B群脑膜炎奈瑟菌疫苗的研究进展

随着A、C、W135、Y群脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides,Nm)多糖疫苗和多糖-蛋白结合疫苗的接种使用,相应菌群引起的流行性脑膜炎的发病率和死亡率均得到有效控制,而B群等其他群别引起的流行性脑膜炎发病率有所增加。因B群Nm的荚膜多糖(Capsular polysaccharide,CPS)或多糖-蛋白结合物免疫原性均较低,目前采用常规方法尚未生产出有效的B群Nm疫苗。本文对B群Nm CPS疫苗、外膜囊泡(Out membrane vesicles,OMV)疫苗、脂寡糖(Lipooligosaccharide,LOS)疫苗和重组蛋白疫苗的研究进展作一综述。     

W135群脑膜炎球菌培养基优化

目的试验设计法优化W135群脑膜炎球菌培养基,以期提高荚膜多糖产量。方法配制流脑半综合培养基(1、2、3号)及改良TSB培养基,以W135群脑膜炎球菌为试验菌株,菌密度为响应值,采用全因子试验、最陡爬坡试验、中心组合设计及响应面分析试验对碳氮比进行优化,采用正交试验对硫酸镁、氯化钙、L-胱氨酸、氯化铵、谷氨酸钠、硫酸亚铁6种培养基添加成分进行筛选及优化。结果 1号流脑半综合培养基确定为基础培养基;葡萄糖及酸水解酪蛋白为影响菌密度的主效应因素,两者的最适浓度为7. 84和10. 04 g/L;培养基6种添加成分对W135群脑膜炎球菌生长影响作用大小依次为硫酸镁、L-胱氨酸、硫酸亚铁、氯化铵、氯化钙、谷氨酸钠。优化的1号流脑半综合培养基不仅成分更加简单,且提高了W135群脑膜炎球菌密度。结论优化的培养基增加了W135群脑膜炎球菌密度,为荚膜多糖产量的提高奠定了基础。     

W135群脑膜炎球菌结合物的制备及其在小鼠体内的免疫原性

目的比较不同活化试剂、不同载体蛋白质及不同免疫程序对W135群脑膜炎球菌结合物在小鼠体内的免疫原性的影响。方法分别采用溴化氰(CNBr)和1-氰基-4-二甲基氨基吡啶-四氟硼酸盐(CDAP)为活化试剂,以己二酸二酰肼(ADH)为连接臂制备W135群脑膜炎球菌多糖(group W135 meningococcal polysaccharide,PSW135)衍生物;以碳二亚胺(EDAC)作为缩合剂,将多糖衍生物分别与破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)、白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)和重组铜绿假单胞菌外毒素A(recombinant Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,r EPA)3种蛋白质共价结合,制备6种PSW135蛋白质结合物;比较4针免疫程序(0、2、4、8周)和3针免疫程序(0、4、8周)对结合物在小鼠体内免疫原性的影响。结果两种活化试剂均能对多糖进行有效活化,且不会破坏多糖的抗原性;制备的6种结合物在小鼠体内均能产生良好的免疫原性,且具有显著的剂次加强效应;采用间隔2周的3针免疫程序和2.5μg/只的免疫剂量,不同类型的活化试剂和载体蛋白质对结合物的免疫原性无显著影响,但以DT为载体蛋白质的结合物的免疫加强效应要弱于以TT和r EPA为载体的结合物;延长免疫间隔时间可显著提高结合物在小鼠体内的免疫原性。结论初步建立了适用于W135群脑膜炎球菌结合疫苗的结合工艺,并为结合物在小鼠体内的免疫原性研究提供了一种新的候选免疫程序。     

