广西眼镜王蛇毒一种碱性蛋白的分离纯化及性质研究

目的:广西眼镜王蛇毒一种碱性蛋白的分离纯化和性质研究.方法:分离纯化采用DEAE-Sepharose CL-6B离子交换柱层析,Sephadex G-75凝胶过滤和CM-Sepharose CL-6B离子交换柱层析;通过电泳,磷脂酶A2(PLA2)酶活力测定,氨基酸组成分析,N端序列测定及药理实验进行性质研究.结果:从广西眼镜王蛇毒中分离到一种电泳纯的碱性蛋白(命名为CM-IV),相对分子质量约为14 000,等电点约为8.65;PLA2的比活力为23 μmol·mg-1/min.氨基酸组成分析表明,其分子中Cys的含量占6.85%;利用蛋白质直接测序N端序列为TKCYVTPDVK.药理实验表明它对实验用小白鼠有致死性(LD50约为0.2 mg/kg),并具有心脏毒性,但无血小板抑制活性.根据Genebank Blast 分析软件,它的N端序列与神经毒素具有高度的同源性.结论:这种碱性蛋白可能为神经毒素,但却拥有PLA2的活力.     

福建产舟山眼镜蛇毒细胞毒素的快速分离纯化及鉴定

目的 从舟山眼镜蛇毒中分离纯化细胞毒素(CTX)，并鉴定其理化性质。方法 采用SP—Sephadex C-25阳离子交换色谱及Sephasil Peptide C18反相高效液相色谱法从舟山眼镜蛇毒中分离纯化CTX，SDS—PAGE(Tris—Tricine系统)鉴定纯度，Edman降解法测定N端氨基酸序列。结果 粗毒经阳离子交换色谱，得到14个蛋白峰，其中第X～XⅢ峰具CTX活性；再分别经反相色谱纯化，得到4个CTX．总得率为32.48％；SDS—PAGE显示为均一蛋白，分子量依次为：7．28，7．33，7．24和7．38kD；测定它们N端20个氨基酸序列。结论 采用阳离子交换和反相高效液相色谱可快速、高效地从眼镜蛇毒中获得4个CTX纯品。     

长白山白眉蝮蛇毒类凝血酶的分离纯化

目的 建立一种分离纯化长白山白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的方法.方法 将长白山白眉蝮蛇蛇毒溶解后离心,取上清进行阴离子交换层析,所得蛋白进行分子筛层析.提纯的蛋白用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定及相对分子量测定.测定酶的N-末端氨基酸序列.结果 经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳呈单一区带,相对分子量为35.5kDa.N-末端氨基酸序列分析表明其N-末端氨基酸序列与立止血中巴曲酶N-末端氨基酸序列基本一致.提取率约为5mg类凝血酶/g蛇毒.结论 用上述方法可制得高纯度的类凝血酶.     

广西眼镜王蛇毒酸性磷脂酶A2的分离纯化和性质研究

目的广西眼镜王蛇毒酸性磷脂酶A2的分离纯化和性质研究.方法分离纯化采用SephadexG-75,CM-SepharoseCL-6B和DEAE-SephadexA-50柱层析法;通过电泳,磷脂酶A2活力测定,氨基酸组成测定,N端序列分析及药理实验进行性质研究.结果从广西眼镜王蛇毒中分离到一种酸性的磷脂酶A2(命名为APLA2-1),相对分子质量为14600u,等电点5.4,酶的比活力为108μmol/mg*min-1,N端序列为NLIQFGNMIQCTVPGF.它对实验用小白鼠有致死性(LD506.6mg/kg),具有肌毒性,心脏毒性,抗血小板聚集活性,能诱导水肿形成.结论APLA2-1生化和药理性质的研究,为阐明蛇毒PLA2结构和功能关系,及蛇伤中毒机制,打下了良好基础.     

