重症肌无力患者造血干/祖细胞及其亚群富集纯化的研究

目的:获得高纯度造血干/祖细胞及其亚群,用于重症肌无力(MG)造血干细胞移植治疗和生物学特性的研究。方法:用免疫磁珠法(MiniMACS)从MG骨髓中富集CD34+细胞后再用荧光激活细胞分选(Fluorescent activatedcell sorter,FACS)纯化CD34+/CD38+和CD34+/CD38-细胞亚群。结果:MiniMACS分选的CD34+细胞群纯度达90％,FACS分选的CD34+/CD38-和CD34+/CD38+两细胞亚群纯度可达95％以上。结论:联合使用MiniMACS和FACS可迅速大量纯化HSC/HPC及其重要细胞亚群,可用于临床造血于细胞移植、基因治疗和研究HSC/HPC及其亚群生物学特性。     

造血干/祖细胞及其在神经免疫领域移植的研究进展

造血干/组细胞是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的造血前体细胞,CD34~+细胞群被公认是最佳的移植物。近20年来广泛应用于临床移植治疗恶性血液病、实体肿瘤和自身免疫性疾病。本文主要从造血干/祖细胞生物学特性、移植后重建机体的免疫功能以及在神经系统移植治疗方面进行综述。     

免疫磁珠法分离和纯化重症肌无力患者骨髓CD34+造血干细胞

目的　分离和纯化重症肌无力 ( MG)患者骨髓 CD3 4 造血干细胞。方法　采用免疫磁珠法 ( Mini MACS)分离和纯化 CD3 4 细胞 ,用流式细胞仪对其进行评估并检测纯化后细胞活力。结果　骨髓分离纯化前、后CD3 4 细胞的百分率分别为 ( 2 .65± 0 .65 ) %、( 85 .3 7± 7.47) % ( P<0 .0 0 1 ) ;CD3 4 细胞分离纯化前、后细胞活力未受影响 ( P >0 .0 5 )。结论　Mini MACS可有效地分选 MG患者 CD3 4 骨髓造血干细胞 ,且细胞活力不受影响。     

微囊微环境体外扩增人脐血造血干/祖细胞

背景：由于单份脐血所含的造血细胞数量有限,目前只能用于儿童或低体质量成人血液病和急性辐射损伤等疾病患者,有效扩增脐血造血干/祖细胞已成为研究热点。 目的：观察微囊微环境对脐血造血干/祖细胞扩增的影响,以及此过程中可否使造血干/祖细胞在扩增的同时仍维持其未分化状态。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2006-06/2007-09在中国科学院大连化学物理研究所完成。 材料：正常足月产新生儿脐带血由大连市妇产医院提供,提供者知情同意。 方法：Ficoll法梯度分离人脐血单个核细胞,采用静电液滴法在生理条件下进行微囊化包封和体外培养。以同条件平面培养的脐血单个核细胞作为对照。 主要观察指标：观察微囊化脐血细胞的生长特点及脐血细胞总数的变化;流式细胞仪检测培养过程中CD34+细胞扩增情况;应用甲基纤维素半固体培养法观察扩增细胞的集落形成能力。 结果：脐血细胞在微胶囊内持续增殖,并以聚集成团的三维方式生长,两种培养方式对脐血细胞总数均无明显影响(P > 0.05)。对比CD34+细胞扩增和细胞集落的生成发现,微囊化培养脐血细胞的CD34+细胞数量和集落密度均在培养第6天达到高峰,明显高于平面培养3 d时所达到的峰值;之后逐渐下降,至12 d后平面培养细胞的CD34+细胞和集落形成能力几乎检测不到,而此时微囊化培养的CD34+细胞数量和集落密度仍与平面培养的扩增高峰相近。 结论：微囊化培养能有效扩增人脐血造血干/祖细胞,并显著减缓造血干/祖细胞的分化进程,维持其多分化潜能,提示微囊为造血干/祖细胞维持未分化状态的扩增提供了特殊的微环境。     

重症肌无力患者外周血单核细胞亚群的研究

本文用抗单核细胞亚群M_1、M_2、M_3的单克隆抗体检测了重症肌无力(MG)患者的外周血单核细胞亚群,并同时测定了患者血清乙酰胆碱受体(AchR)抗体。结果发现MG病人的M_1升高,M_3下降,在疾病缓解期又趋正常。作者推测单核细胞异常所导致的免疫调节障碍在MG发病中起重要作用。     

