鸡α-干扰素成熟肽的原核表达及其多价血清的制备

以PCR方法从活化的鸡外周血淋巴细胞中扩增鸡α-干扰素的成熟肽基因序列,构建原核表达质粒pET32a-α和pGEX6p-α;SDS-PAGE及Western blotting法检测两载体特异性表达成熟肽;将纯化的pET32a-α诱导表达产物免疫小鼠,收获小鼠血清并以pGEX6p-α诱导表达产物检测其中特异性抗体滴度。结果表明:扩增的鸡α-干扰素成熟肽基因成功表达,原核表达产物免疫小鼠可产生特异性抗体,抗体效价为1∶12 000。其结果为制备安全、高效的重组干扰素奠定了基础,为定量检测机体内产生的α干扰素进而了解机体免疫状态提供较为可靠的技术手段。     

猪α-干扰素的原核表达

重组质粒pMDIFN-α中的猪α-干扰素基因经双酶切,亚克隆到原核表达载体pET-．28a,构建了重组表达质粒pETIFN-α,经过SDS-PAGE蛋白质电泳,测得表达蛋白的相对分子质量约为26500．表达蛋白的Western-blotting分析显示：改进后的半干胶转印免疫印迹法灵敏度高、特异性强、重复性好;获得的重组融合蛋白具有良好的反应原性．     

牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)免疫逃逸机制研究进展

牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)为α疱疹病毒亚科成员,是引起牛多种疾病的重要病原之一。BHV-1面对牛免疫系统的不断进化,产生出多种机制以逃逸宿主的免疫防御,其主要包括诱导外周血单个核细胞凋亡、感染淋巴细胞和抑制淋巴细胞反应、抑制干扰素-β表达和建立潜伏感染等多种免疫逃逸机制。BHV-1的免疫逃逸给治疗和预防BHV-1所导致的相关疾病造成了极大的困难。尤其以潜伏感染最为严重,它能使患病动物终身带毒并能实现病毒的再激活。故主要阐述BHV-1的上述免疫逃逸机制,以期对相关疾病的防制和疫苗创制提供一定的帮助。     

绍兴鸭α-干扰素基因克隆、表达及活性测定

采用PCR法从绍兴鸭的肝组织基因组DNA中扩增出α-干扰素基因,插入pUC18载体,进行序列测定及分析;将成熟α-干扰素基因亚克隆到表达载体pET-28α( )中,并转化入大肠杆菌BL21进行表达;表达产物经复性后,进行抗病毒活性的测定.测序结果表明,该基因(sxDuIFN-α)由576个核苷酸组成,共编码191个氨基酸.该基因与GenBank公布的鸭α-干扰素基因(X84764,AB128861)的核苷酸序列同源性分别为99.3%和99.1%,氨基酸序列同源性均为97.9%.表达载体经IPTG诱导表达出相对分子量为20.7 kD的DuIFN-α.该产物经细胞病变抑制法测定,显示出具有明显的抗猪水泡性口炎病毒(VSV)及鸭瘟弱毒疫苗毒的活性.     

抑制素基因免疫黄牛的黄体发育与免疫纯度及剂量的关系

为探讨双拷贝抑制素pcISI基因疫苗纯度和剂量对肉牛黄体发育的影响,将150头同期发情的南阳黄牛随机分为8个试验组和2个对照组,试验组用pcISI按2种纯度、4种剂量(0.75、1.50、2.25、3.00 mg/头)进行免疫处理,2个对照组分别用空质粒和生理盐水进行处理;初次免疫21 d后进行加强免疫。结果表明:无论用高纯度还是低纯度疫苗免疫,2.25 mg/头剂量处理对黄体的作用效果最明显,且抗体水平与黄体发育密切相关,2.25 mg/头抑制素融合表达质粒组的黄体显著大于0.75 mg/头组(P<0.05),抗体阳性牛两侧黄体显著比抗体阴性牛的大(P<0.05)。     

猪瘟病毒E2基因乳腺特异表达载体的构建

为进一步研究基因疫苗的免疫机制与免疫效果,探讨外源基因在乳腺中的定位表达,应用重组PCR方法,将猪瘟病毒(CSFV)E2基因与牛β-乳球蛋白(BLG)5′部分调控序列连接起来,并插入到真核表达载体pEGFP-C1上,构建了含有CSFVE2基因的乳腺特异表达载体。     

