人p27kip1cDNA克隆及其转染人舌癌细胞系Tca8113细胞的鉴定

目的克隆人p27kip1cDNA并将其转染至Tca8113细胞中,建立稳定转染p27kip1基因的细胞株.方法用RT-PCR法获得人p27kip1cDNA,将其克隆入pcDNA3载体上,并将重组表达质粒经脂质体介导转染Tca8113细胞,经G418抗性筛选后用PCR鉴定.结果克隆出人的p27kip1cDNA并将其转染至Tca8113细胞中,获得了稳定转染p27kip1基因的细胞株.结论用分子生物学技术克隆了人p27kip1基因,获得稳定转染p27kip1基因的细胞株,为进一步研究p27kip1基因治疗舌癌的实验研究奠定基础.     

人p27~(kipl)cDNA克隆及其转染人舌癌细胞系Tca8113细胞的鉴定

目的克隆人p27kiplcDNA并将其转染至Tca8113细胞中,建立稳定转染p27kipl基因的细胞株。方法用PT-PCR法获得人p27kiplcDNA,将其克隆人pcDNA3载体上,并将重组表达质粒经脂质体介导转染Tca8113细胞,经CA18抗性筛选后用PCR鉴定。结果克隆出人的p27kiplcDNA并将其转染至Tca8113细胞中,获得了稳定转染p27kipl基因的细胞株。结论用分子生物学技术克隆了人p27kipl。基因,获得稳定转染p27kipl基因的细胞株,为进一步研究p27kip基因治疗舌癌的实验研究奠定基础。     

p27kip1在中老年舌鳞状细胞癌中的表达及临床意义

目的 探讨中老年舌鳞状细胞癌组织中P27^kip1的表达情况，揭示p27^kip1表达与舌鳞状细胞癌的临床特征之间的关系及作用。方法 应用免疫组织化学S-P法对40例舌癌组织、癌旁组织及20例正常口腔黏膜组织进行p27^kip1检测。结果 （1）p27^kip1蛋白表达在舌癌、癌旁组织及正常口腔黏膜之间有显著性差异。（2）p27^kip1蛋白低表达与颈淋巴结转移、患者预后有相关性（P〈0．05），而与病人性别、年龄、吸烟史，病理分化无相关性（P〉0．05）。结论 ^kip1是判断舌癌预后的有效指标且具有相关性。     

p27kip1基因转染联合化疗对胃癌细胞生长的影响

背景：p27kipl是一种抑癌基因，早期研究显示p27kipl基因转染能明显抑制胃癌、食管癌细胞生长．表明该基因疗法可能是治疗胃癌、食管癌的新途径，深入阐明p27kipl的抑癌机制，可为p27kipl基因治疗胃癌、食管癌提供可靠的理论基础。目的：研究p27kipl基因转染联合化疗对胃癌细胞生长的影响。方法：将p27kipl重组腺病毒（Ad-p27kipl）转染胃癌细胞SGC-7901，免疫细胞化学法检测p27kipl的表达。加入5-氟尿嘧啶（5-FU）和顺铂（DDP）后．甲基噻唑基四唑（MrIT）法测定细胞生长抑制率,^3H-胸腺嘧啶核苷（^3H-TdR）掺入试验测定DNA的合成。结果：Ad-p27kipl转染胃癌细胞后，p27kipl表达明显增强。加入5-FU和DDP后，细胞生长抑制率显著增高．^3H-TdR掺人量显著降低（P〈0．01）。结论：p27kipl基因转染联合化疗能明显抑制胃癌细胞的生长。     

