鳗弧菌(Vibrio anguillarum)对青蛤(Cyclina sinensis)的毒性及半致死浓度研究

利用不同浓度的鳗弧菌对青蛤进行了急性毒性实验,观察青蛤在菌液胁迫下的存活情况,进一步统计得到鳗弧菌对青蛤的半致死浓度。结果表明,青蛤在鳗弧菌液浓度OD600为1.0—2.2范围内,胁迫96h以内死亡率呈逐渐上升趋势,并且在OD600=2.2时所有受试个体全部死亡。在相同的胁迫时间内,受试个体死亡率与胁迫浓度均呈正相关。经SPSS16.0软件分析后,最终得到鳗弧菌对青蛤的半致死浓度(LC50)为OD600=1.57,说明鳗弧菌对青蛤有明显的毒害作用。     

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)核酸适配体筛选中高频序列的进化多样性研究

核酸适配体是采用分子进化技术从随机寡核苷酸文库中筛选得到的对靶目标有较高亲和力的寡核苷酸序列。研究核酸适配体筛选过程中高频序列的进化多样性,对于提高筛选效率,掌握核酸适配体的进化规律具有重要意义。利用Margalef丰富度指数、Shannon-Wiener多样性指数、Pielou均匀度指数、Berger-Parker优势度指数,研究了鳗弧菌(Vibrio anguillarum)核酸适配体筛选产物中高频序列的进化多样性,结果表明,随着筛选进行,高频序列的种类数、丰富度、多样性、优势度和均匀度在前六轮都呈现较为剧烈的波动,之后种类数、丰富度、多样性、优势度呈现逐步增加的趋势,而均匀度则呈逐步下降的趋势,说明竞争力强的序列在筛选竞争中逐渐占据优势,其种类数量不断增加;利用相对重要性指数(IRI)对高频序列进行了计算分析,根据IRI值可将高频序列分为5类:优势序列,重要序列,常见序列,一般序列和少见序列,其中前三种序列是筛选进化中的相对优势种群;最后对IRI较高的7种核酸适配体进行了二级结构预测,结果显示其二级结构中存在着大小、数量不等的环状结构,这些环的大小数量可能与其结合位点相关。相关研究结果对于鳗弧菌的病害防控及核酸适配体的筛选都具有重要意义。     

环境因子对鳗弧菌生长和胞外蛋白酶表达的影响

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是一种水产动物的重要致病菌,鳗弧菌分泌的胞外蛋白酶是该菌的致病因子之一.研究了环境因子对鳗弧菌W-1生长及胞外蛋白酶表达的影响.结果表明,鳗弧菌的最适生长温度为28℃,菌体生长量在21 h达到最高,胞外蛋白酶的活力在24 h最高.在37℃培养时,菌体生长和酶活力显著降低;添加葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等碳源物质均能显著促进菌体的生长,但对于胞外蛋白酶表达有明显抑制作用;1 mmol/L EGTA对茵体的生长和胞外蛋白酶表达没有明显影响,而1 mmol/L的EDTA强烈抑制鳗弧菌的生长及其胞外蛋白酶的表达.添加不同浓度的氨苄青霉素对菌体的生长及其胞外蛋白酶表达有明显的抑制作用.     

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)侵染对青蛤(Cyclina sinensis)谷胱甘肽硫转移酶及其基因表达的影响

在鳗弧菌胁迫下测定了青蛤血清及肝脏谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)活力,利用SMART cDNA文库和高通量测序方法,筛选到青蛤σ型谷胱甘肽硫转移酶基因(CsGSTS)的全长。采用荧光定量PCR法分析CsGSTS基因的表达过程。结果表明,青蛤的CsGSTS基因cDNA全长793bp,编码206个氨基酸,具典型的GST-N和GST-C结构域。血清中的GSTs活力在感染后6—24h显著升高(P<0.01),肝脏GSTs活力在6—12h显著下降(P<0.05),48—96h又明显上调(P<0.01);肝脏CsGSTS基因表达水平在胁迫后3—6h降低,24h显著升高,48h达到最大值,约为对照组的3倍。说明谷胱甘肽硫转移酶及其基因表达参与了青蛤的免疫应答反应。该研究为探索贝类的抗病害免疫机制提供了重要的实验数据。     