牛免疫注射应注意事项研究

随着民众对健康饮食的重视程度不断提升,牛肉的市场需求不断增加,有效推动了牛养殖行业的健康发展。疫苗的免疫注射是预防牛类疾病的重要方法,对于保障牛的健康和提高养殖收益具有重要意义。该文重点介绍了疫苗储存、运输要求、免疫剂量、免疫操作等注意事项,以期为基层防疫人员提供参考,减少应激反应,提高动物免疫效果,促进牛养殖行业的健康发展。     

鸭α-干扰素真核表达质粒的构建及其对DVH弱毒苗免疫鸭细胞免疫调节作用研究

为检测鸭α-干扰素对鸭细胞免疫的调节作用,本文按常规方法构建了鸭α-干扰素真核表达质粒(pcDNA-DuIFN-α),并以50、100、200μg分别肌注28日龄樱桃谷鸭,15 d后免疫鸭病毒性肝炎(DVH)弱毒疫苗,设空载体+DVH弱毒疫苗、生理盐水、DVH弱毒疫苗以及pcDNA-DuIFN-α对照组,采用流式细胞仪(FACS)和淋巴细胞增殖试验(MTT法)分别对免疫鸭外周血的CD3+淋巴细胞总数和T淋巴细胞转化能力进行动态检测。结果:①CD3+淋巴细胞数量:7~56 d实验组极显著(P≤0.01)高于生理盐水和显著高于(P≤0.05)DVH弱毒苗、空载体+DVH弱毒疫苗和pcDNA-DuIFN-α对照组,14~28 d 100μg组显著(P≤0.05)高于50和200μg组;②T淋巴细胞对ConA的反应能力(OD值):21~56 d实验组极显著(P≤0.01)高于生理盐水和显著高于(P≤0.05)DVH弱毒苗、空载体+DVH弱毒疫苗和pcDNA-DuIFN-α对照组,50和100μg组差异不显著,28~56 d均略高于200μg组。研究表明pcDNA-DuIFN-α是一种优秀的鸭细胞免疫的分子增强剂和DVH弱毒疫苗的分子佐剂,肌注100μg/只的效果最佳。     

重组猪γ—干扰素在毕赤酵母中的表达及其生物学活性研究

采用RT-PCR从猪外周血液淋巴细胞中克隆出猪γ-干扰素基因cDNA,构建了重组酵母表达载体(pPICZα-PoIFN-γ),并在巴斯德毕赤酵母X33株中实现了高效分泌表达,经SDS-PAGE和Western-lot证实猪γ-干扰素分子量为18 kD,细胞培养试验结果表明,莺组猪γ-干扰素能抑制水泡性口炎病毒(VSV)对猪肾传代细胞(PK-15)的攻击;而在动物试验中,重组猪γ-干扰素可明显提高猪伪狂犬疫苗的免疫效果.     

广西巴马小型猪α干扰素基因克隆及其真核表达载体的构建

[目的]克隆广西巴马小型猪α干扰素基因（poIFN-α）全部编码序列并构建其哺乳动物真核表达载体,为研发重组猪干扰素类免疫佐剂及生物治疗制剂提供参考依据.[方法]应用RT-PCR扩增广西巴马小型猪poIFN-α编码序列,链接至pMD 18-T载体构建重组质粒,以测序正确的重组质粒为模板,PCR扩增带有酶切位点的poIFN-α基因,然后连接真核表达载体pTARGET构建重组表达载体pTARGET-poIFN-α,并转化感受态细胞DH5α,经双酶切初步鉴定正确后送至北京诺赛生物有限公司测序,用DNASTAR软件及Primer Premer 5.0等对获得的基因序列进行分析.[结果]以广西巴马小型猪总RNA为模板扩增获得的目的片段为618 bp,包含poIFN-α基因全部编码序列;将克隆获得的poIFN-α基因插入哺乳动物真核表达载体pTARGET中,可成功构建广西巴马小型猪重组表达载体pTAR-GET-poIFN-α.广西巴马小型猪poIFN-α与GenBank上已发表的猪、鼠、人IFN-α基因同源性分别为97.0％、78.2％和66.3％;其成熟肽与普通猪相比,共有17个位点发生碱基突变,其中第63、189、198、288、544、545位点为无义突变,第88、119、163、182、186、195、263、301、306、553、560位点为错义突变.[结论]IFN-α成熟肽在哺乳动物中保守性较差;克隆获得的广西巴马小型猪poIFN-α基因能成功插入哺乳动物真核表达载体pTARGET中构建重组表达载体pTAR-GET-poIFN-α,为研发重组猪干扰素类生物治疗制剂、免疫佐剂、构建小型猪疾病动物模型等奠定了基础.     

