浅谈皮肤间充质干细胞的培养与鉴定

目的：从人皮肤组织中成功分离培养出皮肤间充质干细胞（SMSCs）,并将其诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及血管内皮细胞。体外长期传代培养SMSCs仍保持良好的干细胞特性,这为SMSCs的深入研究与心血管系统细胞移植提供了新的细胞来源。方法：分离、培养SMSCs,传至第5代用流式细胞仪进行表面标志鉴定;取第5代细胞分别向脂肪、成骨细胞、软骨细胞及血管内皮细胞诱导分化。结果：倒置相差显微镜下细胞呈成纤维细胞状形态,细胞表面标记物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105呈高表达,而CD34、CD45和HLA-DR表达阴性。经诱导分化后,细胞均可分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和血管内皮细胞。结论：从人体皮肤组织中可成功分离、培养出SMSCs并能成功定向诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和血管内皮细胞,为细胞移植治疗心血管疾病提供新的原料来源。     

表皮干细胞的研究现况

皮肤是人体面积最大的器官，由表皮和真皮构成，借皮下组织与深层组织相连。皮肤与外界直接接触，能阻挡异物和病原体侵入，防止体液丢失，具有重要的屏障保护作用。皮肤是再生能力较强的组织，皮肤的最外层表皮，主要是由角质形成细胞组成。表皮的基底层由位于基底膜上的基底细胞组成，是表皮角质形成细胞的生发层。基底层的角质形成细胞经过棘细胞层和颗粒细胞层逐步分化成熟并不断从角质层的表面脱落，丢失的细胞由基底层的增殖细胞补充。     

骨髓基质干细胞移植于皮肤全层缺损创面的动物模型

目的 探讨建立适合骨髓基质干细胞移植于创面的动物模型,以研究骨髓基质干细胞在损伤修复中的作用机制.方法 分离、培养、鉴定骨髓基质干细胞;在大鼠背部形成-4 cm×4cm皮肤全层缺损创面;36只大鼠分3组(同种异体皮、脱细胞异种真皮、凡士林纱布)覆盖创面,将标记的P5代细胞移植于创面,观察覆盖物脱落时间、移植成活细胞数量.结果 同种异体皮作为创面覆盖物比其他两组覆盖物脱落时间延长、成活细胞数量多;而脱细胞异种真皮覆盖物组又优于凡士林纱布覆盖物组.结论 应用同种异体皮作为创面覆盖物能够较好地保护移植骨髓基质干细胞,成功构建一个创伤皮肤缺损模型用于研究骨髓基质干细胞的移植.     

表皮干细胞在成人及胎儿不同部位皮肤中的比较研究

目的 :检测表皮干细胞相对特异性分子角蛋白19(cytokeratin 19Ck19)及整合素 β1在胎儿及成人不同部位皮肤中的表达 ,以比较表皮干细胞在成人及胎儿皮肤中的差异 .方法 :免疫组化方法检测Ck19及整合素 β1,以及角朊细胞分化的特异标志分子角蛋白 10 (Ck10 )在成人及胎儿不同部位皮肤组织中的表达 ,并加以图像分析 .结果 :Ck10可见于所有标本的表皮基底层以上细胞中 ,在成人皮肤中表达层数比胎儿皮肤中多 ,且Ck10在成人皮肤及胎儿皮肤中表达差异不显著 ;Ck19在部分表皮基底层细胞及毛囊细胞中表达 ,β1整合素仅存在于基底层细胞及部分毛囊细胞 ,且胎儿皮肤中阳性细胞数目要比成人多 ,β1整合素表达阳性率在胎儿与成人皮肤中有显著差异 (P <0 .0 5 ) ;胎儿各组间比较 ,头皮组平均灰度值约为 113.9,与其他几组相比有显著性差异(P <0 .0 5 ) .结论 :表皮干细胞分布于人类皮肤的表皮基底层及部分毛囊细胞中 ,在胎儿皮肤中该细胞数量要比成人多 ,表明该类细胞随年龄逐渐减少的生物学改变 ,也反映了皮肤的生理性变化     