广西眼镜蛇毒细胞毒素对人卵巢癌细胞和宫颈癌细胞的抑制作用研究

目的：研究广西眼镜蛇毒细胞毒不对体外培养的人卵巢癌细胞和宫颈癌细胞株的抑制作用。方法：通过SephadexG-50,GM-Sepharose,CL-6B柱层析从广西眼镜蛇毒中分离纯化细胞毒素,应用四素氮唑蓝（MTT）法测定其对人卵巢癌细胞和宫颈癌细胞株的体外细胞毒作用及其最效关系,并与粗毒的抑瘤作用进行比较,结果：从广西眼镜蛇毒中分离到一种细胞毒素（CTX CM－5）,其对体外培养的人卵巢癌细胞和宫颈癌细胞株的抑制作用呈明显的剂量依赖关系。抑制率随剂是增加而呈迅速上升培养的人卵巢 细胞和宫颈癌细胞株具有较强的抑制作用。     

舟山眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶的分离纯化、理化及酶学性质

目的 从舟山眼镜蛇蛇毒中分离L-氨基酸氧化酶(LAO),测定其理化和酶学性质.方法 应用Sephadex G-100凝胶色谱和POROS CM20离子交换色谱分离纯化LAO;Wellner和Lichtenberg法测定LAO活力,SDS-PAGE法测定相对分子质量.结果 舟山眼镜蛇蛇毒经Sephadex G-100凝胶色谱和两次POROS 20离子交换色谱后,获得LAO纯品(暂定名NA-LAO).NA-LAO在非还原和还原条件下相对分子质量均为58 kD左右;其反应最适pH为8.0,最适温度为60℃,对L-苯丙氨酸的米氏常数(Km)为3.08 mmoL/L.结论 应用凝胶过滤色谱和离子交换色谱可从舟山眼镜蛇毒中分离纯化LAO.     

中华眼镜蛇蛇毒磷脂酶A2的提纯

目的:探索从中华眼镜蛇蛇毒中快速分离提纯磷脂酶A2(PLA2)的方法方法:应用ARG-CY仿生配基,用亲和层析一步法从中华眼镜蛇蛇毒粗毒中纯化PLA2,用SDS-PAGE进行纯度鉴定及相对分子质量测定,并测定其溶血活性.结果:纯化后获得的PLA2电泳图谱呈单一区带,相对分子质量为14 000,活性为182 μmol/(min·mg).产物具有溶血活性.结论:仿生亲和层析法提纯LPA2操作简单,纯度高,为一高效实用的方法.     

蝰蛇（缅甸亚种）毒凝血因子X激活物FⅤe-1的分离纯化的研究

 目的：从蝰蛇（缅甸亚种）毒分离纯化一种凝血活性因子X激活物FⅤe-1,并研究其理化性质,序列测定以及凝血活性。方法：应用CM-Sephadex C-50阳离子交换层析,SuperdexTM G-75分子凝胶过滤层析分离纯化蛇毒,采用MALDI质谱测定法测定分子量,等电聚焦电泳测定等电点,Edman降解法测定蛋白N末端氨基酸序列,以发色底物法和SDS-PAGE测定FⅡaa的酶学特征和凝血活性。结果：从蝰蛇（缅甸亚种）毒分离得到的凝血活性因子X激活物FⅤe-1为单体蛋白,相对分子量为13 808.171,酶活性的适宜pH为 6.5-7.5,适宜温度为25-60℃,为钙依赖性,金属蛋白酶,FⅤe-1的N端序列为NH2-N-L-Y-Q-F-G-E-M-I-N。具有呈剂量依赖性的促血浆凝固作用。结论：此方法成功的从蝰蛇（缅甸亚种）毒纯化出一种凝血活性因子X激活物FⅤe-1,具有较好的稳定性,分子量小,分子结构简单,具有较强的凝血作用。     

H_(22)腹水型肝癌患鼠血清中一种高分子量DNA结合蛋白的分离

本实验室曾从艾氏腹水癌患鼠血清和腹水DNA结合蛋白(DBP)中分离纯化出一种高分子量DNA结合蛋白(简称HDBP)。经2-巯基乙醇还原后,用SDS-PAGE测得其分子量为41000,为了研究这种HDBP在患其与类型肿瘤的小鼠血清中是否也存在,我们采用同样的方法从H_(22)腹水型肝癌患鼠血清中,分离纯化出一种分子量较高的DBP,并对其进行了初步鉴定。     

舟山眼镜蛇毒蕈碱样多肽的分离及其对M胆碱受体的激动效应

目的 从舟山眼镜蛇Naja atra蛇毒中分离毒蕈碱样多肽,探讨其与M胆碱受体的关系.方法 应用分子筛凝胶Sephadex G-50、Sephadex G-100、离子交换凝胶CM-Sepharose F.F.分离纯化目的组分;SDS-PAGE鉴定目的蛋白的纯度并测定其相对分子质量;放射受体分析法测定该物质与大鼠脑组织M胆碱受体的亲和力;选用离体豚鼠回肠纵行肌观察其对M胆碱受体的效应.结果 从舟山眼镜蛇蛇毒中获得一种与大鼠脑组织M胆碱受体具有高亲和力的多肽(Ki为10.12 nmol/L),其相对分子质量约14 kD.该多肽可引起离体豚鼠回肠纵行肌收缩,此效应可被阿托品阻断.结论 舟山眼镜蛇蛇毒中获得与M胆碱受体具有高亲和力的多肽,该多肽对M胆碱受体具有激动效应.     