猪α干扰素在大肠杆菌中的表达及抗病毒活性检测

【目的】利用基因工程技术寻求能够高效、稳定表达猪α干扰素,且表达产物易于纯化的表达系统。【方法】以含猪α干扰素(IFN-α)基因的重组质粒pGEM-T-IFN-α为模板,PCR扩增猪α干扰素基因。将IFN-α片段定向插入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-IFN-α,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白(GST-IFN-α)。【结果】SDS-PAGE可检测到相对分子质量约为45 ku的GST-IFN-α,Westernblot证实GST-IFN-α能与猪IFN-α单克隆抗体发生特异性反应。重组猪α干扰素经谷胱苷肽Sepharose-4B亲和柱层析纯化后,在Vero细胞上抗水泡性口炎病毒的活性为2.24×103U/mg。【结论】建立的表达系统能够表达重组猪α干扰素,表达的重组猪α干扰素具有一定的生物活性。     

用牛αS1-酪蛋白基因构建乳腺生物反应器表达载体的研究

牛αS1-酪蛋白基因是制备乳腺生物反应器常用的表达载体,可以指导外源基因在动物乳腺中高水平表达。对牛αS1-酪蛋白基因的结构、表达载体的各种调控元件及其研究应用进展等方面作一综述。     

脾脏转录组测序揭示地方黄牛及杂交牛的免疫应答差异

为分析地方黄牛品种和杂交改良牛品种适应性特征的免疫机制,利用转录组学(RNA-seq)技术,以地方品种文山牛及杂交品种中国西门塔尔牛和云岭牛为研究对象,筛选种间差异表达的功能基因,挖掘免疫及抗病相关的重要调控基因。结果表明：文山牛脾脏组织的整体基因丰度显著高于中国西门塔尔牛和云岭牛,而2个杂交牛品种间无显著差异。基因表达量的相关性分析显示,相对于文山牛,中国西门塔尔牛与云岭牛的相关性较高。云岭牛与中国西门塔尔牛品种间差异基因数很少,仅为616个;而文山牛与中国西门塔尔牛以及文山牛与云岭牛品种间差异基因数明显增加,分别为4 503和3 520个。功能注释发现显著差异表达的基因多富集在免疫应答、对细菌的防御反应、对真菌的防御反应、对革兰阴性菌的防御反应、T细胞活化和中性粒细胞活化等通路上,其中ITK、IRF4、CD2、LAT等基因在地方牛中表达水平显著高于杂交牛,在免疫应答及疾病抵抗力过程中起着重要作用。     

牛分枝杆菌MPB83基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为观察重组MPB83蛋白的免疫活性,揭示该蛋白在牛结核病的诊断和防治中的作用,克隆了牛分枝杆菌MPB83基因,构建了克隆载体pGEM-MPB83和表达载体pET30a-MPB83,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并进行蛋白纯化。试验结果表明:牛分枝杆菌MPB83基因体外扩增产物与预期值相符,约600 bp;所构建表达质粒pET30a-MPB83经测序,结果与预期一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以包涵体的形式表达,其分子质量约为26 ku,蛋白表达量占菌体总蛋白的20%;该蛋白经电洗脱纯化后,纯度达95%以上;免疫印迹分析表明,原核表达的融合蛋白可与兔抗牛分枝杆菌多克隆抗体结合,并且具特异的免疫反应性。     