ES细胞源性表皮干细胞与胶原海绵构建组织工程皮肤

【目的】以胚胎干细胞(ES细胞)源性表皮干细胞为种子细胞与胶原海绵构建组织工程皮肤,探讨其对皮肤缺损修复的作用。【方法】胎鼠皮肤成纤维细胞与胶原海绵构建类真皮,植入小鼠全层皮肤缺损创面,以生物膜为载体,把羊膜诱导后带有核标记的ES细胞源性表皮干细胞覆盖在类真皮上,术后1～8周连续取材,HE染色,β1整合素、CK15、CK19、CK10和CEA免疫荧光双标和免疫组化观察。【结果】植入后3周,创面完全长合,较厚新生皮完全覆盖创面,基底层细胞增生,形成许多大小不一的细胞柱伸向真皮层,新生表皮中可见核标记的细胞呈β1整合素、CK15、CK19阳性,真皮中的管腔样结构呈核荧光和β1整合素、CEA免疫组化双标阳性,4～8周新生表皮基底层细胞呈CK19、CK10阳性,新生表皮下可见毛囊样、皮脂腺样结构。【结论】ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞与胶原海绵构建的组织工程皮肤可以修复缺损皮肤,在其下真皮层有分化为毛囊样、皮脂腺样和汗腺样的结构,但是是否来源于ES细胞源性表皮干细胞仍需进一步证实。     

ES细胞源性表皮干细胞与胶原海绵构建组织工程皮肤

【目的】以胚胎干细胞（ES细胞）源性表皮干细胞为种子细胞与胶原海绵构建组织工程皮肤，探讨其对皮肤缺损修复的作用。【方法】胎鼠皮肤成纤维细胞与胶原海绵构建类真皮，植入小鼠全层皮肤缺损创面。以生物膜为载体，把羊膜诱导后带有核标记的ES细胞源性表皮干细胞覆盖在类真皮上，术后1～8周连续取材，HE染色，B1整合素、CK15、CK19、CK10和CEA免疫荧光双标和免疫组化观察。【结果】植入后3周，创面完全长合。较厚新生皮完全覆盖创面，基底层细胞增生，形成许多大小不一的细胞柱伸向真皮层，新生表皮中可见核标记的细胞呈B1整合素、CK15、CK19阳性，真皮中的管腔样结构呈核荧光和β1整合素、CEA免疫组化双标阳性，4～8周新生表皮基底层细胞呈CK19、CK10阳性，新生表皮下可见毛囊样、皮脂腺样结构。【结论】ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞与胶原海绵构建的组织工程皮肤可以修复缺损皮肤，在其下真皮层有分化为毛囊样、皮脂腺样和汗腺样的结构，但是是否来源于ES细胞源性表皮干细胞仍需进一步证实。     

干细胞小知识

干细胞是人体的万能细胞，是脑、血、心、骨、肌肉及皮肤等组织与细胞的根源。胚胎干细胞来自成长数天的胚胎，并几乎能在身体内制造任何一种细胞。它们被称为多功能性干细胞。     

表皮干细胞及其在表皮损伤修复中的研究进展

皮肤覆盖于人体表面,是人体最大的器官,具有抵御微生物入侵、防止紫外线辐射及水分丢失、调节体温,维持外貌等重要功能。皮肤是由非同源性的细胞有序的排列而成,具有较强的再生能力。正常皮肤的自我更新及受损皮肤的修复是由多种类型的于细胞共同作用的结果,是维持正常的组织结构和细胞内环境稳定的基本要求。皮肤由表皮和真皮组成,     

