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白4A反式激活基因NS4ATP1的克隆化研究

目的：筛选并克隆丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白4A（NS4A）反式激活新型靶基因。方法：以HCVNS4A蛋白表达质粒pcDNA3．1（-）-NS4A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。分析筛选得到的克隆，其中之一与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性，通过序列同源性比对和电子拼接，根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列，确定新型基因序列。从转染peDNA3．1（-）-NS4A的HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）技术扩增获得该新基因的全长序列，并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果：该新基因的编码序列全长为963个核苷酸（nt），编码产物由321个氨基酸残基（aa）组成，并测序证实，命名为NS4ATP1，在GenBank中注册，注册号为AY740521。结论：分子生物学技术与生物信息学技术相结合，发现并鉴定、克隆了HCV非结构蛋白反式激活作用的新型靶基因NS4ATP1，为进一步研究HCV非结构蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

HIV相关神经认知紊乱患者配对组织来源的HIV-1 env基因特征分析

目的：探讨人类免疫缺陷病毒相关神经认知紊乱（HIV associated neurocognitive disorder, HAND）患者不同组织中HIV-1 env基因的变异进化特征。方法通过国际HIV痴呆量表筛选出HAND患者,获得其血浆及脑脊液来源的HIV-1 env基因核苷酸序列,回顾性分析遗传多样性、氨基酸长度、潜在糖基化位点（PNGS）、辅助受体利用以及特征性氨基酸的特点及组织间差异。结果本研究纳入4例HAND患者共57条HIV-1 env基因V3-C4序列（血浆来源29条,脑脊液来源28条）。脑脊液中的HIV-1遗传多样性高于血浆来源毒株,差异有统计学意义（遗传多样性变异度中位数分别为0.053和0.007,P=0.043）。3例患者脑脊液与血浆来源的毒株均使用CCR5辅助受体,其中2例患者脑脊液（患者D 158 bp,患者F 158 bp）中的HIV-1 V3-C4区氨基酸长度中位数明显长于血浆来源（患者D 156 bp,P=0.017;患者F 157 bp,P=0.003）。脑脊液与血浆中HIV-1 env基因序列相比共有16个氨基酸位点存在明显差异,62.5%（10/16）分布在V4区。结论 HAND患者脑脊液和血浆中的HIV-1 env基因特征存在差异,脑脊液中的HIV-1准种遗传多样性更高。     

HBsAg阳性孕妇血清中乙肝病毒前S/S基因的相似株现象

目的：探讨HBsAg阳性孕妇体内HBV病毒前S/S基因变异的状况。方法：应用全长PCR技术从4例表面抗原阳性孕妇血清中扩增出HBV全长基因,将其克隆于pUC19载体,每例随机筛选5个阳性克隆,对其前S/S区进行序列分析。结果：4例患各克隆间均存在碱基的差异,此类患体内HBV株同源性较差。结论：HBsAg阳性孕妇体内HBV株呈“相似株”分布。     

无偿献血人群中HIV-1感染者env基因序列特征研究

目的 分析我国无偿献血人群艾滋病病毒I型（HIV-1）感染者病毒亚型及env基因C2-V4区序列特征。方法 针对我国13个省市献血人群筛选的115例HIV-1阳性标本,扩增HIV-1的env基因C2-V4区片段并测序;构建最大似然树（Maximum Likelihood）分析不同亚型env基因序列的进化关系;分析该基因区序列变异以及2G12、PGT135、PGT128中和表位特征。结果 从115例HIV阳性标本中成功扩增C2-V4区76份,经测序分析发现HIV-1基因亚型7种,其中,亚型CRF01_AE和CRF07_BC所占比例最高,分别占46.0%（35/76）和39.5%（30/76）,其他亚型CRF08_BC、B、CRF65_CPX、CRF59_01B、CRF61_BC所占比例分别为5.3%（4/76）、5.3%（4/76）、1.3% （1/76）、1.3% （1/76）、1.3% （1/76）。V3环顶端四肽存在GPGQ、GPGR、GPGK、GQGR四种类型,辅助受体以CCR5（90.8%）为主。97.1%的CRF01_AE毒株分别缺失2G12和PGT135抗体识别的相关糖基化位点,而CRF07_BC毒株100%缺失2G12抗体识别相关的糖基化位点,80%毒株未缺失PGT135抗体识别相关的糖基化位点。结论 我国献血人群HIV-1感染者以CRF01_AE和CRF07_BC为主要流行毒株;各毒株亚型V3顶端四肽以GPGQ变异型为主,且主要使用CCR5为辅助受体;2G12、PGT135及PGT128中和抗体表位呈现不同程度的变异。该研究为进一步开展针对献血人群的艾滋病预防与控制提供了参考数据。     