以LacZ为报告基因探讨促进基因表达及基因免疫应答物质的筛选

应用分子生物学技术构建了LacZ报告基因的pcDLacZ真核表达载体 ,并对多种促进基因表达的物质进行了筛选。应用筛选的促进基因表达物质对pcDST基因疫苗的免疫增强效果进行了观察。结果 :构建的LacZ报告基因的pcDLacZ真核表达载体 ,肌注后 1天就有表达 ,到第 7天达到高峰。通过对多种促进基因表达的物质进行筛选证明 ,4.5 %斯苯、1 %甘油、2 5 %蔗糖有明显促进基因的表达作用。 4.5 %斯苯、1 %甘油能促进pcDST猪瘟基因疫苗的免疫效果。表明 :4.5 %斯苯、1 %甘油可做为基因疫苗的免疫佐剂使用     

黄牛对抑制素pCISI基因免疫的反应性

为分析抑制素基因免疫对黄牛的影响,优化免疫方法,将3.0 mg抑制素真核融合表达质粒pCISI以不同纯度并配以不同的免疫佐剂分2次导入72头母黄牛体内,采用ELISA法检测血样中抗抑制素抗体效价。结果表明:抗体阳性牛占59.72%(43/72);添加佐剂的重组质粒较空质粒组免疫效果明显(P<0.05),普鲁卡因佐剂显著优于脂质体(P<0.05);高纯度疫苗组阳性牛的比例略高于低纯度组,但差异不明显(P>0.05)。这说明应用抑制素质粒pCISI免疫黄牛后可产生抗抑制素抗体。     

细胞因子与猪瘟病毒E_2基因真核双表达载体的构建及其免疫增强作用

 构建了猪瘟病毒E2 基因与IL 2、IL 3基因的双表达真核表达载体 ,观察其表达水平 ,并对其免疫增强效果进行了观察。结果表明 ,构建了 2种猪瘟病毒E2 基因与白细胞介素 2、3的真核表达质粒pIRSTIL 2 ,pIRSTIL 3。将 2种质粒转染BHK 2 1细胞 ,均可在体外表达E2 抗原和有生物活性的IL 2、IL 3两种质粒能诱导产生CSFV的特异性免疫反应。pIRSTIL 2 ,pIRSTIL 3所诱导的免疫应答反应比使用单表达质粒 pIRST强。试验表明 ,细胞因子与目的基因构建的双表达基因疫苗能有效提高基因疫苗的免疫效果。     

不同剂量猪瘟疫苗对免疫效果的影响

猪瘟是南猪瘟病毒（HCV）引起的高度传染性疾病,该病各种年龄猪均易发生,一年四季流行．严重威胁着养猪业发展。猪瘟最有效的控制方法是疫苗免疫．为研究猪瘟疫苗不同剂量对免疫效果的影响,本人在当地某猪场进行了免疫试验。本试验设计了4种不同的免疫剂量,其目的在于通过考察猪瘟疫苗的不同剂量对免疫效果的影响,以确定适宜的疫苗剂量,为科学制定猪瘟免疫程序,提供依据。     

猪α干扰素的表达及在PAM细胞系中抗PRRSV活性检测

为研究猪α干扰素蛋白功能和了解猪α干扰素蛋白的抗病毒活性,扩增并测序了猪α干扰素基因(IFN-α),并克隆至原核表达载体pET-28a中,构建原核表达载体pET-IFN-α,将pET-IFN-α转化至BL21进行表达。Western-Blot结果表明,表达的蛋白具有很好的生物学活性。用细胞病变抑制法在PAM细胞系上进行抗病毒活性测定,结果表明,猪α干扰素有较为显著的抗PRRSV活性,其抗病毒活性效价约为1.13×106U/mg。     

核酸疫苗研究新进展

核酸疫苗是90年代初从基因治疗研究领域发展起来的一种全新疫苗,又称为DNA疫苗或基因疫苗,它是把编码免疫原或与免疫原相关的外源基因克隆到真核质粒表达载体上,然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内,使外源基因在动物体内表达,产生的抗原激活机体的免疫系统,引发免疫反应,从而达到预防和治疗疾病的目的.与传统的灭活或弱毒疫苗、亚单位疫苗相比,核酸疫苗以具有高效性、安全性和制备简单、易于贮存运输等优点,而受到全世界的普遍关注,具有广阔的发展前景.