p27kip1基因转染联合化疗对胃癌细胞生长的影响

背景:p27kip1是一种抑癌基因,早期研究显示p27kip1基因转染能明显抑制胃癌、食管癌细胞生长,表明该基因疗法可能是治疗胃癌、食管癌的新途径,深入阐明p27kip1的抑癌机制,可为p27kip1基因治疗胃癌、食管癌提供可靠的理论基础.目的:研究p27kip1基因转染联合化疗对胃癌细胞生长的影响.方法:将p27kip1重组腺病毒(Adp27kip1)转染胃癌细胞SGC-7901,免疫细胞化学法检测p27kip1的表达.加入5-氟尿嘧啶(5-FU)和顺铂(DDP)后,甲基噻唑基四唑(MTT)法测定细胞生长抑制率,3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入试验测定DNA的合成.结果:Adp27kip1转染胃癌细胞后,p27kip1表达明显增强.加入5-FU和DDP后,细胞生长抑制率显著增高,3H-TdR掺入量显著降低(P＜0.01).结论:p27kip1基因转染联合化疗能明显抑制胃癌细胞的生长.     

Transfection of p27^kip1 enhances radiosensitivity induced by ^60Co γ-irradiation in hepatocellular carcinoma HepG2 cell line

AIM: To study the cell cycle alterations of human hepatoma cell line HepG2 in vitro after ^60Co γ-irradiation and further to examine the mechanisms underlying the enhancement of radiosensitivity to γ-irradiation in HepG2 transiently transfected with wild type p27^kip1. METHODS: The proliferation of HepG2 cells was evaluated with MTT assay, and the cell cycle profile and apoptosis were assessed by cell morphology, DNA fragmentation analysis and flow cytometry. HepG2 cells were transfectedwith p27^kip1 wild type by using Lipofectamine (LF2000), and the expression and subcellular localization of p27^kip1 in HepG2 were detected by immunocytochemistry.RESULTS: ^60Co γ-irradiation inhibited the growth of HepG2 cells in a dose-dependent manner. Apoptosis of HepG2 cells was induced 48 h after ~, ray exposure. Furthermore research was carried out to induce exogenous expression of p27^kip1 in HepG2. The expression of p27^kip1 induced G0/G1 phase arrest in HepG2 cells. The overexpression of p27^kip1 enhanced ^60Co γ-irradiation-induced radiosensitivity in HepG2 cells. CONCLUSION: Overexpression of p27^kip1 is a rational approach to improve conventional radiotherapy outcomes, which may be a possible strategy for human hepatoma therapy.     

转染p53基因对培养的人动脉平滑肌细胞的影响

目的:探讨转染野生型p53(wtp53)基因对培养的人动脉平滑肌细胞(HASMCs)的影响,为冠状动脉支架内再狭窄的治疗提供新的思路。方法:以Lipofectamine 2000脂质体介导wtp53基因转染HASMCs株后,用免疫组化染色法检测转染wtp53基因后,其编码蛋白在HASMCs中的表达。绘制wtp53基因转染后HASMCs的增殖曲线。用WST-1法测定A值,并计算细胞生长的抑制率。用流式细胞仪检测wtp53基因转染对HASMCs凋亡的影响。结果:免疫组化染色法显示,wtp53基因转染后,在HASMCs的细胞核内高表达;wtp53基因的表达可抑制HASMCs的体外生长。HASMC/wtp53细胞的生长曲线较对照组明显降低;WST-1法显示,HASMC/wtp53的细胞活力与对照组相比有显著性差异(P0.05)。流式细胞仪检测显示,转染wtp53基因的HASMCs的凋亡率达40%以上,显著高于对照组。结论:转染wtp53基因对HASMCs具有明显的抑制和凋亡作用,提示wtp53基因转染HASMCs技术有可能为人冠状动脉支架内再狭窄的治疗提供一种新的防治策略与手段。     

p27kip1基因诱导食管癌细胞凋亡实验研究

目的　探讨p2 7基因诱导人食管癌细胞凋亡的作用。方法　构建重组体腺病毒Ad p2 7kip1,转移到培养的人食管癌细胞EC 970 6 ,用流式细胞术、DNA片段分析法、TUNEL法观察Ad p2 7kip1诱导EC 970 6细胞凋亡的作用。 结果　成功构建重组体腺病毒Ad p2 7kip1,病毒滴度为 1.2 4× 10 12 CFU/ml,在感染倍数≥ 5 0感染强度时 ,即可达到 10 0 %的转导效率。Ad p2 7kip1转染食管癌细胞后 ,流式细胞术检测在G1期前出现亚倍体凋亡峰。细胞DNA抽提电泳后发现凋亡特征性梯度。TUNEL法检测凋亡指数分别为 37.3± 3.4 (Ad p2 7kip1组 )及 1.3± 0 .2 (空白对照组 ) ,差异有显著性(P <0 .0 1)。结论　p2 7可有效诱导食管癌细胞凋亡 ,这一发现将在探索食管癌的基因治疗方面具有重要意义     