Hfq对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)毒力的调控分析

为探讨分子伴侣Hfq对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)毒力的调控作用,本文分析了溶藻弧菌ZJ-T野生株、hfq突变株及回补株各项与毒力相关的生理生化指标。研究结果显示:在半固体和固体LBS平板中,缺失株游动和涌动能力显著降低(P0.001);hfq缺失株生物膜合成速度及合成量降低,但解离速度增加;在限铁环境下,缺失株生长有所减弱;缺失株胞外蛋白酶分泌增强(P0.01);同野生株和突变株相比,缺失株对小鼠成肌细胞系C2C12细胞几乎不致死,且其对石斑鱼的半数致死量提高3个数量级。实验结果表明:Hfq对溶藻弧菌毒力具有重要调控作用,并通过调控其运动、生物膜形成、铁代谢、胞外蛋白酶分泌等生理生化过程从而调控其毒力。本研究可为溶藻弧菌病害暴发的防治提供重要理论依据。     

香鱼(Plecoglossus altivelis)CC型趋化因子受体3(CCR3)基因的分子鉴定及其对鳗弧菌感染响应的研究

CC趋化因子受体3（CCR3）是CC型趋化因子的受体,属于G蛋白耦联受体（GPCRs）家族成员,与过敏等多种炎性疾病密切相关。为探讨香鱼CCR3（PaCCR3）在响应鳗弧菌感染时的表达变化,从转录组测序数据中获得了PaCCR3基因全长cDNA序列。序列分析表明,PaCCR3具有7次跨膜结构,与胡瓜鱼CCR3氨基酸序列同源性最高（84.6%）。系统进化树分析表明,哺乳类、两栖类和鱼类CCR3单独成簇,鱼类CCR3形成一个大簇;PaCCR3与胡瓜鱼CCR3进化相关性最高。实时荧光定量PCR结果显示,PaCCR3基因mRNA在单核/巨噬细胞（MO/MФ）中表达量最高;鳗弧菌感染后肝、脾和头肾中PaCCR3基因mRNA表达量显著上调;且香鱼MO/MФ经鳗弧菌体外刺激后,PaCCR3基因mRNA的表达量显著上调。Western blot分析表明经鳗弧菌体外刺激后,香鱼MO/MФ中PaCCR3蛋白的表达量也显著增加。综上,PaCCR3基因mRNA及其编码蛋白响应于病原体感染而被诱导表达。研究结果首次揭示了香鱼CCR3基因mRNA及蛋白的表达响应于鳗弧菌侵染,它可能通过介导MO/MФ的功能活性参与免疫应答,可为深入探究鱼类CCR3的功能及作用机制提供新的切入点。     

