HMME介导的光动力疗法对骨肉瘤细胞的杀伤效应及机制研究

目的探讨血卟啉单甲醚介导的光动力疗法（HMME-PDT）对骨肉瘤LM-8细胞增殖与凋亡的影响及其机制。方法将LM-8细胞与不同浓度的HMME（10、20、30gg／m1）共同孵育,4h后,给予不同能量密度的激光（3、6、9J／cm2）照射,同时设空白组（无光敏剂也无光照）、暗毒组（无光照但加入光敏剂）、激光组（不加光敏剂但给予光照）。MTT法检测细胞存活率,采用AnnexinV-FITC／PI染色的流式细胞分析法检测LM-8细胞凋亡和周期情况,Hoechst33342染色法观察细胞凋亡,实时定量PCR（QRT-PCR）分别检测Caspase-3、Bcl-x、p53、RelAmRNA表达水平,免疫印迹（Westernblotting）分别检测caspase-3、Bcl-X、p53、RelA蛋白的相对表达量。结果HMME-PDT能显著抑制骨肉瘤LM-8细胞增殖,且杀伤效应随着HMME浓度及能量密度的增高而增强。然而单独光照或单独给予光敏剂孵育,对骨肉瘤LM-8细胞均无杀伤作用。流式细胞术检测发现凋亡率显著增高,10μg/mlHMME组为（12．3±2．82）％,20μg/mlHMME组为（20．67±5．58）％,30gg／mlHMME组为（42．53±4．641％,凋亡率与空白组比较,结果分别为（f=-2．889,P=0．045）、（f=-4．418,P=0．014）、（t=-5．780,P=0．04）。周期结果显示：G0／G1期细胞明显增高、s期细胞明显降低,301ag／ml组G0／G1期为（50．09±3．151％、S期为（28．17±1．10）％,与空白对照组比较,结果分别为（t=-6．081,P=0．004）、（t=5．852,P=0．004）。HMME-PDT处理LM-8细胞后径Hoeehst33342染色后呈现出典型的凋亡改变（如：核固缩、细胞变圆等）。QRT-PCR和Westernb10ring结果显示：HMME-PDT可显著上调Caspase-3mRNA和蛋白相对表达量且表达量随着HMME浓度增高而增高。而HMME-PDT可明显下调Bcl-x、p53、RelAmRNA和蛋白相对表达量且表达量随着HMME浓度增高而降低。结论在体外HMME-PDT对骨肉瘤LM-8细胞有显著的杀伤效应,其杀伤效应与Caspase-3、Bcl-x、p53和RelA密切相关。     

5-氮杂-2’-脱氧胞苷联合低浓度顺铂对肺癌细胞增殖影响的实验研究

目的 探讨5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）与低浓度顺铂（DDP）联合用药对非小细胞肺癌（NSCLC）A549细胞增殖的影响。方法 选择1μmol／L DDP、10μmol／L 5-Aza-CdR及两者联合分别处理体外培养的A549细胞,MTT法检测处理前后的细胞增殖活性,流式细胞仪、Hoechst 33258染色分别观察处理前后的细胞周期、凋亡率及凋亡形态学变化。结果 MTT法显示,与单独1μmol／L DDP组比较,联合组能够明显抑制A549细胞的增殖,A549细胞的凋亡率亦明显增加;流式细胞仪显示,联合组作用于细胞G0／G1期,使A549细胞生长阻滞在此期,细胞的增殖指数降低;与单独1μmol／L DDP组比较,联合组A549细胞的凋亡形态学改变更明显。结论5-Aza-CdR联合低浓度DDP能够明显抑制NSCLC A549细胞的增殖和诱导A549细胞的凋亡。     

血卟啉单甲醚对卵巢癌细胞系SKOV3的光动力学杀伤效应

背景与目的：光动力学治疗（photodynamic therapy,PDT）近年来逐渐成为一种新的可供选择的卵巢癌治疗手段。血卟啉单甲醚（hematoporphyrin monomethyl ether,HMME）是我国自主开发研制的一种新型光敏剂,本实验目的在于体外实验研究HMME在卵巢癌细胞系SKOV3细胞中的荧光显微成像,并验证其对SKOV3的光动力杀伤作用。方法：30μg／ml HMME与细胞孵育不同时间后,置于高灵敏度荧光显微镜与激光共聚焦显微镜下检测HMME荧光及其细胞内的定位,形态学软件分析其荧光强度;不同浓度（5—50μg／ml）HMME与细胞孵育3h后,以不同能量激光（1．5、3、6、12J／cm^2）照射,MTT比色法检测细胞的存活率;以5μg／ml、3J／cm^2,20μg／ml、6J／cm^2剂量处理细胞,4h及24h后分别收集细胞行Annexin V／PI双染色,流式细胞仪分析细胞死亡方式。结果：HMME呈红色荧光弥漫性分布于细胞浆内,细胞内荧光强度于用药3h后达到高峰。高浓度HMME单独使用可能对细胞具有暗毒性。而单独激光照射对细胞存活无影响。随着HMME浓度与激光剂量的增加,细胞存活率逐渐下降。当HMME浓度增高到≥40μg／ml时．加大药物浓度与激光剂量细胞存活率并不随之降低。流式细胞仪分析结果显示HMME光动力学处理后死亡细胞主要为坏死细胞。结论：HMME对SKOV3细胞具有光动力学杀伤效应。     

