乙型脑炎病毒SA_(14)-14-2减毒疫苗株的生物学和基因稳定性

目的研究乙型脑炎病毒(JEV)SA14-14-2减毒疫苗株传代过程中的生物学和基因稳定性,为疫苗的安全性和免疫原性提供依据。方法将JEVSA14-14-2减毒疫苗株PHKC7代病毒在原代地鼠肾细胞(PHKC)上连续传代,检测各代次病毒的培养特性以及第8、12、17和22代病毒的安全性及免疫原性;对起止代次病毒(PHKC8和22代)进行全基因组序列测定,对中间代次病毒(PHKC12和17代)的结构蛋白基因进行测序,并与基因库乙脑病毒SA14-14-2株(D90195)比较。结果各代次病毒产生的细胞病变基本一致,病毒滴度在17代前较稳定;在BHK21细胞上形成的蚀斑形态一致;小鼠脑内的致病力未发生变化,乳鼠传代返祖试验高代次病毒毒力有升高趋势。8、12、17和22代病毒免疫小鼠后,对P3强毒攻击均具有保护作用。E蛋白核苷酸和氨基酸序列,PHKC8代与D90195完全一致;而PHKC12、17和22代出现单个碱基(第2142或2143位)突变,导致E389氨基酸改变(D→N或D→A),但并非回复突变。4个代次病毒的PrM-C区结构蛋白基因均未发生变化。PHKC8、22代病毒的其他核苷酸突变发生在基因组非结构蛋白区和3′端非编码区;全序列PHKC8和22代与D90195比较,发现7～8个核苷酸不同,导致3～4个氨基酸的差异,核苷酸和氨基酸的同源性分别大于99.93%和99.88%,且以上突变不存在于明确的相关减毒位点上。结论JEVSA14-14-2减毒疫苗株在PHKC上连续传15代,仍保持高度的生物学和基因稳定性,疫苗生产用病毒控制在10代以内较为安全。     

乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2株)的纯化

目的建立纯化乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2株)的方法。方法应用超滤浓缩和分子筛凝胶柱层析纯化乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)SA14-14-2病毒液,检测其病毒滴度、原代地鼠肾细胞残留蛋白含量、牛血清白蛋白残留量、庆大霉素残留量,并进行小鼠脑内致病力试验、乳鼠传代返祖试验、异常毒性试验,制备纯化冻干疫苗,进行热稳定性试验。结果纯化后的JEV病毒滴度高于7.0 lg PFU/ml,平均回收率为23%;牛血清白蛋白残留量、庆大霉素残留量及安全性试验均符合《中国药典》三部(2010版)相关规定,去除了约95%的原代地鼠肾细胞残留蛋白;制备的冻干疫苗及热稳定性试验中的病毒滴度均高于5.7 lg PFU/ml,且热稳定性试验中病毒滴度下降未超过1.0 lg,符合《中国药典》三部(2010版)规定。结论建立了乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2株)纯化工艺,但病毒回收率较低,不适宜规模化生产,对乙型脑炎病毒减毒活疫苗质量控制具有指导意义。     

流行性乙型脑炎减毒活疫苗生产毒株(SA_(14)-14-2)的稳定性研究

流行性乙型脑炎病毒弱毒株经原代地鼠肾细胞连续传至17代后,毒株蚀斑形态与低代次毒株相似,均为一致的小斑,直径为1mm士,边缘整齐;高代次毒株对成龄小鼠的神经内和神经外毒力未发现增高现象;乳鼠脑内返传一代和返祖试验均未发现高代次较低代次毒力明显升高;不同抗原性的单克隆抗体在与低代和高代次弱毒株的免疫荧光反应中未发现抗原位点变化。     