不同条件下哈维氏弧菌(Vibrio harvey)对墨吉明对虾(Fenneropenaeus merguiensis)致病性研究

为研究墨吉明对虾弧菌病的防控方法, 本文通过人工注射感染的方式, 研究不同数量哈维 氏弧菌及在不同温度、盐度、pH、不同硝酸氮、亚硝酸氮和氨氮浓度条件下哈维氏弧菌对墨吉明对 虾的致病性的影响。结果表明: 当人工感染哈维氏弧菌数量为3.16×10⁸ CFU 时, 24 h 内对虾累计死 亡率为96.67%; 哈维氏弧菌数量为3.16×10⁶ CFU 以上, 实验结束时, 对虾累计死亡率都超过了 50.00%.在20-32℃ 范围内, 随着温度升高哈维氏弧菌致病力增强, 并且低温组(20℃ 实验组与 26℃ 实验组)对虾累计死亡率显著低于高温组(32℃ 实验组)(P<0.05).在温度为(24±1)℃ 时, 盐度为 20 时对虾累计死亡率处于较低水平; 在温度为(24±1)℃, 盐度为(22±1)时, 96 h, pH 为8.0 时对虾 累计死亡率最低, 并且与另外两个实验组差异显著(P<0.05); 温度为(24±1)℃, 盐度为(22±1), 硝 酸氮对感染哈维氏弧菌的墨吉明对虾有胁迫作用; 在亚硝酸氮浓度(1.0-10.0 mg/L)、氨氮浓度 (0.5-1.5 mg/L)范围内, 哈维氏弧菌对墨吉明对虾的致病性, 随着浓度升高而增强。本实验为墨吉明 对虾弧菌病的防控提供了理论基础。     

短蛸(Octopus ocellatus)过氧化物还原酶(OoPrx-4)基因的克隆及其对鳗弧菌胁迫的转录调控分析

从本研究前期构建的短蛸(Octopus ocellatus)cDNA文库中克隆得到过氧化物还原酶(OoPrx-4)基因的cDNA全长,该基因cDNA全长934bp,包括5′非编码区(UTR)19bp,3′UTR177bp,开放阅读框(ORF)738bp,共编码245个氨基酸,理论等电点为6.65,预测分子量27.1kDa。采用实时荧光定量PCR法分析了OoPrx-4基因在短蛸各组织及鳗弧菌胁迫下的表达规律,结果表明,OoPrx-4在短蛸血细胞、肌肉、系统心脏、鳃、胃、肾囊、性腺、外套膜和肝胰腺等检测组织中都有表达,其中在肝胰腺的表达量最高。经鳗弧菌刺激后,Prx-4在血细胞中的表达量分别在6h和48h出现了两次明显上调。Prx-4作为抗氧化酶可能在减少机体因抵御鳗弧菌胁迫所产生的过氧化物方面发挥重要的作用。     

环境因子对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)粘附大黄鱼(Pseudosciaena crocea)表皮粘液影响的研究

采用3H-TdR同位素示踪方法研究了环境因子对溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液粘附作用的影响。试验结果表明,溶藻弧菌能很好地粘附于大黄鱼表皮粘液,其粘附量在菌浓度不超过6.52×108cfu/ml情况下随菌浓度的升高而升高;粘附量在25℃下孵育180min趋于饱和,在180min以内与孵育时间呈正相关关系;粘附作用在温度25—30℃、pH值偏酸、盐度35条件下较强;在无Na (盐度为0)时,无粘附作用;Ca2 能显著加强溶藻弧菌的粘附作用,而Mg2 作用不明显。这些结果表明,溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液有较强的粘附作用,其粘附作用受温度、盐度、pH值等环境因子的影响。     

海产品中蛋白酶产生菌的选育及产酶条件研究

从海产品虾和蟹中分离出蛋白酶产生菌共37株，其中YM007菌株蛋白酶生产活力较高，为194．6U／mL。以YM007为出发菌株，通过物理和化学方法复合诱变，获得了YM079号菌株。对其产酶条件的研究结果表明：它的最适产酶温度为35℃，最适生长pH为7．0，经过190r／min摇床培养36～40h，其产酶活力为240U／mL，比出发菌株的产酶活力提高了22％。该菌株经发酵的粗酶液最适作用pH为7．0，最适作用温度是45℃，是一种中温型中性蛋白酶。     

浮游植物密度和池水透明度对中国对虾增长速率的影响

1991年6月20日～9月11日,于大连市营城子镇东小磨对虾养殖场3号虾池采水样,固定后,检测浮游植物数量,同时测定透明度和对虾体长。实验结果见图1、图2,表1。结果表明,浮游植物密度、池水透明度和对虾体长增长速率三者之间有着密切的相互关系。     