自动血细胞分析仪检测外周血造血祖细胞的方法学特点

背景：Sysmex XE-2100就是一种能通过幼稚细胞通道可以检测外周血中造血祖细胞较先进的全自动血细胞分析仪，由于该技术应用时间较短，临床上特别需要了解其检测造血祖细胞的方法学特点、检测性能及临床应用范围。 目的：评价全自动血细胞分析仪检测外周血造血祖细胞方法学的特点，并探讨其临床应用。 设计、时间及地点：对照观察实验，于2005-05/2006-10在中南大学湘雅二医院完成。 对象：异基因外周血造血干细胞移植的健康供者5人,男4人，女1人,年龄20~28岁。急性淋巴白血病患者与非急性淋巴白血病患者各5例，其中男6例，女4例，平均26岁。住院待产孕妇10例，平均27岁。 方法：采集动员前后健康供者、白血病患者外周血、采集物及孕妇脐血，采用Sysmex XE-2100全自动血细胞分析仪检测造血祖细胞，同时应用流式细胞仪检测CD34+细胞。 主要观察指标：①干细胞移植的健康供者和白血病患者动员后造血祖细胞和CD34+ 细胞的变化。②待产孕妇分娩时胎儿脐带血中造血祖细胞和CD34+ 细胞的比较。③高值、中值及低值样品中造血祖细胞检测的批内变异系数CV值。 结果：动员后，外周血、采集物与脐带血中造血祖细胞与CD34+ 细胞均呈良好直线相关性(r > 0.77)。高值、中值及低值样品中造血祖细胞检测的批内变异系数CV值均< 6.0%。在×106 L-1范围内计数造血祖细胞有极好的线性关系（r=0.995）。动员过程中，健康供者于第4天造血祖细胞与CD34+ 细胞明显上升，于第5天同时达到高峰，但造血祖细胞较CD34+ 细胞变化幅度更大；白血病患者造血祖细胞与CD34+ 细胞亦同时上升，同时达到高峰。 结论：Sysmex XE-2100全自动血细胞分析仪能快速高效地检测出外周血、脐血和采集物中造血祖细胞，对外周血造血干细胞最佳采集时机的快速判断、干细胞成功采集的预测和白血病患者造血功能恢复的观察等，具有良好的临床应用价值。     

Sca-1+造血干/祖细胞重建致死剂量辐射小鼠造血功能的作用**☆

背景：近年来,造血干细胞移植在国内外已广泛开展,移植的造血干细胞能否有效重建造血成为造血干细胞移植领域的研究热点问题之一。 目的：观察Sca-1+造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cell,Sca-1+HSC/HPC)对造血衰竭小鼠造血功能重建的作用。 方法：雌性C57BL/6受体鼠给予致死剂量60Coγ射线照射后分2组,对照组：输注无菌PBS;移植组：移植免疫磁性分选法分离纯化的同系雄性C57BL/6小鼠Sca-1+HSC/HPC;检测受体鼠生存时间;外周血白细胞、红细胞比容、血小板的变化;脾湿质量及脾集落数;PCR检测Y染色体(Sry基因)表达确定受体小鼠重建造血的细胞来源。 结果与结论：移植组受体鼠30 d存活率、白细胞、红细胞比容、血小板、脾湿质量及脾集落数均明显高于对照组(P < 0.05);Y染色体PCR分析,证实雌性受体小鼠重建造血的细胞来源于雄性供体。提示Sca-1+HSC/HPC移植后能重建造血衰竭小鼠造血功能。     

重症肌无力患者胸腺细胞及外周血淋巴细胞Fas表达研究

目的 探讨重症肌无力(MG)的发病机制。方法 采用流式细胞术(FCM)分别检测MG患者胸腺细胞、外周血淋巴细胞(PBL)及地塞米松培养胸腺细胞的Fas表达。结果 MG患者PBL CD4、CD8细胞Fas表达率(分别为49％，34％；39％，34％)与对照组(分别为58％，25％；49％,24％)相比差异无显著性；MG患者胸腺细胞Fas表达率(11．20％，6．13％)较对照组(6．15％，1．84％)明显增高；地塞米松培养组Fas表达率MG组、正常人组分别为11．54％、8．62％和7．08％、3．13％，与空白对照组(MG组、正常人组分别为11．36％、6．87％和7．22％、2．86％)相比差异无显著性。结论 MG患者PBI，CD4、CD8细胞Fas表达率无明显增高，可能与自身反应淋巴细胞Fas和PBL FasL结合，发生程序化死亡有关。MG患者胸腺细胞Fas表达增高，可能参与MG发病初制。     