胶质瘤组织中EGFR、p27^kip1的表达变化及意义

目的观察胶质瘤组织中表皮生长因子受体（EGFR）和p27kip1的表达变化,并探讨其临床意义。方法采用免疫组化SP法检测60例胶质瘤组织、5例正常脑组织中EGFR和p27kip1。结果 60例胶质瘤患者中有39例表达EGFR,20例表达p27kip1。EGFR在正常脑组织中无表达,在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中阳性表达率分别为52.4%、60.9%、87.5%（P〈0.05）;p27kip1在正常脑组织中表达率为80.0%,在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中阳性表达率分别为57.1%、26.1%、12.5%（P〈0.05）。EGFR表达与胶质瘤病理分级呈正相关（r=0.426,P〈0.05）,p27kip1表达与胶质瘤病理分级呈负相关（r=-0.325,P〈0.05）。结论 EGFR、p27kip1表达与胶质瘤的恶性程度有关,其表达异常可能在肿瘤形成中起促进作用。     

p27^kipl和p57^kip2与CyclinD1在急性白血病的表达及其临床意义

目的:探讨p27kipl和p57kip2与CyclinD1在急性白血病中的表达情况及其临床意义。方法:采用免疫组化S-P法检测39例急性白血病及10例正常对照者骨髓中p27kipl和p57kip2与CyclinD1蛋白的表达情况,并结合临床病理资料进行分析。结果:p27kipl和p57kip2与CyclinD1蛋白在急性白血病患者的阳性表达率分别为31%、33%、54%,在对照组表达率为70%、40%、0。p27kipl与cyclinD1在白血病与对照组中的表达差异有统计学意义。在37例接受化疗的急性白血病中,p27kipl和p57kip2阳性表达组化疗后的缓解率(66%、69%)明显高于p27kipl和p57kip2表达阴性组的缓解率(32%、29%),其差异有统计学意义(P<0.05)。p57kip2与CyclinD1在白血病中的表达具有正相关性。结论:p27kipl和p57kip2与CyclinD1在急性白血病患者中存在异常表达其蛋白的表达水平可能会影响化疗疗效。     

siRNA干扰沉默HIF-1α基因在舌癌Tca8113细胞侵袭和迁移中的作用机制

目的探讨利用siRNA技术特异性阻断缺氧诱导因子(HIF)-1α基因表达对舌癌Tca8113细胞侵袭和迁移的影响。方法取指数生长期细胞消化计数后按2×105个/孔接种于6孔细胞培养板中,待细胞融合至40%~50%时,将针对HIF-1α的siRNA序列应用LipofectamineTM2000转染入Tca8113细胞(siRNA HIF-1α组,干扰组)。半定量RT-PCR及Western印迹法检测HIF-1α的m RNA及蛋白,四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡率,细胞侵袭实验和划痕实验检测细胞的侵袭和迁移能力。结果 siRNA可以有效沉默Tca8113细胞HIF-1α基因;干扰组细胞增殖较对照组明显受到抑制,且与细胞凋亡有关,凋亡率显著高于对照组(P0.05);,siRNA HIF-1α基因转染后的Tca8113细胞黏附能力降低,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05);侵袭能力也下降。结论 siRNA能够有效沉默HIF-1α基因,抑制舌癌Tca8113细胞侵袭和迁移,在某种程度上可以改善舌癌细胞的恶性表型,为舌癌的治疗提供思路。     