褐菖鲉仔、稚鱼生长特性及其关键变态期的研究

根据1991～1994年间褐菖YouSebastiscus marmoratus人工苗种培育中仔、稚鱼生物学测定资料及其关键变态期出现时间、特征等资料，研究了日龄与褐菖You仔、稚鱼生长参数间的相互关系，分析了褐菖You仔、稚鱼阶段的关键变态期的出现规律及其生长参数间的关系，探讨了褐褐菖You仔、稚鱼关键变态期的发生机理及其应对措施。     

海水养殖真鲷弧菌病病原菌外毒素的分离、纯化及生物学活性

1996年6月初，对福建省平潭县真鲷网箱养殖场发生的弧菌病进行研究，并确定该病病原菌为最小弧菌（Vibrio mimicus）。采用硫酸铵沉淀、DEAE－纤维素层析及Sephadex-G100层析等方法对最小弧菌产生的外毒素进行研究。结果表明，该外毒素为单一的多肽，分子量为30．456kD，对真鲷的LD50为4．48μg，对真鲷等养殖动物的溶血性最强，对Vero细胞的CD50值为0．48μg，肠毒性弱阳性。该外毒素与最小弧菌产生的其他毒力因子相比，性质独特，是一类新的毒力因子，建议命名为Vm-Pm毒素。     

维生素C对点带石斑鱼(Epinephelus coioides)生长及组织中维生素C积累量的影响

采用单因素实验设计方法 ,进行了饲料中添加维生素C对点带石斑鱼生长和组织中维生素C积累量影响的研究 ,设计了 6个不同维生素C水平 ( 0、35、70、1 40、2 80、70 0mg/kg)的等氮等能饲料 ,对石斑鱼幼鱼进行为期 8周的生长实验 ,每个水平三个重复 ,每个养殖单元放养初始体重为 1 0g左右的点带石斑鱼幼鱼 2 0尾。饲养实验在海水网箱 ( 1 .5m× 1m× 2 .0m)中进行。结果表明 ,饲料中未添加维生素C组的增重率、特定生长率以及存活率显著低于维生素C添加组 ,饲料中添加维生素C的浓度为 70mg/kg组的增重率和特定生长率最高。对鱼体生物学指标的分析表明 ,饲料中添加维生素C并不影响鱼体的肥满度和内脏比指数 ,却显著影响肝体比指数。鱼体水分、蛋白质和灰分含量不受饲料中维生素C添加水平的影响 ,然而对鱼体脂肪含量的影响显著。随着饲料中维生素C添加水平的提高 ,石斑鱼肌肉和肝脏中维生素C的积累量显著升高。以增重率和特定生长率为指标 ,点带石斑鱼维生素C的适宜需要量为70mg/kg。     

半胱胺盐酸盐(CSH)对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)生长及生长轴相关基因表达的影响

为了分析半胱胺盐酸盐(CSH)对尼罗罗非鱼生长调节的作用,设计了长期和短期2个实验,采用腹腔注射(剂量100μg/g体重)方法,分析CSH对尼罗罗非鱼绝对生长率、特定生长率、肝体系数和肥满度的影响,并应用荧光实时定量PCR方法检测在注射CSH后不同时段(6h,12h,24h,2周)尼罗罗非鱼垂体GH、肝脏GHR和肝脏IGF-I基因的表达变化。结果表明,CSH组尼罗罗非鱼的绝对生长率、特定生长率、肝体系数、肥满度均显著高于对照组(P0.05);注射CSH后12h、24h垂体GH和肝脏GHRmRNA表达水平均显著升高(P0.05),2周后恢复到对照组水平;注射CSH后6h肝脏IGF-ImRNA表达水平显著升高(P0.05),12h恢复到对照组水平,24h和2周表达水平极显著上升(P0.01)。以上结果提示,CSH可显著上调尼罗罗非鱼生长轴相关基因的表达,从而促进鱼类的生长。     

淀山湖主要放流鱼种鲢和鳙生长的研究

本文根据2006-2008年淀山湖鲢鳙标记回捕数据以及刺网调查数据,研究了淀山湖鲢鳙的生长,根据鱼类体长推算公式分别推算出鲢鳙的生长指标;并计算出淀山湖鲢鳙的体长体重关系和肥满度.体长和体重关系分别为鲢:W=6×10-5 L2.8371,(n=216,R2=0.8886);鳙:W=5×10-5L2.5609,(n=55...     