眼镜蛇毒细胞毒素缓释微球瘤内注射对裸鼠人肝癌皮下移植瘤的影响

目的：评价眼镜蛇毒细胞毒素（cytotoxin,CTX）-聚乳酸-羟基乙酸（polylactic-co-glycolic acid,PLGA）微球经皮瘤内注射治疗裸鼠肝癌的安全性和有效性。 方法：采用甲基噻唑基四唑法检测分离纯化得到的眼镜蛇毒CTX体外细胞毒活性,复乳-溶剂挥发法制备眼镜蛇毒CTX-PLGA缓释微球。40只BALB/c裸小鼠皮下接种人肝癌细胞系BEL-7404细胞建立裸鼠皮下移植瘤肝癌模型,分为生理盐水组、空白微球组、游离CTX组和CTX-PLGA微球组。瘤内注射相应药物,治疗后每周用高频超声观察肿瘤内部回声和血流情况;治疗后第26天,剥离肿瘤称取质量并计算抑瘤率;取肿瘤组织和心、肝、肾等重要脏器,观察其病理学改变。 结果： 眼镜蛇毒CTX对体外培养的人肝癌BEL-7404细胞具有较强的毒性作用。眼镜蛇毒CTX-PLGA缓释微球粒径约（34.45±9.85）μm,具有较高的包封率和较好的缓释效果。瘤体内一次性注射眼镜蛇毒CTX-PLGA微球后,肿瘤体积增长缓慢,抑瘤率达52.36%;光学显微镜观察显示肿瘤组织大部分坏死,但心、肝、肾等重要脏器在形态学上无明显改变。 结论：眼镜蛇毒CTX-PLGA微球瘤内注射可抑制裸鼠肝癌的生长,且具有较高的安全性。     

尖吻蝮蛇蛇毒纤溶酶的分离纯化及氨基酸序列测定

目的:从尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化出高纯度的纤溶酶并对其进行初步性质研究和氨基酸序列分析。方法:采用DEAE-Sepharose FF离子交换和两次Superdex75PG凝胶过滤,从尖吻蝮蛇蛇毒中纯化出可直接溶解纤维蛋白原的蛋白酶。结果:分离到的纤溶酶相对分子质量为25kD,HPLC分析纯度在97%以上,氨基酸序列分析其N末端为MSTEF QRYME IVVNHS MVKKY NGDSD KIKAW。结论:采用此工艺可从尖吻蛇毒中分离出高比活的纤溶酶,为进一步研究其药理作用奠定了基础。     

蛇毒组分对K562阿霉素敏感株和耐药株的抑制作用

目的：通过对中华眼镜蛇毒进行分离和各组分的初筛,寻找逆转K562对阿霉素耐药的活性成分KD-Ⅲ-1．为今后研究肿瘤耐药性奠定工作基础。方法：通过凝胶分离得到的蛇毒组分分别作用于K562对阿霉素耐药株K562／A和敏感株K562／S,筛选有效活性组分;通过荧光探针Rhl23测定P-gP蛋白活性和PI染色进一步确定该组分的逆转K562／A的耐药活性。结果：分别给予2μg／mL阿霉素（Adr）和各浓度蛇毒组分处理24h后,可以发现蛇毒组分对阿霉素敏感株K562／S和耐药株K562／A都有明显的抑制作用,并呈现出剂量-效应关系。1μg／mL蛇毒组分处理组与2μg/mL蛇毒处理组抑制作用明显;在药物持续作用48h后对K562／A的活性仍有抑制作用在0．5、1、2μg／mL的蛇毒组分组表现的更加明显。通过Rho外排实验发现蛇毒粗毒组平均荧光强度（MFI）与阴性对照组没有明显差异,而2．5μg／mL蛇毒组分组的MFI明显降低,与对照组相比具有统计学意义（P〈0．05）。2．5μg／mL蛇毒粗毒和分离组分分别对K562／S敏感株和K562／A耐药株作用3h后。K562／S的PI染色阳性率明显升高,而K562／A的PI染色阳性率并没有明显升高。结论：蛇毒组分KD-Ⅲ-1对K562／A和K562／S细胞均有明显抑制的作用,抑制作用可能与诱导凋亡有关。     