p27kip1基因克隆及其对人舌癌细胞生长的影响

目的 将克隆的人p27^kip1 cDNA构建真核表达载体并进行基因转染，研究其对人舌癌细胞生长的影响。方法 从正常组织中克降人p27^kip1基因连接至pcDNA3真核表达载体上，应用脂质体将重组质粒转染人舌癌Tca8113细胞中，用c418筛选抗性细胞克隆，观察外源目的基因在靶细胞中的整合及表达以及转染与未转染细胞的生长情况。结果 成功克隆p27^kip1cDNA并构建p27^kip1直核表达载体，将其导入Tca8113细胞中，经G418筛选得到稳定表达p27^kip1基因的细胞株，其细胞的生长受到抑制，增殖下降。结论 p27^kip1基因具有抑癌基因的作用，在体外转染Tca8113细胞并高表达p27^kip1抑制了舌癌细胞增殖。为进一步研究p27^kip1基因治疗奠定了基础。     

p21基因转染人肝癌SMMC-7721 细胞对化疗药物敏感性的研究

目的探讨p21基因转染人肝癌SMMC-7721细胞（7721细胞）对化疗药物的敏感性，深入研究p21基因对肝癌细胞的治疗作用。方法应用磷酸钙介导p21基因转染人肝癌7721细胞；通过G418筛选稳定表达细胞株并扩大培养；采用MTT法检测肿瘤细胞增殖速度；流式细胞术检测细胞周期变化。结果经过3～4w G418筛选得到稳定表达的细胞株，p21基因稳定转染并联合化疗药物应用可明显抑制7721细胞的体外增殖，细胞周期明显改变，细胞从G1期到G2期发生阻滞。结论提示转染外源p21基因联合化疗药物可使7721细胞周期阻滞于G1期，并可抑制肿瘤细胞增殖。     

结直肠腺癌中skp2、p27^kip1、ERK蛋白的表达及意义

目的研究细胞S期激酶相关蛋白2（skp2）、p27k ip1、细胞外调节蛋白激酶（ERK）蛋白在结直肠癌组织中的表达情况及在结直肠腺癌发生发展中的作用。方法应用免疫组化法检测60例结直肠癌组织（A组）、30例腺瘤组织（B组）、20例正常大肠组织（对照组）中skp2、p27k ip1、ERK蛋白的表达,分析其与临床病理因素的关系。结果 3组skp2、p27k ip1、ERK蛋白表达阳性率比较差异均有统计学意义（P〈0.05）;skp2、p27k ip1、ERK蛋白的表达与结直肠腺癌的分化程度、Dukes’分期及淋巴结转移有关（P〈0.05）;skp2、ERK与p27k ip1表达呈负相关（r=-0.723 7、P〈0.01;r=-0.695 2、P〈0.01）,而skp2与ERK表达呈正相关（r=0.652 2、P〈0.01）。结论 skp2、p27k ip1、ERK蛋白的表达可能与结直肠腺癌的发生发展有关,ERK可能参与了skp2-p27k ip1通路的调节。     

p27蛋白分子生物学及其与消化系肿瘤的关系

p27蛋白是一种细胞周期的负性调节物,在细胞增殖、凋亡、肿瘤的发生发展等过程中具有重要的调节作用。人类肿瘤中p27蛋白表达改变与其生物学行为密切相关。本文时p27基因和蛋白的生物学特性和功能及其与消化系肿瘤的关系作一综述。     