重症肌无力患者外周血T淋巴细胞亚群凋亡的研究

目的探讨外周血T淋巴细胞亚群凋亡在重症肌无力(MG)免疫发病机制中的作用及临床意义。方法采用流式细胞术结合免疫荧光抗体法测定了45例MG患者和40例正常对照组外周血CD4~ T淋巴细胞、CD8~ T淋巴细胞百分数及其凋亡状况,并对24例MG患者在应用糖皮质激素治疗后外周血T淋巴细胞亚群凋亡状况进行了观察。结果MG患者组外周血CD8~ T淋巴细胞百分率较正常对照组明显降低,CD4~ /CD8~ 比值较正常对照组明显升高：MG患者组外周血CD4~ T淋巴细胞凋亡程度较正常对照组明显降低；MG患者外周血CD4~ T淋巴细胞凋亡程度与MG类型、预后密切相关：应用糖皮质激素治疗后MG患者外周血CD4~ T淋巴细胞凋亡程度明显增强。结论MG患者存在T淋巴细胞亚群的分布异常及CD4~ T淋巴细胞凋亡功能障碍,其凋亡程度可能与MG类型、预后密切相关,糖皮质激素对MG患者外周血CD4~ T淋巴细胞凋亡缺陷具有纠正作用。     

重症肌无力患者周围血中CD4+T淋巴细胞亚群的研究

目的研究ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞的功能亚群在重症肌无力（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａｇｒａｖｉｓ,ＭＧ）发病中的作用。方法采用免荧光双标记技术和流式细胞仪对３９例ＭＧ患者和１８例健康对照者周围血中ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞的两个亚群（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－）的百分率进行测定。结果ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋亚群的百分率在ＭＧ组和ＡＣｈＲＡｂ阳性组明显低于对照组和ＡＣｈＲＡｂ阴性组;而ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－细胞的百分率在ＭＧ组和ＡＣｈＲＡｂ阳性组显著高于对照组和ＡＣｈＲＡｂ阴性组。结论表明ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞的两个功能不同亚群在ＭＧ患者体内发生了异常改变,与ＡＣｈＲＡｂ的产生有关。     

No proinflammatory signature in CD34+ hematopoietic progenitor cells in multiple sclerosis patients

Autologous hematopoietic stem cell transplantation (aHSCT) has been used as a therapeutic approach in multiple sclerosis (MS). However, it is still unclear if the immune system that emerges from autologous CD34+ hematopoietic progenitor cells (HPC) of MS patients is pre-conditioned to re-develop the proinflammatory phenotype. The objective of this article is to compare the whole genome gene and microRNA expression signature in CD34+ HPC of MS patients and healthy donors (HD). CD34+ HPC were isolated from peripheral blood of eight MS patients and five HD and analyzed by whole genome gene expression and microRNA expression microarray. Among the differentially expressed genes (DEGs) only TNNT1 reached statistical significance (logFC=3.1, p<0.01). The microRNA expression was not significantly different between MS patients and HD. We did not find significant alterations of gene expression or microRNA profiles in CD34+ HPCs of MS patients. Our results support the use of aHSCT for treatment of MS.     

FoxP3+ CD4+ CD25+调节性T细胞在重症肌无力发病机制中的作用

目的 在细胞与分子水平检验重症肌无力(myasthenia gravis,MG)患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Tregs)的表达缺陷,探讨CD4+CD25+Tregs亚群异常与MG发病间的关系.方法 流式细胞技术检测21例MG患者(11例经胸腺切除)与20名健康对照者(healthy controls,HCs)外周血CD4+CD25+Tregs及FoxP3+CD4+CD25+Tregs含量,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-FQ-PCR)分析MG患者与HCs外周血CD4+CD25+Tregs中FoxP3 mRNA的表达.结果 MG患者外周血CD4+CD25+ Tregs占CD4+T细胞含量与HCs比较无统计学差异(P＞0.05).MG患者外周血FoxP3+CD4+CD25+ Tregs含量及FoxP3 mRNA表达量与HCs比较均显著性降低(P＜0.05);胸腺切除的MG患者与未经胸腺切除的MG患者外周血FoxP3+CD4+CD25+ Tregs含量及FoxP3mRNA表达量无统计学差异(P＞0.05).结论 MG患者外周血CD4+CD25+ Tregs数量正常,但其表面分子FoxP3的表达下调,这种CD4+CD25+ Tregs亚群的异常发现有助于深入阐明MG的免疫发病机制.     

