脂血对实时荧光定量PCR实验结果影响的研究

荧光定量PCR是聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）中的一种,因其方法学的高灵敏度、高特异性、简便、快速等特点,目前在临床上有了广泛的应用,并且在病原微生物领域中显示出了巨大的应用价值和广阔的发展前景。     

实时荧光定量PCR测定HBV-DNA的方法和临床意义

HBV—DNA定量是目前诊断乙型肝炎、判断病毒复制和评价患者肝脏病变、预后及药物疗效的重要指标之一，但在指导诊疗时仍需结合血清标记物、肝损害指标乃至HBV基因分型。HBV—DNA定量的方法有PCR核酸探针杂交法、R．ELISA、竞争定量PCR、实时荧光定量PCR，本文综述定量检测HBV—DNA意义及PCR检测方法。     

PreSlAg、HBeAg和HBV—DNA的对比检测与分析

目的：通过对比检测和分析739份血清中preS1蛋白、HmAg和HBV—DNA的检测阳性率，为临床正确选用实验室指标防治乙型肝炎提供依据。方法：应用ELISA法对739份血清进行PreSlAg和HBV血清标志物检测，并与实时荧光定量PCR检测HBV—DNA结果进行比较。结果：所有739份血清中，PmSlAg阳性率为34．6％（256／739），HmAg阳性率为觚7％（227／739），HBV—DNA阳性率为58.9％（435／739）。227份HBeAg阳性血清中，PreSlAg阳性率55．9％（127／227），HBV-DNA阳性率96．0％（218／227）；512份HBeAg阴性血清中，PreSlAg阳性率25．2％（129／512），HBV—DNA阳性率为42．4％（217／512）。HBeAg、HBV—DNA和PreSl的阳性率有显著差异（P〈0．05），阳性率高低依次为HBV—DNA〉PreSl〉HBeAg；HBeAg阳性血清中PreSlAg（55．9％）阳性率显著高于HmAg阴性血清PreSlAg（25．2％）阳性率（x^2=36．5，P〈0．01）；HBV—DNA阳性血清的PreSlAg检出率58．9％（256／435）显著高于HBV—DNA阴性血清的PreSlAg检出率1＆4％（56／304）（P〈0.01）；PreSl抗原与HBV—DNA阳性符合率为（200／256）7＆1％，阴性符合率为（248／483）51．3％。598份HBeAg阳性血清（阳性率为80．9%，598／739）中HBeAg、PreSl和HBV—DNA阳性数（率）分别是224（37．5%）、253（42．3oA）、417（69．7％）。结论：PreSlAg、HBV—DNA、HBeAg的阳性率有显著性差异（P〈0．05）。作为HBV感染和复制的指标，以检测HBV—DNA最为可靠，而PmSlAg可能较HBeAg更敏感。在HBV感染的不同时期，如何理解和使用上述指标对防治乙型肝炎有重要意义。     

ABI Quantistudio Dx实时定量PCR仪HBV-DNA检测的性能验证

 目的 验证ABI Quantistudio Dx实时荧光定量 PCR 仪 HBV-DNA 检测系统的性能。方法 参考 GB/T 22576-2008和CNAS-CL36相关文件,ABI Quantistudio Dx实时荧光定量 PCR 仪检测患者标本、质控品及卫生部临检中心室间参考物质。从以下几个方面进行性能验证:精密度、正确度、线性范围、检出限等。结果 ABI Quantistudio Dx 实时荧光定量 PCR仪 HBV-DNA 检测系统的批内精密度(批内 CV)分别为 2.09%(低浓度)、1.3%(高浓度);批间精密度(批间 CV)分别为3.92%(低浓度)、2.88%(高浓度);准确度评估以参加能力验证/室间质评的项目来判断,项目 PT 成绩为 100%,通过;系统最低检出限为50 U/ml;线性范围验证结果显示,线性回归方程为Y=1.0001X,R²=0.9976。线性范围为 1.00×10²~1.00×10⁸ U/ml。结论 ABI Quantistudio Dx 实时荧光定量 PCR 系统检测 HBV-DNA性能良好,满足临床检测需要。     