p27kip1基因转移对食管癌细胞生存素表达和端粒酶活性的影响

背景：p27kip1是新近发现的一种抑癌基因，早期研究表明p27kip1基因转移能显著抑制食管癌细胞和人食管癌裸鼠移植瘤的生长，表明该基因疗法可能是食管癌治疗的新途径，但其抑癌机制尚未完全阐明。目的：研究p27kip1基因转移对食管癌细胞生存素（survivin）表达和端粒酶活性的影响。从而阐明p27kip1的抑癌机制，为p27kip1基因治疗食管癌提供理论依据。方法：将携带p27kip1基因的重组腺病毒（Ad—p27kip1）和LacZ重组腺病毒（Ad—LacZ）分别转染食管癌细胞系Eca9706，观察细胞形态变化。以免疫细胞化学染色和蛋白质印迹法检测p27kip1和生存素的表达．以端粒重复序列扩增程序（TRAP）聚合酶链反应（PCR）-酶联免疫吸附测定（ELISA）检测端粒酶活性。结果：经Ad—p27kip1转染后，Eta9706细胞变圆，呈葡萄串样聚集以致脱落。细胞p27kip1表达明显增强，生存素表达降低，端粒酶活性显著受抑制。结论：p27kip1基因抑制食管癌细胞生长的作用机制可能与下调生存素表达和抑制端粒酶活性有关。     

旋毛虫肌幼虫p43cDNA的克隆及鉴定

目的 克隆旋毛虫肌幼虫p43cDNA并对其表达的融合蛋白酶活性进行鉴定与分析。 方法 用PCR技术从旋毛虫肌幼虫cDNA文库中扩增靶基因，克隆到pMD?鄄18T载体，转化至大肠埃希菌NovaBlue，序列测定后克隆到原核表达载体pET28a并转入表达菌DE3中。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后提取包涵体并复性，通过降解双链λDNA测定其融合蛋白脱氧核糖核酸酶II（DNase II）活性。 结果 成功克隆到p43 cDNA序列，该cDNA序列与美国发表的存在两个核苷酸的变异，分别为第210位的C变为T，第604位的A变为G。基于3名研究者从旋毛虫T. spiralis美国分离株获得的序列相同、6名国内研究者（含本课题组）从T. spiralis中国分离株获得的序列也相同，由此可以确定这两个核苷酸的变异为T. spiralis中国分离株特异性和特征性单核苷酸多态性（SNP）标记。p43重组蛋白能够降解双链λDNA，表明其有DNase II酶活性。 结论 成功克隆到p43cDNA，T. spiralis中国分离株的p43cDNA具有两个SNP标记，其表达的重组蛋白具有DNase II酶活性。     

胶质瘤组织中CTGF mRNA和p27 kip1 mRNA的表达及意义

目的观察人脑胶质瘤组织中结缔组织生长因子(CTGF)和p27 kip1的表达变化,探讨其与胶质瘤发生发展的关系。方法采用荧光实时定量PCR技术检测47例脑胶质瘤组织(Ⅰ～Ⅱ级23例,Ⅲ～Ⅳ级24例)和25例正常脑组织中CTGF mRNA和p27 kip1 mRNA,分析其表达水平和肿瘤级别的关系。结果胶质瘤组织中CTGFmRNA的表达均明显高于、p27 kip1 mRNA的表达明显低于正常脑组织(P均<0.01),Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤组织中CTGF mRNA的的表达显著高于、p27 kip1 mRNA的表达显著低于Ⅰ～Ⅱ级(P均<0.01),胶质瘤组织CTGF mR-NA与p27 kip1 mRNA的表达呈负相关(r=-0.281,P<0.05)。结论脑胶质瘤组织中CTGF mRNA和p27 kip1mRNA的表达异常,且两者呈负相关关系,这可能与胶质瘤的发生发展有关。     

p21WAF1/CIP1 基因转染对胃癌细胞生物学活性的影响

目的探讨p21^WAF1／CIP1基因(p21基因)对人胃癌细胞系(BGC)生物学活性的影响。方法应用分子克隆技术构建p21^WAF1／CIP1基因真核表达载体，然后用脂质体法将其导入到人胃癌细胞BGC中，经G418筛选获得可稳定表达p21^WAF1／CIP1的人胃癌细胞克隆，用中性红摄入法观察细胞生长速率，流式细胞仪(FcM)检测细胞周期变化。结果p21导入胃癌BGC细胞后，肿瘤细胞增值能力明显受到抑制，并出现细胞周期G1期阻滞。结论p21基因具有抑制胃癌细胞增殖的作用，可作为胃癌基因治疗的靶基因．