A、C、Y、W135群脑膜炎奈瑟菌血清抗体特异性体外杀菌试验方法的建立及其验证

目的建立A、C、W135和Y群脑膜炎奈瑟菌血清抗体特异性体外杀菌试验方法 (serum bactericidal assay,SBA),并进行验证。方法对SBA中活菌收获时间、靶菌的制备、反应时间及补体进行优化,并确定质控血清Men10的质控范围。对优化后的方法进行特异性、线性、精密度验证。结果确定A600值为0.5~0.8时为收获细菌最佳收获时间;冻存菌种可替代新鲜制备菌种作为靶菌;最佳杀菌反应时间为60 min;17830和84321N批补体均可用于试验。质控血清Men10的质控范围A群为521~4 689,C群为1 047~9 423,W135群为1 779~16 008,Y群为1 416~12 741。A、C、W135和Y同群多糖吸收血清样品后能够抑制≥80%的同群SBA滴度,而异群多糖则20%;血清样品稀释倍数与对应的SBA滴度呈显著负相关,斜率在-0.90~-1.10之间,Pearson相关系数在0.90~1.0之间,P均0.001;同一实验内相同样品检测结果 CV≤25%,实验间相同样品的95%的检测结果落在检测值中位数3倍(一个稀释度)的范围内,CV≤40%,不同实验室间相同样品的检测结果至少有70%落在美国CDC公布结果的3倍(一个稀释度)范围内。结论建立了标准化的具国际间可比性的A、C、W135和Y群脑膜炎奈瑟菌SBA,该方法特异性、线性和精密度良好。     

C群和W_(135)群脑膜炎球菌发酵工艺的优化

目的优化C群和W135群脑膜炎球菌的发酵工艺,提高荚膜多糖产量。方法在5L发酵罐中,通过调整溶氧(DO)、pH值、培养温度、葡萄糖补料速率等参数,了解C群和W135群脑膜炎球菌在发酵过程中的代谢规律,优化发酵工艺,并将C群脑膜炎球菌在100L发酵罐中放大发酵。结果在发酵过程中,DO在20%～40%范围内对多糖合成无明显影响;在pH6.6左右,培养温度37℃,有利于多糖合成;发酵中间补加葡萄糖可增加多糖合成,低速补糖较高速补糖更有利于多糖合成。C群脑膜炎球菌在100L罐中放大发酵,多糖产量可达5L罐水平。结论通过参数优化,确定了C群和W135群脑膜炎球菌的最佳发酵工艺。     

紫外-分光光度法测定A群脑膜炎球菌多糖含量的不确定度评估

目的对紫外-可见分光光度法测定A群脑膜炎球菌多糖含量的不确定度进行评估。方法根据测量过程,分析评估A群脑膜炎球菌多糖含量测定过程中的不确定度来源,计算各分量的不确定度,建立数学模型,计算出合成标准不确定度uc和扩展不确定度U。结果 A群脑膜炎球菌多糖含量测定的合成标准不确定度uc和扩展不确定度U分别为21和42μg/ml(k=2)。结论磷标准溶液的配制稀释是影响紫外-可见分光光度法测定A群脑膜炎球菌多糖含量不确定度的主要因素,可从此处着手改善方法。     

毛细管电泳法检测Y群和W135群脑膜炎球菌多糖结合物原液中游离载体蛋白含量

目的建立毛细管电泳法检测Y群和W135群脑膜炎球菌多糖结合物原液中游离载体蛋白破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)含量,并对方法进行验证及初步应用。方法采用胶束电动毛细管电泳法测定TT含量,使用内径50μm未涂层熔融石英毛细管柱(有效柱长为104 cm),以40 mmol/L硼酸盐-SDS缓冲液(p H 9.30)为电泳介质,电压为30 k V,在200 nm紫外波长条件下进行检测。对方法的专属性、线性、精密度、重复性、稳定性、准确性、定量限进行验证,并用建立的方法检测Y群和W135群脑膜炎球菌结合物原液各3批样品中的游离蛋白TT含量。结果该方法专属性、精密度、重复性、稳定性、准确性良好,TT在10~35μg/ml范围内与色谱峰相对内标峰面积比值呈良好的线性关系,r~2=0.995,游离蛋白的定量限为7μg/ml。用建立的方法检测Y群和W135群脑膜炎球菌结合物原液各3批样品中的游离蛋白TT含量均小于10μg/ml。结论建立的毛细管电泳法操作简便、准确,可用于检测Y群和W135群脑膜炎球菌多糖结合物原液中的游离蛋白含量。     