实时荧光定量PCR检测莫氏立克次体

目的 采用TaqMan-MGB探针建立检测莫氏立克次体的实时荧光定量PCR.方法 依据莫氏立克次体外膜蛋白B基因(ompB)设计引物和探针,以克隆的ompB作模板建立实时荧光定量PCR方法.结果 建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.995);该方法能检出＜10拷贝的莫氏立克次体DNA,敏感性为普通PCR的1 000倍.用该方法检测莫氏立克次体DNA,结果为阳性,但是检测其他相关细菌DNA的结果均为阴性.用该方法检测莫氏立克次体感染豚鼠血标本,50%样本检测为阳性,而普通PCR检测结果均为阴性.结论 该实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,适合于快速检测样本中微量莫氏立克次体DNA,可用于临床实验室快速确诊地方性斑疹伤寒.     

副溶血弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的 建立一种快速检测副溶血弧菌的实时荧光定量PCR方法.方法 根据副溶血弧菌tdh基因设计合成引物及TaqMan探针,利用阳性质粒和模拟标本建立副溶血弧菌实时荧光定量PCR检测方法.结果 以副溶血弧菌DNA为模板克隆了tdh基因,得到阳性质粒.利用阳性质粒建立了定量PCR方法,得到标准曲线y=-4.9197x+58.72,决定系数(R2)为0.9864.此方法具有很好的特异性,在对15种肠道致病菌的检测中,只有副溶血弧菌基因组DNA的扩增结果为阳性.对粪便和食物模拟标本进行检测,敏感性均为102cfu/μl.此方法重复性较好,对4种浓度(105、104、103、102cfu/μl)的菌液各进行3次检测,结果均为阳性,且Ct值的变异系数＜2%.结论 建立了一种检测副溶血弧菌的荧光定量PCR方法,该法的敏感性和特异均较好,适用于快速、准确地检测食品和粪便中的沙门菌.     

Line-Gene实时荧光定量PCR不同结果分析模式对检测结果的影响

目的 探讨实时荧光定量PCR不同结果分析模式对检测结果的影响。方法 用Line-Gene FQD-33A型荧光定量PCR检测系统检测本院门诊和病房乙肝病人血清HBV DNA 77份,分别用最大二阶导数法和样点拟合法进行结果分析。结果 发现两种分析方法的总体相关性较好(r=0.978)。但HBV DNA拷贝数含量<10~5时,两种模式的相关性差(r=0.706),此时,最大二阶导数法得出的数值要比样点拟合法低(t=2.61,P<0.05),且易出现假阴性结果。结论 虽然样点拟合法步骤较多,但其结果更可靠,因此进行结果分析时,建议使用样点拟合法。而且当样本中HBV DNA拷贝数<10~5时只能使用样点拟合法进行结果分析。     

多重荧光定量PCR法检测食品中的沙门菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌

目的 建立一种可同时检测沙门菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌3种食源性致病菌的多重荧光定量PCR技术。方法 利用沙门菌invA毒力基因、副溶血弧菌gyrase基因和金黄色葡萄球菌Sa442基因的特异性引物、探针,建立多重荧光定量PCR反应体系,完成特异性、敏感性评价,并用该法与国标法进行40份留样食品的检测比较。结果 各对引物、探针均能扩增出目标靶序列,3种检测通道无交叉干扰,对非目标菌无扩增信号,对沙门菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的核酸检测限均达到102拷贝/μl;用多重荧光定量PCR法在40份食品样本中检出3份金黄色葡萄球菌阳性样本,其中1份国标法检测为阴性,其他样本检测结果完全一致。结论 建立了一种针对沙门菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的多重荧光定量PCR检测方法,该方法具有良好的特异性与敏感性,可为食品安全提供技术支持。     