以表皮干细胞与HaCaT细胞为种子细胞构建组织工程皮肤的比较研究

目的 比较人表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)与人永生化角质细胞HaCaT作为种子细胞构建组织工程皮肤的差异.方法 Ⅳ型胶原快速黏附法分选表皮干细胞,无血清培养基DK-SFM培养,取第2代备用;应用DK-SFM培养HacaT细胞,取对数生长期的细胞备用;利用组织工程技术构建真皮等价物(dermal equivalent);将上述备用的两种种子细胞分别接种在真皮替代物的表面,构建组织工程皮肤,先后进行浸没培养和气-液面器官型培养,从形态学、物理特性、HE染色等方面观察比较培养物的差异.结果 以ESCs构建的组织工程皮肤收缩快,分层分化近似于正常皮肤,具有较好的张力和韧性.以HaCaT细胞构建的组织工程皮肤分层少,生长慢,张力韧性较差.两种皮肤的直径都随培养时间的增加而缩短,且在3～7 d各检测时相点间有显著性差异(P＜0.05).结论 ESCs比永生化的HaCaT细胞更适合作为种子细胞构建组织工程皮肤.     

去细胞羊膜负载毛囊干细胞修复裸鼠全层皮肤缺损

目的利用去细胞羊膜负载毛囊干细胞修复裸鼠全层皮肤缺损。方法体外分离和培养人毛囊干细胞,取经慢病毒介导的绿色荧光蛋白（pGC FU-GFP-Lentiviru）标记后第4代毛囊干细胞接种于去细胞羊膜上;负载后第7天,HE染色光学显微镜观察细胞黏附生长情况。于18只C57BL/6裸鼠背部制作全层皮肤缺损创面,并根据不同的处理方式分为实验组（将负载毛囊干细胞的去细胞羊膜植入裸鼠全层皮肤缺损创面）、去细胞羊膜移植＋干细胞注射组（将去细胞羊膜覆盖创面后羊膜下注射5×106毛囊干细胞）和去细胞羊膜移植组（去细胞羊膜单独移植）,每组6只。分别于移植后第7、14、21、28天,测量各组创面面积并计算创面收缩率。移植后第28天,荧光显微镜观察创面组织绿色荧光蛋白（GFP）表达,HE染色光学显微镜观察新生皮肤结构特征。结果去细胞羊膜负载毛囊干细胞后第7天,HE染色光学显微镜观察发现,细胞连接成片状覆盖于去细胞羊膜表面。实验组和去细胞羊膜移植＋干细胞注射组移植后各时点的创面收缩率均显著小于去细胞羊膜移植组（P〈0.05）。移植后第28天,荧光显微镜观察显示实验组创面表皮层GFP表达阳性;HE染色光学显微镜观察发现实验组创面组织表皮层明显增厚,有类似毛囊样结构生成。结论去细胞羊膜负载毛囊干细胞可用于修复裸鼠全层皮肤缺损。     

皮肤成纤维细胞构建组织工程肌腱的实验研究

近年来，研究者们应用类似于骨髓基质干细胞的细胞作为组织工程肌腱的种子细胞，未获明显进展。皮肤成纤维细胞和肌腱细胞均来源于中胚层，细胞形态相似。如果成纤维细胞能取代肌腱细胞，作为种子细胞应用于肌腱组织工程则可望解决种子细胞缺乏的难题。作者曾应用成纤维细胞作为种子细胞修复肌腱缺损取得初步成功，但缺乏长期观察结果。本研究旨在长期观察皮肤成纤维细胞构建的组织工程肌腱，并与肌腱细胞作为种子细胞的组织工程肌腱进行比较。     

真皮间充质干细胞治疗皮肤缺损创面的研究进展

大面积深度烧伤、严重创伤及外科手术切除体表恶性组织等均会造成体表皮肤组织的广泛缺损。在目前的临床医疗手段治疗后,创面虽然愈合,但丧失了皮肤的正常结构和外观,严重影响患者的生存质量。近年来,组织工程化人工皮肤的构建和应用为临床的大面积皮肤缺损的修复治疗提供了新的途径和方法。组织工程化皮肤的关键技术之一是种子细胞的选择,目前研究较多的种子细胞有骨髓间充质干细胞、表皮干细胞和真皮间充质干细胞（dermis-delved mesenchymal stem cells,DMSC）。本文就真皮间充质干细胞治疗皮肤缺损的研究进展作一综述。     