乙型脑炎减毒活疫苗毒力稳定性分析

目的分析乙型脑炎减毒活疫苗毒力稳定性。方法按照《中国药典》三部(2010版)及武汉生物制品研究所有限责任公司《乙型脑炎减毒活疫苗乳鼠返祖传代试验及小鼠脑内致病力试验SOP》,对随机抽取的28批乙型脑炎减毒活疫苗进行乳鼠返祖传代试验的脑内致病力检测,同时测定发病乳鼠脑组织悬液的病毒滴度,并应用SPSS 13.0软件对28批疫苗病毒滴度、发病乳鼠脑组织上清病毒滴度及发病乳鼠脑内病毒对小鼠的脑内致病力检测结果进行Kendall相关性分析。结果 28批乙脑减毒活疫苗病毒滴度为6.0~7.1 Lg PFU/ml,发病乳鼠脑内病毒对小鼠的脑内致病力(LD50)均低于3.0 Lg LD50/0.03 ml,发病乳鼠脑组织上清病毒滴度为5.8~7.0 Lg PFU/ml。发病乳鼠脑内病毒对小鼠的脑内致病力与疫苗滴度及发病乳鼠脑组织上清病毒滴度间不存在相关性,而疫苗滴度与发病乳鼠脑组织上清病毒滴度间低度相关。结论乙型脑炎减毒活疫苗毒力稳定,乳鼠传代返祖试验及其判定标准科学严谨,用于疫苗的质量控制是可行的,进一步表明SA14-14-2株遗传稳定性良好。     

乙型脑炎减毒活疫苗对不同基因型乙型脑炎病毒的免疫效果

目的研究乙型脑炎减毒活疫苗免疫人体后对不同基因型乙型脑炎病毒的免疫反应。方法将乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2)免疫8~12月龄健康儿童,采集免疫前及免疫后28 d静脉血,分离血清,采用蚀斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test,PRNT)分别检测血清中对不同基因型乙型脑炎病毒毒株的中和抗体,计算血清中和抗体阳转率。结果乙型脑炎减毒活疫苗免疫后对基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型乙型脑炎病毒毒株均产生了显著水平的中和抗体,血清中和抗体阳转率分别为94%、92%和94%。结论乙型脑炎减毒活疫苗免疫人体后,对不同基因型的乙型脑炎病毒均产生良好的免疫应答。     

SA_(14)-14-2株乙型脑炎活疫苗流行病学效果观察

本文报道了1～10岁儿童普种乙脑活苗后,乙脑发病率下降情况。结果表明,乙脑活苗接种能使乙脑发病率下降70％左右(P<0.01)。在普种乙脑活苗后的3年中。发生的1～10岁乙脑病例有95％以上未接种乙脑活苗,并出现了乙脑发病年龄上移的趋势(P<0.05),表明乙脑活苗具有较好的保护效果。     

流行性乙型脑炎减毒活疫苗生产毒种(SA14-14-2株)及其疫苗的表型和E基因稳定性研究

目的　对乙脑减毒活疫苗SA14 14 2株生产毒种及其疫苗病毒滴度、脑内毒力和E区核苷酸序列进行回顾性测定。方法　应用乳金黄地鼠肾传代细胞 (BHK 2 1)结晶紫蚀斑法进行病毒滴度的测定 ,小鼠脑内法检测疫苗脑内毒力。应用RT PCR方法扩增SA14 14 2生产毒种和疫苗E区的核苷酸 ,经凝胶层析纯化的PCR产物直接用于测序或克隆到pGEM T载体中 ,经酶切和PCR鉴定后进行测序。结果　疫苗在 - 2 0℃保存长达 10多年 ,疫苗病毒滴度下降不超过 0 5lg;脑内毒力未见毒力回升。病毒蚀斑形态仍保持较SA14野毒株形态小的特性 ;以不同批次疫苗和生产毒种提取的病毒RNA作为模板进行RT PCR扩增 ,扩增的基因片段与预期大小一致 ;E区基因序列与野毒株差异的 8个氨基酸没有一个发生回复突变。结论　SA14 14 2生产毒种及其不同年度不同批次疫苗的生物表型和E区核苷酸的特性是十分稳定的     

乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS3基因的克隆及原核表达

目的克隆并表达乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS3编码区的基因片段,为重组蛋白进一步的功能研究奠定基础。方法提取乙脑病毒SA14-14-2株总RNA,用RT-PCR法扩增NS3-1、NS3-2基因片段,克隆入原核表达载体pET15bTAT中,构建重组原核表达质粒,转化大肠杆菌Rosetta2,IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组原核表达质粒pET15bTAT-NS3-1和pET15bTAT-NS3-2经酶切证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约为27000和20000,主要以包涵体的形式表达。重组蛋白纯化后纯度可达80%以上,并可被小鼠抗乙型脑炎病毒SA14-14-2株血清识别。结论已成功克隆了乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS3-1和NS3-2基因,并在大肠杆菌Rosetta2中获得表达。     