吡咯并吡啶类整合酶抑制剂的设计、合成和生物活性研究

目的：设计并合成新型的吡咯并吡啶类整合酶抑制剂。方法利用生物电子等排和分子对接方法,以已上市药物雷特格韦作为前体设计了一系列吡咯并吡啶类整合酶抑制剂（6a~6t）,通过全合成方法得到目标产物,并测定这些化合物对整合酶3′加工抑制活性。结果成功合成了所设计的吡咯并吡啶类化合物,产物结构经过1H NMR、13C NMR和高分辨质谱确证。部分化合物都显示出一定的整合酶3′加工抑制活性,同时对特定化合物进行了分子对接及结合能量的分析。结论通过分子对接的方法对目标产物进行了构效关系的分析,阐明了该类化合物的作用机制,并为该类化合物的继续优化奠定了基础。     

中国HIV-1感染者病毒特异性细胞毒性T细胞定量研究

目的对8例HIV长期感染不进展(LTNP)及病程进展缓慢(SP)患者的病毒特异性细胞毒性T细胞(CTL)特征进行研究。方法设立队列研究,从中随机选出8例患者(4例LTNPs,4例SP)。通过采用重叠肽技术组建HIV-1B亚型全序列肽段,组建成三维肽库进行ELISPOT分析8例患者的HIV-1特异性细胞免疫反应。结果在大多数患者中存在较强的T细胞反应,特别对HIV-1病毒的pol、gag、nef蛋白的免疫反应比其他蛋白强。结论病毒特异性CTL免疫反应在HIV-1 LTNPs有较强并且很广泛的反应,这对于有效抑制病毒在人体内的生存有可能起到很大的作用,很可能是这些LTNPs及SP病程进展缓慢的主要原因之一。     

V3环缺失的HIV-1 ADA株包膜表达载体构建及鉴定

目的构建V3环缺失的HIV-1 ADA株包膜糖蛋白表达体系。方法分别设计包膜糖蛋白两端及V3环两端的两对引物，采用重叠延伸剪接法，进行HIV-1 ADA株包膜糖蛋白V3环缺失体的构建。得到的PCR产物经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，与pSM载体连接，构建HIV-1 ADA株包膜糖蛋白V3环缺失的表达载体(pSM—ADA△V3)，转化大肠杆菌后筛选阳性克隆，经PCR及基因序列测定进行鉴定。结果获得HIV-1 ADA株包膜糖蛋白V3环缺失体PCR产物，构建了其表达载体pSM—ADA△V3，经转化和筛选获得了重组菌，经PCR及基因测序结果显示重组质粒序列正确，为预期目的片段。结论成功构建了V3环缺失的HIV-1 ADA株包膜糖蛋白的表达载体。此结果为进一步构建伪病毒，观察V3环完全或部分缺失对病毒侵入靶细胞过程的影响，为开发阻止HIV-1进入靶细胞的药物或疫苗打下基础。     

宫内感染乙型肝炎病毒的新生儿及其母亲HBV基因结构分析

目的：探讨HBV基因变惜民宫内感染的关系。方法：扩增2对发生宫内感染的新生儿及母亲血清中2．5kb HBV DNA，克隆、测序并分析其基因结构。同时用免疫染色法检测孕妇胎盘组织HBsAg。结果：母婴HBV DNA序列中，前S1、前S2和S区都发生突变并且导致相应编码蛋白的氨基酸组成发生改变，其中以前S2区突变率为最高（P＜0．01）；而前C、C区基因只有少数核苷酸发生沉默突变、孕妇胎盘组织各层细胞中均有HBsAg阳性信号。结论：新生儿HBV的细胞源性宫内感染可能主要与HBV突变 有前S／S区的基因变异有关，而前C／C区相对比较保守，未见明显相关。     

新型HIV-1表型耐药系统临床检测应用研究

目的应用新型HIV-1表型耐药系统对经过HAART治疗的40例临床患者样本进行表型耐药检测,通过比较表型和基因型耐药的结果,实现这一新型HIV-1表型耐药体系在临床检测中的应用。方法通过分子克隆方法、Gateway重组技术、体外细胞功能试验,得到表型耐药结果。结果成功构建含有患者基因的用于假病毒表型耐药的假病毒株40株,在总数达54个表型耐药性检测中,与基因型耐药性检测一致性达75.9%（41/54）。其中蛋白酶抑制剂（克力芝）试验组、核苷类逆转录酶抑制剂（3TC）试验组和非核苷类逆转录酶抑制剂（EFV）试验组的表型耐药性检测,与基因型耐药性检测一致性高达100.0%;而核苷类逆转录酶抑制剂（AZT）试验组共6个表型耐药性检测,与基因型耐药性检测一致性为66.7%（4/6）;2组多药试验共24个表型耐药性检测,与基因型耐药性检测一致性为54.2%（13/24）。其中显示出一个较为明显的特征,AZT药物敏感性试验的表型检测结果大多低于其基因型耐药检测的耐药水平（68.75%,11/16）。结论本研究建立了一个新型表型耐药系统对HIV耐药性进行检测,通过40例临床样本的检测,充分证明新型HIV-1表型耐药检测体系可以准确地反应样本耐药水平并对其进行定量。这一方法弥补了以往假病毒表型耐药检测方法中载体不能重组所有药物靶点的缺陷,证明该新型HIV-1表型耐药体系具有广阔的临床检测应用前景。