多重PCR法用于脑膜炎奈瑟菌血清群分群鉴定的适用性

目的应用多重PCR法鉴定脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis,Nm)A、B、C、W135、Y 5个血清群,验证在基因水平鉴定疫苗用菌种血清群的适用性,并与实验室经典细菌培养法和血清凝集试验进行比对。方法提取标准Nm血清群A、B、C、W135、Y的基因组DNA,针对5个血清群Nm荚膜多糖合成基因上的特异序列,应用多重PCR方法对目的片段进行扩增,根据PCR扩增产物的碱基片段大小不同区分这5个血清群;采用PCR方法鉴定7株Nm分离菌种的血清群;并与实验室传统细菌培养法和血清玻片凝集试验比对。结果多重PCR方法能够鉴定Nm,并同时完成血清分群鉴定。该方法特异性和灵敏度(最低检测限为基因组DNA 0.1 ng)均较高。7株Nm分离菌种PCR检测结果与实验室经典培养法和血清玻片凝集试验结果一致,其中1株为血清群A群,1株B群,2株C群,1株W135群,2株Y群。结论多重PCR方法对Nm检测的特异性和灵敏度均优于传统细菌培养法和血清玻片凝集试验,可同时检测Nm菌种的种特异基因和群特异基因,提高了分群鉴定的准确性。此外,试验结果客观,且可长期保存和追溯性查询,有利于疫苗用菌种的...     

不同信号肽对重组B群脑膜炎奈瑟菌H因子结合蛋白表达的影响

目的探讨不同信号肽对重组B群脑膜炎奈瑟菌H因子结合蛋白(factor H-binding protein,f HBP)表达的影响。方法运用PCR方法将B群脑膜炎奈瑟菌f HBP原始信号肽分别替换为大肠埃希菌主要外膜脂蛋白(major outer membrane lipoprotein,MLP)、脂蛋白-28(lipoprotein-28,LP)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)P4外膜蛋白信号肽,并将其分别连接至p ET-30a表达载体,转化入大肠埃希菌感受态细胞,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定蛋白表达水平。结果替换了P4、LP和MLP信号肽的重组B群脑膜炎奈瑟菌f HBP表达量较带原始信号肽的B群脑膜炎奈瑟菌f HBP相比,分别提高了2.68、1.94和2.91倍。结论替换MLP信号肽对重组B群脑膜炎奈瑟菌f HBP蛋白表达的影响最大,为提高B群脑膜炎奈瑟菌f HBP表达量的研究工作提供了新思路。     

薄层紫外分光光度法测定氟乐灵

一、实验部分1.定量波长及溶剂的确定选用一系列溶剂,在波长375纳米的紫外区,测定氟乐灵的溶剂吸收值,以正己烷、丙酮为好。氟乐灵以正己烷为溶剂,在375纳米处有最大特征吸收峰;以丙酮为溶剂在390纳米处有最大特征吸收峰。2.展开剂的选择为了更好地将氟乐灵和杂质分离,对不同     

离心光度法测定铜的研究

研究了铜（Ⅱ）－硫氰酸铜－结晶紫灵敏显色反应和离心光度法测定微量铜的分析条件。在λｍａｘ＝５９８ｎｍ处的表观摩尔吸光系数ε＝２．２４×１０５Ｌ·ｍｏｌ－１·ｃｍ－１，铜（Ⅱ）量在１．００～１４．０μｇ／１０ｍＬ范围内呈线性关系。方法简便，选择性好，用于化学试剂中微量铜的测定，结果满意。     

分光光度法测定甘氨酸钠的含量

本文采用分光光度法对甘氨酸钠的含量进行测定.考察了波长、pH值、显色剂用量、缓冲溶液用量、水浴温度以及水浴时间对测量的影响.在优化的条件下,线性范围为2.0～12.0μg·mL-1(r=0.99962),样品平均回收率为98.4%,相对标准偏差0.41%.     