乙型脑炎减毒活疫苗病毒SA14-14-2株经三带喙库蚊胸腔接种后的生物学和分子生物学特性

目的研究乙型脑炎病毒减毒活疫苗SA14-14-2株经三带喙库蚊胸腔接种繁殖后的生物学和分子生物学特性,进一步评价该株病毒的稳定性和安全性。方法将乙型脑炎病毒减毒活疫苗SA14-14-2株胸腔接种的三带喙库蚊研磨,离心收集上清液,接种于BHK21细胞中培养,得到SA14-14-2M1C1病毒液。应用空斑形成单位法测定病毒滴度,再进行小鼠脑内毒力测定和乳鼠脑内回传后毒力返祖试验。提取病毒RNA,RT-PCR扩增E基因片段,测序后与SA14-14-2原株的E基因序列进行比较分析。结果SA14-14-2M1C1病毒液滴度达1.4×107PFU/ml,小鼠脑内毒力测定结果无小鼠发病死亡,乳鼠脑内传代对小鼠的脑内致病力很低,毒力为1.9LgLD50/0.03ml,小于《中国药典》规定的3.0LgLD50,且皮下注射未见小鼠发病死亡。扩增出的E基因片段序列与原株相比较,只有E区1340位一个核苷酸的变化A→G,导致E447位1个氨基酸的改变D(Asp)→G(Gly),此差异位点不是SA14-14-2株发生基因变异的8个位点之一。结论SA14-14-2疫苗株病毒经三带喙库蚊胸腔接种繁殖后,其生物学(弱毒)特性和基因特征(E区8个氨基酸突变)未发生改变,进一步证实了该病毒的稳定性。     

乙型脑炎减毒活疫苗E蛋白基因及氨基酸序列稳定性分析

目的分析2003²011年连续9年出口韩国的23批乙型脑炎减毒活疫苗E蛋白基因及氨基酸序列的稳定性。方法提取出口韩国的23批乙型脑炎减毒活疫苗及其生产该疫苗的主种子和工作种子病毒RNA,RT-PCR法扩增乙型脑炎减毒活疫苗病毒E蛋白基因片段后进行测序;将23批乙型脑炎减毒活疫苗E蛋白基因序列中8个关键位点氨基酸序列与GenBank中登录的乙型脑炎病毒弱毒株SA14-14-2应用AlignX比对软件进行分析;检测23批乙型脑炎减毒活疫苗及生产该疫苗的主种子和工作种子病毒滴度。结果 23批疫苗与生产该疫苗的主种子、工作种子的病毒E蛋白基因序列与GenBank中登录的乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2 E蛋白基因序列完全一致,均由1 500个核苷酸组成,并编码500个氨基酸,同源性100%;23批疫苗E蛋白基因中与弱毒力密切相关的8个关键位点的氨基酸均未发生改变,与生产该疫苗的主种子、工作种子以及GenBank中登录的乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2(D90195)E蛋白相应位点一致性为100%;生产23批疫苗的主种子和工作种子病毒滴度变化幅度较小,为6.722011年连续9年出口韩国的23批乙型脑炎减毒活疫苗E蛋白基因及氨基酸序列的稳定性。方法提取出口韩国的23批乙型脑炎减毒活疫苗及其生产该疫苗的主种子和工作种子病毒RNA,RT-PCR法扩增乙型脑炎减毒活疫苗病毒E蛋白基因片段后进行测序;将23批乙型脑炎减毒活疫苗E蛋白基因序列中8个关键位点氨基酸序列与GenBank中登录的乙型脑炎病毒弱毒株SA14-14-2应用AlignX比对软件进行分析;检测23批乙型脑炎减毒活疫苗及生产该疫苗的主种子和工作种子病毒滴度。结果 23批疫苗与生产该疫苗的主种子、工作种子的病毒E蛋白基因序列与GenBank中登录的乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2 E蛋白基因序列完全一致,均由1 500个核苷酸组成,并编码500个氨基酸,同源性100%;23批疫苗E蛋白基因中与弱毒力密切相关的8个关键位点的氨基酸均未发生改变,与生产该疫苗的主种子、工作种子以及GenBank中登录的乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2(D90195)E蛋白相应位点一致性为100%;生产23批疫苗的主种子和工作种子病毒滴度变化幅度较小,为6.72⁷.17 lgPFU/ml,而23批疫苗的病毒滴度变化幅度也较小,为7.027.17 lgPFU/ml,而23批疫苗的病毒滴度变化幅度也较小,为7.02⁷.61 lgPFU/ml。结论连续9年出口韩国的23批乙型脑炎减毒活疫苗病毒E蛋白基因稳定,一致性良好,该疫苗质量稳定,安全可靠。     