实时荧光定量PCR检测应力性骨折新兵外周血TNFRSF10C mRNA表达

目的:检测TNFRSF10C基因在应力性骨折(SF)患者与正常人之间的表达差异。方法:采用1:1配比的病例对照研究,选取入伍新兵SF病例及正常对照各10例,取受试者空腹肘静脉血,采用实时荧光定量PCR检测TNFRSF10C基因表达,结合管家基因GAPDH进行相对定量分析。结果:设计并合成了一组只特异性结合人TNFRSF10C基因的实时荧光定量PCR引物,结果未发现非特异性扩增。10例SF样本中有7例TNFRSF10C基因表达上调,上调1.4倍至6.7倍,另3例SF样本TNFRSF10C基因表达下调,分别为50%、90%和90%。结论:本研究建立的TNFRSF10C基因实时荧光定量PCR检测体系特异性好、可靠。TNFRSF10C基因表达结果为分析SF发病的分子机制及SF早期诊断提供了重要线索。     

实时荧光定量PCR检测痰中结核分枝杆菌临床评价

目的评价实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）检测临床痰标本中结核分枝杆菌诊断肺结核的意义。方法收集我院2011年9月-2013年8月期间收治的126例确诊为肺结核的患者和80例非结核性呼吸道疾病患者的痰液标本,分别采用漂浮集菌涂片镜检、BACT／ALERT3D快速培养法和FQ-PCR法检测痰中结核杆菌,分析检出结果。结果126例确诊为肺结核患者的痰标本中对结核分枝菌杆的检验以FQ-PCR检出率最高达到53．2％,高于快速培养法的46．8％（P〈0．05）和痰漂浮集菌涂片镜检法的32．5％（P〈0．01）。FQ-PCR与痰培养法总体一致性为95．1％,K=0．88。对痰涂片阳性标本,两者敏感性差异无统计学意义（P〉0．05）;对痰涂片阴性标本,FQ-PCR敏感性明显高于快速培养法（P〈0．01）。结论FQ-PCR具有快速、敏感、特异、可定量和自动化的优点,值得应用于痰中结核杆菌的检测及肺结核的诊断。     

定量聚合酶链反应检测HBV感染患者血清HBV DNA的临床意义

采用信号引物能量转换定量聚合酶链反应（PCR）检测104例不同HBV感染患者血清HBV DNA含量。结果：不同HBV感染患者HBV含量范围在10^4.49-10^9.93拷贝／ml，其中急性乙肝含量显著低于慢性乙肝、乙肝后肝硬变和原发性肝癌患者的含量（P＜0.05和P＜0.01)；HBeAg( )患者的含量显著高于HBeAg(-)／抗－HBe( )患者的含量（P＜0.001)；相关分析显示：血清HBV DNA含量与血清ALT水平无明显相关。结论：HBV感染的慢性化可能与血清HBV DNA含量高有关，肝损伤与血清HBV DNA含量无明显关系；e系统血清传换后，HBV并未停止复制，只是复制水平降低，应用定量PCR检测血清HBV DNA含量有助于HBV感染患者预后的判断和重新评价HBV感染的自然史及HBVM的临床意义。     

乙型肝炎病毒复制阳性417例的ALT、乙肝标志物和HBV DNA临床分析

目的调查417例乙型肝炎病毒复制阳性患者的肝损伤、乙肝标志物(HBV Markers,HBVM)和外周血HBV DNA水平及抗病毒治疗适应证符合情况。方法对乙型肝炎病毒复制阳性的417例患者的ALT、乙肝标志物(5项)和HBV DNA进行定量分析。结果HBVDNA阳性者中,性别间ALT各组例数比例不同,但在ALT≥2ULN组,性别间ALT例数相同,而HBV DNA拷贝数差异有统计学意义。ALT各组的HBeAg阴、阳性分布无差异,ALT各组HBV DNA拷贝数随ALT升高而升高。乙肝标志物组的13、145、15组的抗病毒治疗适应证符合率是一致的,135组高于其他三组,且13、135组HBVDNA拷贝数无差异,高于其他两组。结论监测ALT、乙肝标志物和HBVDNA,有助于了解本地区HBV感染情况,节约医疗资源,及时治疗,延缓病程。     