Apogossypolone联合神经酰胺诱导鼻咽癌CNE-2细胞凋亡与自噬

  目的  探讨棉酚衍生物Apogossypolone(ApoG2)联合神经酰胺体外抑制鼻咽癌CNE-2细胞增殖, 并初步探讨其可能机制。  方法  CCK-8测定不同浓度ApoG2和神经酰胺单药毒性及联合应用对CNE-2细胞的抑制作用, 计算CDI判定药物联合效果。Hoechst33258染色观察细胞凋亡, 吖啶橙(AO)染色、透射电镜观察自噬形态学变化, FCM检测凋亡率与自噬荧光强度。Western Blot检测Bcl-2、Beclin1蛋白表达。  结果  CCK-8检测发现ApoG2和神经酰胺单独应用时, 随药物浓度增加, 对CNE-2细胞生长的抑制作用也增加; 低浓度两药联合作用能协同增强单药抑制鼻咽癌细胞CNE-2细胞生长(CDI < 1)。Hoechst33258染色显示联合用药后出现更多的核固缩和碎裂等凋亡现象; 吖啶橙染色显示联合用药后产生更多的亮红色酸性自噬泡。透射电镜观察到联合用药后细胞内大空泡及膜性双层结构增多。FCM检测联合用药组细胞凋亡率和自噬率均较单独处理组升高, 差异具有统计学意义(F_凋亡=106.72, P_凋亡 < 0.001, F_自噬=140.77, P_自噬 < 0.001)。Western Blot检测发现联合用药组Bcl-2蛋白表达较单药处理组降低(F=111.071, P < 0.001), Beclin1蛋白表达较单独处理组升高(F=62.271, P < 0.001)。  结论  低浓度ApoG2与神经酰胺联合共同诱导细胞凋亡与自噬, 协同抑制鼻咽癌细胞生长, 其作用机制可能与下调Bcl-2和上调Beclin1的表达有关。      

光动力疗法对人肺腺癌细胞系A549杀伤作用的实验研究

目的　探讨光动力疗法 (PDT)对体外培养的人肺腺癌细胞系A5 49的杀伤效应。方法　以人肺腺癌细胞系A5 49作为研究对象 ,以血卟啉衍生物 (HPD)为光敏剂 ,以半导体激光器为光源 ,采用连续照射的方式 ,将经不同浓度HPD处理的A5 49细胞照射不同剂量的激光 ,用MTT法测定OD492 值。结果　HPD浓度为 5mg/L时基本无治疗作用 ;在相同的激光照射剂量下 ,10mg/LHPD即有治疗作用 ,再增大HPD浓度对细胞的杀伤效应增加不明显 ;在相同的HPD浓度下 ,激光剂量为 10J/cm2 时OD492 值降低达平台。综合两方面因素 ,在HPD浓度 10mg/L、激光剂量 10J/cm2 时PDT对A5 49细胞发挥有效的杀伤作用。当能量密度均为 10J/cm2 时 ,采取三组不同的功率时间组合 :2 14mw× 10min、42 8mw× 5min、714mw× 3min进行照射 ,测得的的OD492 值无统计学差异。结论　光动力疗法对体外培养的人肺腺癌细胞系A5 49有明确的杀伤效应 ,HPD浓度 10mg/L、激光剂量 10J/cm2 是本实验PDT的最佳作用参数。在该最佳能量密度下采取不同的功率时间组合对PDT效应无明显影响。     

盐霉素增加鼻咽癌CNE-2细胞放疗敏感性的实验研究

目的:探讨盐霉素（Sal）对鼻咽癌CNE-2细胞的放疗增敏作用及其可能的机制。方法:CCK8测定不同浓度盐霉素、不同剂量放疗及联合应用对CNE-2细胞增殖的抑制作用;平板克隆实验观察盐霉素联合放疗后细胞的克隆形成率;Hoechst33258染色观察细胞凋亡;流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞周期的变化情况。结果:CCK8结果显示,盐霉素和放疗对鼻咽癌CNE-2细胞的生长有显著的抑制作用,呈浓度和剂量依赖性,且联合组抑制作用强于单纯药物组或放疗组。平板克隆实验显示盐霉素联合放疗后能显著降低细胞的克隆形成率;Hoechst33258染色显示盐霉素联合放疗治疗后细胞凋亡现象更明显;细胞流式术检测显示联合组较单纯药物组或放疗组凋亡率增加,盐霉素对放疗具有增敏作用。药物组和放疗组均能使G2/M期细胞比例增加,两者联合效果更明显。结论:盐霉素能增加人鼻咽癌CNE-2细胞的放疗敏感性,其作用机制可能与周期阻滞及其凋亡诱导相关。     