大鼠表皮基底层干细胞体外分离与培养

目的建立简单、可靠的大鼠表皮基底层干细胞体外分离培养方法。方法取新生大鼠背部皮肤,采用胰酶两步消化法获得单细胞悬液,Ⅳ型胶原差速贴壁法富集干细胞,将慢黏附细胞作为对照组细胞,均以角质形成细胞无血清培养基培养。以β1-整合素和角蛋白19(K19)双重荧光染色鉴定细胞表型,克隆形成实验检测细胞体外增殖能力。结果分离培养的细胞为多角形、呈铺路石样排列,倍增时间约为24h,细胞形态和生长规律符合基底层干细胞的特征。免疫荧光鉴定显示细胞共表达β1-整合素和K19,基底层干细胞克隆形成能力显著强于对照细胞。结论两步消化联合Ⅳ型胶原差速贴壁法获取基底层干细胞简易可行,培养的细胞活力好、表型可靠。     

去细胞羊膜负载毛囊干细胞修复裸鼠全层皮肤缺损

目的 利用去细胞羊膜负载毛囊干细胞修复裸鼠全层皮肤缺损。方法 体外分离和培养人毛囊干细胞,取经慢病毒介导的绿色荧光蛋白（pGC FU-GFP-Lentiviru）标记后第4代毛囊干细胞接种于去细胞羊膜上;负载后第7天,HE染色光学显微镜观察细胞黏附生长情况。于18只C57BL/6裸鼠背部制作全层皮肤缺损创面,并根据不同的处理方式分为实验组（将负载毛囊干细胞的去细胞羊膜植入裸鼠全层皮肤缺损创面）、去细胞羊膜移植+干细胞注射组（将去细胞羊膜覆盖创面后羊膜下注射5×106毛囊干细胞）和去细胞羊膜移植组（去细胞羊膜单独移植）,每组6只。分别于移植后第7、14、21、28天,测量各组创面面积并计算创面收缩率。移植后第28天,荧光显微镜观察创面组织绿色荧光蛋白（GFP）表达,HE染色光学显微镜观察新生皮肤结构特征。结果 去细胞羊膜负载毛囊干细胞后第7天,HE染色光学显微镜观察发现,细胞连接成片状覆盖于去细胞羊膜表面。实验组和去细胞羊膜移植+干细胞注射组移植后各时点的创面收缩率均显著小于去细胞羊膜移植组（P<0.05）。移植后第28天,荧光显微镜观察显示实验组创面表皮层GFP表达阳性;HE染色光学显微镜观察发现实验组创面组织表皮层明显增厚,有类似毛囊样结构生成。结论 去细胞羊膜负载毛囊干细胞可用于修复裸鼠全层皮肤缺损。     

Hoechst 33342标记恒河猴皮肤干细胞向结膜上皮细胞分化

 [目的]探讨皮肤干细胞诱导分化为结膜上皮细胞,为组织工程结膜探索一种新型的种子细胞,为严重眼表疾病的治疗奠定基础。[方法]在体外培养纯化鉴定恒河猴皮肤干细胞,并用Hoechst 33342标记,标记后的皮肤干细胞与结膜上皮细胞进行Transwell非接触共培养10d,然后对诱导后的细胞用细胞免疫化学以及流式细胞术检测结膜上皮细胞的特异性表面标志,包括角蛋白4和粘蛋白4,同时检测细胞的Hoechst 33342表达情况。[结果]纯化后的皮肤干细胞比例接近90%。Hoechst 33342标记后的皮肤干细胞胞核显示蓝色荧光。在与结膜上皮细胞共培养10d后,皮肤干细胞显示结膜上皮细胞的标志粘蛋白4和角蛋白4阳性,流式细胞术检测阳性细胞比例分别为49.9%和95.6%,同时细胞还显示胞核的Hoechst 33342表达。[结论]灵长类动物恒河猴的皮肤干细胞,在体外的适宜条件下,可诱导分化为有结膜上皮细胞特征的细胞。     