细胞穿膜肽转导大型海藻及对其光合作用的影响

细胞穿膜肽能够介导外源物质进入细胞,是一种简单高效的分子运输手段。传统的大型海藻外源物质转导方法较为复杂,并且效率偏低。目前尚没有将细胞穿膜肽应用于大型海藻的报道。本实验利用细胞穿膜肽九聚精氨酸(R9)对浒苔、紫菜和海带这三种常见的大型海藻进行转入,观察其转导效果,并测定转导后藻体光合作用效率的变化。实验结果表明,细胞穿膜肽R9能够成功的转入三种大型海藻,转入的效率与藻体细胞壁结构有一定联系;转导后藻体的Fv/Fm、ETR(I)和ETR(II)没有明显变化,说明R9对大型海藻的光合作用没有负面影响。本实验建立了一种新型的大型海藻外源物质转导方法,为今后的大型海藻育种,分子转化以及外源物质转入机制等研究奠定了基础。     

温度、光照和pH之间的相互关系对光合细菌生长的影响

我们于1996年3月至8月，在光合细菌培养期间，对光合细菌培养条件的最适温度、光照和pH进行较系统的研究与观察，发现了温度、光照和pH值同时影响着光合细菌的生长。而且温度、光照、pH值之间是相互制约的，温度与光照的强弱应是对立统一的。总结出光合细菌生长的最适条件应是互应的。经试验得出光合细菌生长的最适条件：（1）温度为15—20℃，光照度为30000—5000Lx，培养基pH为7．0。（2）温度为25—30℃时，光照为3000—500LX，其培养基pH为7．0。     

不同类型含磷营养物质对微小亚历山大藻(Alexandrium minutum)生长和毒素产生的影响

采用显微镜细胞计数和麻痹性贝毒的高效液相色谱分析方法,通过对比磷酸二氢钾、磷酸甘油和三磷酸腺苷（ATP）等含磷营养物质对微小亚历山大藻生长和毒素产生的影响,研究了微小亚历山大藻对不同类型含磷营养物质的利用情况.结果表明,在磷限制条件下,加入磷酸二氢钾、磷酸甘油和ATP均能促进微小亚历山大藻的生长,所获得的最大藻细胞密度分别为22700、28400和27800藻细胞/ml,对数期生长速率分别为0.12/d、0.14/d和0.15/d,溶解态有机磷对藻生长的促进作用稍好于溶解态无机磷.三种含磷营养物质对毒素产生的效应没有明显差别,稳定期藻细胞毒素含量分别为22.87、23.98和21.80fmol/cell.磷限制对毒素组成的影响很大,磷限制条件下膝沟藻毒素GTX1/4的含量占绝对优势,GTX2/3含量很少.在添加含磷营养物质后,GTX1/4所占比例降低,GTX2/3比例增加,说明磷限制显著改变了微小亚历山大藻的毒素组成.对藻体碱性磷酸酶活性分析的结果显示,磷限制组具有最高的碱性磷酸酶活性,添加有机磷化合物实验组的碱性磷酸酶活性显著高于添加无机磷化合物的实验组.研究结果表明,微小亚历山大藻可以利用实验中采用的无机磷化合物和有机磷化合物,但其利用溶解态有机磷化合物的机制尚不清楚,可能是通过诱导合成碱性磷酸酶来水解培养基中的溶解态含磷有机物,从而释放无机磷酸盐用于藻细胞的生长.