高温联合顺铂及多西他赛对肺腺癌A549细胞体外作用的研究

目的:研究高温联合顺铂(DDP)及多西他赛(TXT)对肺腺癌细胞株A549的体外作用.方法:不同处理因素作用于A549细胞后,应用四氮唑盐比色法(MTT法)测定细胞增殖情况,根据Veleriote法判断高温联合化疗药的作用效果;通过两药相互作用指数判断药物联合作用效果;流式细胞仪检测不同处理后细胞凋亡情况;光学显微镜及荧光显微镜观察细胞形态学变化.结果:高温和化疗药单独作用均对A549有生长抑制作用(P＜0.05);化疗药有剂量依赖关系;高温有温度依赖关系;高温与药物联合对细胞生长抑制作用强于单独高温组或单独化疗组(P＜0.01);DDP与高温联合为协同作用;TXT与高温联合为次加作用;DDP和TXT联合作用对细胞生长抑制为协同作用;42℃、DDP 2 μg/ml 和TXT 1μg/ml三者联合凋亡率明显高于其他处理组(P＜0.01);普通光镜和荧光显微镜下42℃、DDP 2 μg/ml 和TXT 1μg/ml三者联合凋亡细胞数较对照组和42℃组明显增多,细胞形态学变化明显.结论:DDP、TXT、高温三者体外联合作用对A549有明显的生长抑制和诱导凋亡作用.     

MG132和DDP联合应用对人鼻咽癌细胞CNE-1凋亡影响及其机制的探讨

目的:研究蛋白酶体抑制剂MG132与顺铂(DDP)联合应用对人鼻咽癌细胞株CNE-1细胞凋亡的影响,观察细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2和Bad表达的变化。方法:体外培养的CNE-1细胞分别暴露于MG132和DDP、单独MG132或者DDP,24h后,流式细胞术(FCW)检测CNE-1细胞的凋亡率,蛋白质印迹法测定CNE-1细胞中Bcl-2和Bad蛋白的表达情况。结果:流式细胞术检测结果显示,MG132和DDP联合用药组CNE-1细胞凋亡率(53±3.2)%较单独应用MG132组(20±1.7)%、DDP组(18±2.3)%的凋亡率显著增加。蛋白质检测结果显示,与MG132组、DDP组比MG132和DDP组Bcl-2的表达减少约3倍,而Bad的表达增加约2倍。结论:MG132和DDP联合应用可能通过降低Bcl-2同时增强Bad的表达而进一步诱导CNE-1细胞的凋亡。因此,我们可以认为MG132能够增强DDP对CNE-1细胞凋亡的作用。     

神经酰胺促胃癌SGC7901细胞凋亡的实验

目的探讨神经酰胺(Ceramide,Cer)对胃癌SGC7901细胞的促凋亡作用及可能作用机制。方法体外培养人胃癌SGC7901细胞,分别给予Cer、顺铂（DDP）;DDP联合Cer作用后,MTT检测单独使用Cer及联合DDP应用对SGC7901细胞增殖的影响,流式细胞仪检测细胞凋亡率,免疫组织化学染色、Western blot 检测SGC7901细胞NF-κB、Bcl-2、Bax蛋白表达。结果Cer 2.5 μmol/L及以上时可以抑制细胞增殖,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。Cer联合DDP后,联合用药作用强于单独DDP及Cer组(P<0.05),q值在24、48、72 h分别为1.05、1.01、0.99。Cer、DDP作用48h可诱导SGC7901细胞凋亡,Cer 5 μmol/L、DDP 2.5 mg/L单独用药组及Cer 5 μmol/L 联合DDP 2.5 mg/L组凋亡率分别为：（39.23±1.62）%、（4727±113）%、（50.13±2.76）%,与对照组［（1846±1.64）%］相比差异有统计学意义（P<0.05）,联合用药作用强于单独DDP及Cer组(P<0.05)。NF-κB、Bcl-2在SGC7901细胞中较高表达［（74.10±2.69）%、（69.37±4.54）%］,Bax在SGC7901细胞中表达较低［（2460±373）%］,Cer 5 μmol/L、DDP 25 mg/L单独用药组及Cer 5 μmol/L 联合DDP 2.5 mg/L组NF-κB、Bcl-2阳性表达率降低(65.13±1.71、 62.17±2.12, 44.8±3.65;57.70±2.22、55.13±5.77、37.67±2.14),Bax表达率上调(33.80±1.10、35.50±2.27、51.73±3.76),Bcl-2/Bax 比值降低(1.71±0.10、1.56±0.26、0.73±0.09),与对照组相比差别有统计学意义（P<0.05）,联合用药作用强于单独DDP及Cer组(P<0.05)。相关性分析显示NF-κB与Bcl-2呈正相关（Spearman^,s rho =0.9510,Prob>|t|=0.0000）。结论Cer通过下调NF-κB进而调节Bcl-2/Bax比值诱导SGC7901细胞凋亡。