Circulating CD4+CD8+ cells in myasthenia gravis: supplementary immunological parameter for long-term prognosis

Summary Twenty patients with myasthenia gravis (MG) were studied prospectively for up to 5 years after thymectomy, in order to clarify the relationships between disease severity, anti-acetylcholine receptor antibody (anti-AChR) titres, proportions of circulating CD4⁺CD8⁺ cells (CD4⁺CD8⁺ cell level) and major lymphocyte subsets. The CD4⁺CD8⁺ cell levels were closely related to the clinical change within 1 year after surgery in 8 patients who showed a preoperative elevation in the cell levels. This group of patients consisted of six thymomatous and two non-thymomatous patients; the latter were both negative for anti-AChR. The anti-AChR titres generally changed in parallel with the clinical state in 9 of the 16 patients who were followed up for more than a year after thymectomy, and the CD4⁺CD8⁺ cell levels were useful in predicting the clinical course in 6 of the above 9 patients and 3 other patients, including antibody-negative cases. The present study suggests that the CD4⁺CD8⁺ cell levels may serve as an indicator for long-term prognosis of MG.     

重症肌无力患者外周血CD+4 CDhigh25 T细胞及其动态观察

目的 研究重症肌无力(myasthenia gravis, MG)患者外周血CD+4 CDhigh25 T细胞的水平,以及各种治疗方法对其的影响.方法 应用四色流式细胞仪检测55例MG患者(治疗前)与33名健康对照外周血CD+4 CDhigh25 T细胞百分率,对其中26例MG患者进行了治疗前后的动态检测.结果 MG患者与健康对照外周血CD+4 CDhigh25 T细胞百分率分别为6.22%±3.37%与5.16%±1.87%,两者差异无统计学意义(P=0.061),而21例非手术治疗患者其外周血CD+4 CDhigh25 T细胞百分率的变化与病情评分的变化呈负相关(r=-0.563, P=0.008).结论 这种非手术治疗前后短期内的CD+4 CDhigh25 T细胞的变化情况可能与病情相关,但胸腺切除前阶段观察的情况有所不同.     

Cross-talk between CD4+ T-cells and neural stem/progenitor cells

Immune-neural interactions dictate both lesion formation and repair in multiple sclerosis (MS). MS pathogenesis is mediated by the interplay of invading immune cells, neurons, glia, and endogenous stores of neural stem/progenitor cells (NPCs). However, the signals important in this cross-talk are not well defined. We utilized a co-culture method and flow cytometric analysis capable of detecting outcomes for both cell types. Here we describe the effects of NPCs on three different CD4+ subtypes (Th1, Th2, and Th17) and vice versa. Utilizing lpr (Fas receptor-deficient) and gld (Fas ligand-deficient) NPC lines, we further define the role of Fas in this neuroimmune cross-talk. We show that only the Th1 subtype is capable of inducing NPC cell death, and this is independent of Fas activation. Conversely, NPCs specifically kill pro-inflammatory Th1 and Th17 cells in a contact-dependent manner without affecting Th2 survival. Further investigation into these effects revealed that FasL expressed by NPCs mediates Th17 apoptosis. Additionally NPC/T-cell cross-talk modulates FasL expression in both cell types, while Fas receptor levels remains static. These findings illuminate the direct neuropathogenic effects of T-cells, as well as help define the immunomodulatory capacity of NPCs. We have elucidated novel interactions that may be critical in MS pathogenesis.     

Mature, long-lived CD4+ and CD8+ T cells are generated by the thymoma in myasthenia gravis.