中华眼镜蛇蛇毒因子的简易提纯及鉴定

目的探索从中华眼镜蛇（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃｏｂｒａ,Ｎａｊａ ｎａｊａ ａｔｒａ）蛇毒中一次性快速分离提纯具有抗补体活性及溶血活性的中华眼镜蛇蛇毒因子子质量测定,并鉴定其活性与毒性。结果本法ＣＣＶＦ得率高于２％,电泳图谱呈单一区带,由３个亚基组成,相对分子质量为１４５ ８００,抗补体及溶血活性强,毒性低。结论本法操作简单,时间短,纯度高,为一实用高效快速提纯方法。     

Purification and characterization of anti-clotting protein component （ACPF-7221） from venom of Agkistrodon acutus

Background Snake venom contains a number of components with different pharmacological and biological activities, especially in cancer therapy, and has increasingly become a research focus. This study was designed to isolate and purify a novel anti-clotting protein component from the venom of Agkistrodon acutus, and to explore its physico-chemical properties and biological activity. Methods The venom of Agkistrodon was isolated and purified by ion-exchange chromatography on diethylaminoethyl （DEAE）-Sepharose Fast Flow, molecular sieve filtration through Sephadex G75, SP-Sepharose Fast Flow and molecular sieve filtration through Sephadex G50. We detected the activated partial thromboplastin time （APTT） of the eluant to select the anti-clotting protein component of interest. The molecular weight was determined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamid gel electrphoresis （SDS-PAGE） and liquid chromatography. Its protein content was detected by bicinchoninic acid （BCA）. Results SDS-PAGE vertical gel electrophoresis showed that the anticoagulant factor is a tripolymer composed of three proteins whose molecular weights are 25 KDa, 30 KDa and 50 KDa. The factor contains about 65% percent protein. Conclusions A novel anti-clotting protein component was purified by ion-exchange chromatography and molecular sieve filtration from the venom of Agkistrodon acutus and was found to be composed of three kinds of proteins.     

江浙蝮蛇毒纤溶酶的分离纯化及性质研究

目的:江浙蝮蛇毒纤溶酶的分离纯化及部分生物化学和药理性质的研究.方法:应用DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换柱和HiPrep Sephacryl S 100柱分离纯化纤溶酶,以高效液相色谱仪和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯度、相对分子质量,应用等电聚焦电泳测定等电点,然后测定氨基酸组分及部分药理性质.结果:分离得到相对分子质量为59 100,等电点为4.98, SDS-PAGE为一条带,高效液相色谱分析为单一峰的纤溶酶.该组分属于金属蛋白酶类.氨基酸组成分析表明它含较多的酸性氨基酸.高浓度的纤溶酶对肿瘤细胞CEN2有抑制作用,有微弱的出血毒性.结论:分离纯化得到了一种有微弱出血毒,具有较强抗凝活性的单一组分的酸性金属蛋白酶.     

长白山白眉蝮蛇毒磷脂酶A2的提纯

应用ＣＭ－ＳｅｐｈａｄｅｘＣ－５０离子交换层析法，从长白山白眉蝮蛇毒中分离出２个具有磷旨酶Ａ２（ＰｈｏｓｐｈｌｉｐａｓｅＡ２，ＰＬＡ２）活性的蛋白质组分。其中之一再经ＤＥＡＥ－ＣｅｌｌｕｌｏｓｅＡ－５２离子交换层析和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０凝胶过滤进一步纯化，经两种不同类型的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定均为单一条带，ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０凝胶过滤呈单一对称的峰形。     

东亚钳蝎（ButhusmarthensiiKarsch）毒镇痛活性肽的分离纯化及其镇痛作用研究

本文采用凝胶过滤及离子交换层析法从东亚钳蝎毒中分离纯化出一种蝎毒镇痛活性肽（ＳｃｏｒｐｉｏｎＡｎａｌｇｅｓｉｃＰｅｐｔｉｄｅ简称ＳＡＰ）．ＳＡＰ经ＰＡＧＥ得单一条带，ＨＰＬＣ层析为单一峰；以ＳＤＳ－ｐＡＧＥ法测定其分子量为９１２０，等电聚焦法测定ＳＡＰ的等电点为７．８５，ＳＡＰ对热比较稳定．用小鼠醋酸扭体法等３种动物实验模型测定ＳＡＰ的镇痛作用，结果表明均有较强的镇痛活性．