乙型肝炎患者不同血清标志物HBV DNA的表达及意义

 目的探讨血清HBV DNA水平与HBV标志物(HBVM)表现模式的相关性.方法血清HBV DNA定量检测采用PCR ELISA法,HBVM采用ELISA法.结果在HBVM阳性的366例血清中,有199例HBV DNA阳性,占54.4%.血清HB-/ml占65.2%;HBsAg、抗-HBe、抗-HBc阳性者HBV DNA-HBc阳性者HBV DNA阳性率占95.2%,≥106 copiessAg、HBeAg、抗阳性率占29.1%,≥106 copies/ml占17.6%.结论血清HBVM阳性患者中约55.0%的血清HBV DNA阳性,且HBeAg阳性患者中HBV DNA含量及阳性率均明显高于抗-HBe阳性者;在抗-HBs、抗-HBc阳性或HBsAg阴性者血清内也有HBV DNA阳性者.     

标本溶血对心肌酶测定值的影响

目的探讨溶血标本对心肌酶测定值的影响。方法将50例健康母亲脐带血标本人为造成不同程度溶血,测定溶血前后的心肌酶活性。结果标本溶血后心肌酶活性明显高于溶血前(P<0.05或P<0.01),且随着溶血程度加重心肌酶活性逐渐升高。结论溶血标本对心肌酶活性的测定有严重影响,溶血程度越重其影响越大。     

乙肝患者肝移植前后血清病毒指标的变化及意义分析

目的 观察乙肝患者肝移植术后血清5项指标及HBV DNA含量的变化并分析其临床意义.方法 选择2006年10月-2007年3月在解放军第302医院施行肝移植术且术前采用拉米夫定治疗的35例乙肝患者为研究对象,采用ELISA法测定手术前、后血清5项指标,采用荧光FCR法测定血清HBV DNA含量变化.选择拉米夫定治疗前HBV DNA高于10 000U/ml的45例乙肝患者作为对照,测定用药前和用药2周后血清乙肝5项指标和HBV DNA.结果 35例肝移植患者中移植后第2天,除1例术前、术后乙肝5项和HBV DNA无明显变化外,其余34例肝移植患者的血清HBsAg和HBV DNA全部转阴,HBsAb全部转阳.其中11例大三阳患者的HBeAg全部转阴,6例发生从HBeAg到HBeAb的血清学转换,但移植前后血清HBeAb均无变化.45例拉米夫定对照患者均未发生HBsAg阴转和HBsAb阳转的现象,11例患者血清HBV DNA含量下降到500U/ml以下,29例血清HBV DNA含量下降,但持续高于1 000u/ml,5例患者的HBV DNA无明显变化.在34例大三阳患者中,有29例患者HBeAg转阴但未发生HBeAb阳转现象.结论 肝移植术外加抗病毒和免疫学的综合治疗方案,可使97%的乙肝患者彻底清除血清HBV DNA,并发生HBsAg、HbeAg的血清转换.     

用多重及套式PCR同时检测血清中的HBV和HCV方法的建立

首次应用多重及套式ＰＣＲ技术同时检测人血清中的ＨＢＶ和ＨＣＶ。将抽提的ＨＢＶＤＮＡ和（或）ＨＣＶＲＮＡ在含ＡＭＶ逆转录酶、ＴａｑＤＮＡ多聚酶以及ＨＢＶ和ＨＣＶ外套引物的ＰＣＲ缓冲引物的ＰＣＲ缓冲液中进行逆转录后连续进行ＰＣＲ扩增，以第一轮扩增产物为模板，在含ＨＢＶ和ＨＣＶ内套引物的ＰＣＲ反应体系中进行第二轮扩增，产物经电泳后，以ＤＮＡ分子量标志物或已知片段做参考，出现５２３ｂｐ和（或）２６０ｂｐ产     