Hoechst 33342标记恒河猴皮肤干细胞向结膜上皮细胞分化

[目的]探讨皮肤干细胞诱导分化为结膜上皮细胞,为组织工程结膜探索一种新型的种子细胞,为严重眼表疾病的治疗奠定基础。[方法]在体外培养纯化鉴定恒河猴皮肤干细胞,并用Hoechst 33342标记,标记后的皮肤干细胞与结膜上皮细胞进行Transwell非接触共培养10d,然后对诱导后的细胞用细胞免疫化学以及流式细胞术检测结膜上皮细胞的特异性表面标志,包括角蛋白4和粘蛋白4,同时检测细胞的Hoechst 33342表达情况。[结果]纯化后的皮肤干细胞比例接近90%。Hoechst 33342标记后的皮肤干细胞胞核显示蓝色荧光。在与结膜上皮细胞共培养10d后,皮肤干细胞显示结膜上皮细胞的标志粘蛋白4和角蛋白4阳性,流式细胞术检测阳性细胞比例分别为49.9%和95.6%,同时细胞还显示胞核的Hoechst 33342表达。[结论]灵长类动物恒河猴的皮肤干细胞,在体外的适宜条件下,可诱导分化为有结膜上皮细胞特征的细胞。     

急性肺损伤患者诱导性多能干细胞系的建立

目的利用急性肺损伤患者皮肤成纤维细胞构建诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）系。方法采用
慢病毒介导逆转录的方法,将含有Oct4、Sox2、Klf4和Nanog四个因子的混合慢病毒转染人皮肤成纤维细胞,诱导出胚胎干细胞
样克隆。根据人胚胎干细胞的特性,利用AP染色、实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术、免疫荧光、畸胎瘤形成实验对获得的iPS
细胞进行鉴定。结果获得的iPS细胞镜下观察呈典型的ES样克隆状生长,圆形或椭圆形,与饲养层细胞分界清楚;AP染色阳
性,RT-PCR及免疫荧光检测iPS细胞高表达人胚胎干细胞标志性基因及蛋白,移植到免疫缺陷鼠体内能够形成向三胚层分化的
畸胎瘤。结论成功建立了急性肺损伤患者iPS细胞系,可为急性肺损伤的发病机制研究和临床药物筛选提供良好的细胞模型。
     

ES细胞源表皮样干细胞与胶原海绵体外构建组织工程化皮肤

【目的】 探讨以ES细胞源表皮样干细胞构建组织工程皮肤的方法，为构建新的组织工程皮肤奠定基础。【方法】 先把成纤维细胞放置于胶原海绵真皮支架内，体外培养2d，再放置ES细胞源表皮样干细胞，体外培养3d，观察其形态和进行免疫组化检测。【结果】 成纤维细胞与ES细胞源表皮样干细胞均在真皮支架内黏附，免疫组化表明ES细胞源表皮样干细胞仍呈Bl整合素强阳性和CK15、CK19阳性。【结论】 结果提示ES细胞源表皮样干细胞在体外构建的组织工程化皮肤内仍维持未分化状态。     

皮肤源性前体细胞在神经再生中的应用

目的： 对目前关于皮肤源性前体细胞的起源,分化特点和在神经再生医学中的应用的研究作一综述。 数据来源：本综述中涉及的资料来源于从1974年至2012年发表于PubMed上的研究报道。 数据选择： 选择的资料与皮肤源性前体细胞,干细胞以及它们在神经再生医学中的应用相关。 结果： 皮肤源性前体细胞是一种新的神经嵴来源细胞前体细胞类型,它们起源于胚胎发生时期并维持至成年,体外培养可以分化为神经细胞谱系（神经元和神经胶质细胞）和中胚层细胞谱系（平滑肌细胞和脂肪细胞）。与其他干细胞相比,皮肤源性前体细胞在皮肤中含量丰富,可诱导分化为神经干细胞, 容易获取且不存在伦理争论。 结论：皮肤源性前体细胞有希望替代胚胎干细胞,成为用于细胞移植治疗神经病变的一种新型细胞来源。     

“皮肤干细胞”首次尝试用于医疗

美国科学家在《科学》杂志上报告说，他们利用从皮肤细胞改造而来的干细胞治疗老鼠的镰状细胞血症获得进展。这是科学界利用“皮肤干细胞”进行医疗研究的首次尝试。