催化光度法测定超痕量铅

本文在碱性介质plumbum(Ⅱ)中对H2O2氧化还原型酚酞显色反应的催化作用,建立了一个测定超痕量铅的高灵敏催化光度法。反应产物的最大吸收波长位于556nm。大多数常见离子不干扰,该法可用于测定水等试样中的超痕量铅。     

分光光度法测定化妆品中的甲醇

建立了一种1,2-萘醌-4-磺酸钠（NQS）分光光度法直接测定化妆品中甲醇的新方法。研究表明,在pH为13.00的KCl-NaOH缓冲溶液中,甲醇电离生成的甲氧离子（CH₃O^-）能够催化氢氧根离子（OH^-）与1,2-萘醌-4-磺酸钠反应形成橙红色的2-羟基-1,4-萘醌,其最大吸收波长为450nm。甲醇浓度在0.010mg/mL～4.000mg/mL范围内与吸光度呈现良好的线性关系。线性回归方程为A=0.0018+0.1714c（mg/mL）,相关系数为0.9998,检测限为0.005mg/mL。平均回收率在98.5%～105%。依本法取3份样品分别测7次,变异系数为2.5%～4.8%。该方法具有检出限低、快速、准确、灵敏度高以及经济实用等优点。     

可见光分光光度法测定头孢曲松钠

基于头孢曲松钠能被Fe3+氧化,Fe3+被还原为Fe2+,Fe2+与铁氰化钾生成可溶性普鲁士蓝,通过测定生成的普鲁士蓝在733nm处的吸光度,建立了测定头孢曲松钠的新方法。头孢曲松钠含量在0.11~7.20μg·m L-1范围内与吸光度呈良好线性关系,线性回归方程A=0.2717ρ(μg·m L-1)+0.0325,相关系数R=0.9992,表观摩尔系数ε=1.8×105L·(mol·cm)-1。测定了市售头孢曲松钠粉针剂的含量,平均回收率为100.5%,结果令人满意。     

Determination of individual tocopherols by derivative spectrophotometry

The second order derivative UV spectra of α-, β-, γ- and σ-tocopherols showed small differences that allowed development of a derivative spectrophotometric method for determining individual tocopherols in a mixture. The procedure consists of measuring the second derivative spectrum of the sample at four specified wavelengths and calculating each concentration by means of a method for multicomponent analysis that uses mixtures as standards. Vegetable oils and other fatty products usually require a previous clean-up process (under study) in order to remove interfering substances.     

直接分光光度法测定高铁酸盐的含量

采用直接分光光度法对高铁酸盐含量进行了研究,改进了高铁酸盐溶液的预处理方法,考察了影响高铁酸盐溶液稳定性和测定结果的主要因素,如高铁酸盐溶液的pH、溶剂和溶液温度等。结果表明,采用G4型玻璃砂芯漏斗过滤法对高铁酸盐溶液预处理后,用质量分数为2%的次氯酸钾溶液为稀释溶剂,当温度低于20 ℃时,在其最大吸收波长505 nm处测定,可以获得准确的测定结果。     

5-Br-PADAP分光光度法测定微量铁

研究了 Fe( ) - 5- Br- PADAP体系的反应条件 ,在 p H=5.5时 ,Fe( ) -5- Br- PADAP能形成稳定的紫红色配合物 ,可用于试样中微量铁的快速测定 ,方法选择性好 ,灵敏度高 ,在波长 555nm处测量 ,表观摩尔吸光系数为 7.9× 1 0 P4。