治疗型双质粒HBV DNA疫苗的构建及其鉴定

为构建以人白细胞介素 2 /γ干扰素(hIL 2 /hIFN γ)融合基因为佐剂的治疗型HBVDNA疫苗 ,采用DNA重组技术分别构建含有HBV包膜中蛋白 (preS2 ·S)抗原和hIL 2 /hIFN γ融合蛋白的真核表达质粒即pcDNAS2 ·S和pcDNAIIF ,酶谱和测序分析表明克隆的preS2 ·S和hIL 2 /hIFN γ融合蛋白基因片段的方向、序列与预期相符。用脂质体转染试剂转染COS 7细胞 ,并用ELISA检测转染细胞培养上清中目的基因表达水平。结果显示 ,质粒转染后 4 8h达峰值 ,分别为HBsAg(P/N) =7.6 3、IL 2 =1 0 .35ng/ml、IFN γ =7.90ng/ml。以CTLL 2依赖细胞株/MTT比色法和微量细胞病变抑制法 (WISH VSV)检测pcDNAIIF转染后 4 8h培养上清中IL 2及IFN γ活性 ,结果分别为 998U/ml和 2 4 9U/ml。证明构建的重组质粒pcDNAS2 ·S和pcDNAIIF结构正确 ,在体外转染细胞其质粒得到分泌表达并保留生物学活性     

治疗型HBV DNA疫苗的研究与应用

综述治疗型乙型肝炎病毒(HBV)疫苗研究概况,重点阐述治疗型HBV DNA疫苗研究进展、治疗乙型肝炎的依据、作用机制和与传统疫苗的比较等。同时对我们自行研制的治疗型双质粒HBV DNA疫苗的特色做了较客观的评价。     

Semi-quantitative PCR Analysis of DNA Degradation

Natural variables, including environmental conditions and post-mortem interval (PMI), affect the course of tissue decay in forensic and archaeological contexts. Compared with soft tissue, skeletal materials provide longer protection against DNA degradation. However environmental factors, including temperature and humidity, may affect the longevity of DNA survival in bone structure. In this study we describe the development of a semi-quantitative multiplex PCR based method to assess the level of DNA degradation with applications in analysis of forensic specimens. The assay was then applied to assess DNA survival in rib bone samples taken from 12 corpses in the mortuary. Samples were de-fleshed and stored in two different environmental conditions, including ambient conditions and underground burial from 103 to 445 days. Bone DNA was extracted and then assessed by the optimized semi-quantitative PCR and capillary electrophoresis of three products from the human mitochondrial DNA. The results show DNA survived for longer periods in samples stored in ambient conditions compared with underground burial conditions. There was no correlation found between the level of DNA degradation and PMI in our samples. Results also confirm that post-mortem alteration to DNA in skeletal tissues can occur very soon after death, with direct implications to the forensic industry.     

血清乙型肝炎病毒DNA载量对乙型肝炎相关性肾炎临床及病理表现的影响

目的 研究血清乙型肝炎病毒(HBV DNA)载量对乙型肝炎病毒相关性肾炎(HBV-GN)的临床表现及肾脏病理的影响.方法 根据HBV DNA复制程度将135例患者分为4组:病毒复制阴性组(n=52)、低度复制组(n=21)、中度复制组(n=20)、高度复制组(n=42).收集患者血常规、血生化指标、免疫球蛋白、血清补体C3、C4;尿常规、24h尿蛋白定量,尿NAG酶等数据.用半定量积分法分析各组间临床指标与病理表现的差异.结果 随着血清HBV DNA载量的增加,患者中肾病综合征比例增高,而慢性肾炎综合征比例下降(P<0.01).随着血清HBVDNA载量的增加,患者尿蛋白定量升高(P<0.01),血浆白蛋白降低(P<0.05),血清C3、C4降低(P<0.05);膜性肾病患者肾小球损伤加重,IgA肾病的患者小管及间质损害加重.病毒复制阴性组乙肝标记物沉积以HbsAg为主,而中、低度复制组以HbcAg和HBsAg共同沉积为主,与阴性组比较差异有统计学意义(P<0.01).随着血清HBVDNA的增加,肾脏C4沉积增加,与血清HBVDNA有一定相关性(r=0.343,P<0.01).结论 随着血清HBVDNA载量的增加,HBV-GN患者的临床及肾脏病理表现加重,相关结果可为HBV-GN患者的抗病毒治疗提供依据.