流行性乙型脑炎活疫苗11年的流行病学效果

目的 观察连续大面积接种流行性乙型脑炎活疫苗的流行病学效果。方法 连续观察１１年接种 乙脑活疫苗的１８２７１５人次的乙脑发病率。结果１１年内均未出现异常反应,总发病率由接种前的２１．８９／１０万下降 到２／１０万左右,保护率为９８．９９％。结论 进一步证明乙脑活疫苗安全有效。     

流行性乙型脑炎减毒活疫苗国内外不同野毒株的免疫性

目的研究乙型脑炎减毒活疫苗对国内外不同野毒株的免疫原性。方法用小鼠保护力试验和空斑减少中和试验检测该疫苗对国内外不同野毒株攻击的保护作用及其免疫血清的中和能力。结果小鼠免疫1针后均能抵抗国内11株和国外11株乙脑病毒的攻击,保护率均可达90％以上;人体免疫血清对台湾1株和国外9株病毒均有明显的中和作用。结论SA14-142株乙脑活疫苗具有广谱的免疫原性。     

乙型脑炎减毒活疫苗诱导小鼠的细胞免疫应答

目的探讨乙型脑炎(简称乙脑)减毒活疫苗在小鼠中诱导细胞免疫应答的能力,评价疫苗的免疫原性。方法以乙脑减毒活疫苗免疫BALB/c小鼠,制备小鼠脾淋巴细胞,在体外以重组蛋白NS3-1和NS3-2进行刺激,采用酶联斑点法(ELISPOT)检测分泌细胞因子的效应T细胞的频数。结果乙脑减毒活疫苗免疫小鼠的脾淋巴细胞在体外经重组蛋白NS3-1和NS3-2刺激后,可诱导高频数的分泌IFNγ的CD4+和CD8+T淋巴细胞及低频数的分泌IL-4的淋巴细胞;而乙脑灭活疫苗仅诱导低频数的分泌IFNγ和IL-4的T淋巴细胞。结论乙脑减毒活疫苗可在小鼠中有效地诱导NS3-1和NS3-2抗原特异性T淋巴细胞应答,且应答水平显著高于乙脑灭活疫苗。     

流行性乙型脑炎减毒活疫苗对国内外不同野毒株的免疫性

目的　研究乙型脑炎减毒活疫苗对国内外不同野毒株的免疫原性。方法　用小鼠保护力试验和空斑减少中和试验检测该疫苗对国内外不同野毒株攻击的保护作用及其免疫血清的中和能力。结果　小鼠免疫 1针后均能抵抗国内 11株和国外 11株乙脑病毒的攻击 ,保护率均可达 90 %以上 ;人体免疫血清对台湾 1株和国外 9株病毒均有明显的中和作用。结论　SA14 142株乙脑活疫苗具有广谱的免疫原性。     

流行性乙型脑炎SA_(14)-14-2弱毒株在狗胎肾细胞传代适应的研究

流行性乙型脑炎SA_(14)-14-2弱毒株经原代狗胎肾细胞连续传递4代以后,其病毒滴度稳定在7.5～8.0 log TCID_(50)/0.2ml。传代后的各代病毒(命名为 SA_(14)-14-2PDK-CD)对三周龄小鼠脑内无毒力、皮下无致病力、弱毒力稳定性和免疫原性等特性与原 SA_(14)-14-2 株相同。以该株病毒和原代狗肾细胞制备的活疫苗,经全面检定完全符合现行《乙型脑炎活疫苗规程》标准。