Antibodies to muscle acetylcholine receptors, to other muscle antigens, and to some cytokines are found in the majority of patients with thymic tumors (thymomas) and myasthenia gravis (MG). The role of the tumor in initiating autoimmunity, however, is unclear; in particular, it is not known whether the thymoma exports mature and long-lived T cells, which could provide help for antibody production in the periphery. Here, we quantified recently exported thymic T cells using the approach of measuring episomal DNA fragments [T-cell receptor excision circles (TRECs)], generated by T-cell receptor gene rearrangement. Compared to values in healthy individuals (n = 10) or in patients with late-onset MG (n = 8), TREC levels were significantly raised in both the CD4+ and CD8+ peripheral blood compartments of patients with thymoma and MG (n = 14, p = 0.002 and p = 0.0004 compared to healthy controls) but only in the CD8+ compartment of the three patients with thymoma without MG (p = 0.4 and p = 0.01 for CD4+ and CD8+). TREC levels decreased following thymectomy to values similar to controls but were substantially raised in patients who had developed tumor recurrence (n = 6, p = 0.04 and p = 0.02 for CD4+ and CD8+); this was associated with increased antibodies to interferon-alpha and interleukin-12 in the one case studied serially. Collectively, these results support the hypothesis that the neoplastic thymoma tissue itself can generate and export mature, long-lived T cells and that these T cells reflect the thymic pathology and are likely to be related to the associated autoimmune diseases. The results also provide a new approach for early diagnosis of thymoma recurrence.     

自体外周血造血干细胞移植治疗重症肌无力2例

目的：回顾性分析自体外周血造血干细胞移植治疗重症肌无力的效果。 方法：2005-08/2006-11安徽医科大学附属省立医院收治的2例重症肌无力患者，男女各1例，按美国重症肌无力协会新重症肌无力临床分型标准分别为IIIb型、IIIa型，初诊时分别合并有胸腺瘤及未分化结缔组织病，经服用拟胆碱药和多种免疫抑制剂均不能控制症状。移植前采用环磷酰胺+粒细胞集落刺激因子进行干细胞动员，在白细胞超过5×109 L-1时用血细胞分离机采集造血干细胞，加入冷冻保护液，置-196 ℃液氮中冻存备用。预处理方案为胸腺放疗+BuCy+ATG。移植当天，42 ℃水浴箱中快速复温冻存的造血干细胞，2例患者输入活的有核细胞数分别为1.32×108/kg和3.06×108/kg，输入活CD34+细胞数为2.57×106/kg和11.22×106/kg。 结果：2例患者均获得造血重建，都未出现肌无力危象，移植后1个月，在停用胆碱能受体激动剂后肌力正常。1例已随访30个月，不需服用药物，肌力仍正常；另1例移植后4个月，不服用药物肌力正常，移植后5个月死于间质性肺炎引起的呼吸衰竭。 结论：对于重症、药物治疗不佳的重症肌无力患者，自体外周血造血干细胞移植近期疗效显著，是治疗的重要选择，需严密观察并及时处理并发症。     

异基因造血干细胞移植中CD4+CD25+调节性T细胞与急性移植物抗宿主病的相关性

CD4+CD25+调节性T细胞是调节性T细胞的一个重要亚群,在诱导移植耐受方面起着重要作用。 目的：综述CD4+CD25+调节性T细胞的特性、免疫调节作用机制及其与急性移植物抗宿主病的相关性。 方法：应用计算机检索PubMed、Medline数据库1990-01/2010-02,维普数据库2000-01/2010-02以及运用Google网络数据库有关CD4+CD25+调节性T细胞及其他与急性移植物抗宿主病相关性研究的文献。 结果与结论：CD4+CD25+调节性T细胞在异基因造血干细胞移植后产生的急性移植物抗宿主病中起着重要作用,不仅能有效预防和治疗急性移植物抗宿主病,同时还能保留移植物抗白血病效应作用。随着研究的深入,发现CD4+CD25+调节性T细胞很有希望成为急性移植物抗宿主病早期风险预测的一项重要实验诊断指标,并且有可能通过调控移植后患者体内CD4+CD25+调节性T细胞水平来预防和控制急性移植物抗宿主病的发生。但是,要将CD4+CD25+调节性T细胞应用于临床尚有问题有待解决,例如CD4+CD25+调节性T细胞细胞表面特异性标志物是什么,如何提高CD4+CD25+调节性T细胞在人体内的活性以及怎样充分发挥其免疫抑制功能等。