O型口蹄疫病毒P1-2A基因重组杆状病毒的构建及其表达

设计合成特异引物,扩增O型口蹄疫病毒(O/FMDV)P1-2A基因,将其克隆至T载体上,通过Hind Ⅲ和Not Ⅰ双酶切P1-2A基因和真核转座载体pFastBac^TM Dual,构建重组转座质粒pFastBac-P12A,再将pFastBac-P12A转化入含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac,经重组筛选获得杆状病毒重组质粒Bacmid-P12A。将Bacmid-P12A质粒转染Sf9昆虫细胞,出现典型CPE。病变细胞经Dot blotting和SDS-PAGE检测和分析,结果表明,O/FMDV P1-2A蛋白在Sf9细胞中获得表达,为O型FMDV特异性蛋白。     

口蹄疫病毒P1和3C基因的联合表达

口蹄疫病毒P1和3C基因联合表达能够产生完整的口蹄疫病毒衣壳蛋白,并形成无核酸的与原病毒外形一致的全新的空衣壳,该空衣壳具有与口蹄疫病毒颗粒相同的抗原特性,免疫动物后能诱导产生抗口蹄疫病毒特异性中和抗体,是开发安全高效口蹄疫重组疫苗的理想途径。论文对口蹄疫P1、3C基因及其对应的蛋白功能和P1、3C基因联合表达研究进行综述,对P1、3C基因联合表达重组疫苗的潜在优点进行了讨论。     

表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的山羊痘病毒弱毒株的构建及筛选

为构建和筛选表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的山羊痘病毒弱毒株,用已构建的口蹄疫病毒O/Chi-na99毒株的EGFP-P7.5-P1-2A-3C基因整体通过平末端连接到KpnⅠ酶切后的线性载体pUC119-TK中,得到重组载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C。重组载体通过缺失的TK基因与羊痘病毒弱毒株在BHK-21细胞中同源重组,用EGFP作为标记筛选出重组毒株,并进行PCR鉴定、抗原捕获ELISA试验检测及Western blot分析。结果显示该重组弱毒株能在1~10代BHK-21细胞中稳定传代,扩增出约3000bp片段,并经测序确证为基因P1-2A-3C;抗原捕获ELISA试验检测均为阳性;Western blot分析表明转移载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C在感染的GTPV AV41BHK-21细胞中表达的蛋白可被O型FMDV高免血清特异性识别,并具有反应原性。这些结果表明获得了表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的重组山羊痘弱毒株。     

O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及其在重组杆状病毒中的表达

利用杆状病毒表达系统进行了口蹄疫病毒VP1基因在Sf9细胞中的表达研究。首先克隆了VP1基因片段．将pMD18-VP1质粒及杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ分别用BamHⅠ及Hind Ⅲ酶切后，用T4 DNA连接酶连接。构建了重组质粒pFastBac-VP1；再将该重组质粒转化DH10Bac感受态细菌。在菌体内进行重组，并经三重抗性与蓝白斑筛选。得到杆状病毒重组质粒Bacmid-VP1；将Bacmid-VP1转染Sf9细胞．获得重组杆状病毒．并进行表达水平的检测。经SDS-PAGE和Western-blotting检测。结果表明，VP1蛋白在重组杆状病毒中获得表达。     

共表达Asia1口蹄疫病毒P1-2A-3C基因和猪IL-18基因重组鸡痘病毒构建及表达

为构建Asia1型口蹄疫重组鸡痘病毒疫苗,采集口蹄疫发病牛的水泡液及水泡皮,用RT-PCR法扩增出Asia 1型口蹄疫病毒的前体蛋白基因P1-2A片段和蛋白酶基因3C片段,分别克隆至pMD18-T载体上,通过酶切连接获得质粒pMD18-T-P1-2A-3C。再将P1-2A-3C片段与pUTAL-IL18片段连接起来,构建鸡痘病毒中间转移质粒pUTAL-P1-2A-3C-IL18。通过脂质体转染法,将pUTAL-P1-2A-3C-IL18与鸡痘病毒282E4株共感染染鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fibroblasts,CEF）,通过BrdU三次加压筛选,筛选出重组鸡病毒株vUTAL-P1-2A-3C-IL18。经RT-PCR和间接免疫荧光法鉴定,证明所筛选的1株重组鸡痘病毒在CEF中能正确表达P1-2A-3C基因。本研究为研制安全、高效的亚洲Ⅰ型FMD重组鸡痘病毒疫苗奠定了基础。     

口蹄疫病毒3D基因在重组杆状病毒中的表达及检测

利用杆状病毒表达系统进行了口蹄疫病毒3D基因在Sf9细胞中的表达研究.首先克隆了3D基因片段,将pMD18-3D质粒及杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ分别用EcoRⅠ及Xba Ⅰ酶切后,用T4DNA连接酶连接,构建了重组质粒pFastBac-3D;再将该重组质粒转化DH10 Bac感受态细菌,在体内进行重组,并经三重抗性与蓝白斑筛选,得到杆状病毒重组质粒Bacmid-3D;将Bacmid-3D转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒,并进行表达水平的检测.经SDS-PAGE和West-ern blot检测,结果表明,3D蛋白在重组杆状病毒中获得表达.     

口蹄疫病毒P12X3C3D多基因编码蛋白在昆虫细胞中的表达与检测

利用杆状病毒表达系统构建了包含有口蹄疫病毒（FMDV）P12X3C3D多基因片段的重组杆状病毒。将该病毒感染Sf9细胞后，利用SDS—PAGE及夹心ELISA方法检测目的蛋白的表达。结果表明，重组杆状病毒能够表达FMDV目的蛋白，该表达产物能被FMDV阳性血清识别，具有一定的反应原性。     

口蹄疫病毒多基因片段的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

根据定点突变原理获得了包含口蹄疫病毒P1、2A、3C、3D及部分2B编码区的目的基因片段，经SpeⅠ和HindⅢ双酶切后，与经相同方法处理的杆状病毒转移载体pFastBacHT连接，得到了重组质粒pFB-P12X3C3D。经酶切和测序鉴定后，将其转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac，经抗性及蓝白斑筛选，得到了含P12X3C3D多基因的重组穿梭载体，将其命名为Bacmid-P12X3C3D；提取其DNA并转染Sf9昆虫细胞，最后获得含口蹄疫病毒P12X3C3D多基因的重组杆状病毒。     

融合表达牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因和O型口蹄疫病毒P12A3C基因的DNA疫苗的构建及其免疫应答

用小鼠模型评价融合表达牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因和O型口蹄疫病毒P12A3C基因的DNA疫苗和不同免疫策略的免疫应答.用PCR方法扩增牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因和O型口蹄疫病毒P12A3C基因,分别克隆到pMD18-T载体并测序验证正确后将其克隆到质粒pcDNA的相应位点获得质粒pcDNA-VP22-P12A3C.然后将BALB/c小鼠分成7组进行免疫.结果表明,DNA疫苗pcDNA-VP22-P12A3C诱导的细胞免疫水平超过了灭活疫苗,DNA疫苗与灭活疫苗联合免疫组体液免疫水平接近灭活疫苗组而细胞免疫水平远高于灭活疫苗组,为进一步研究VP22和P12A3C融合表达的基因工程疫苗奠定了基础.     

AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

利用杆状病毒表达系统对Asia Ⅰ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VPl基因在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究Asia Ⅰ型FMDV VP1蛋白功能及建立Asia Ⅰ型FMDV血清学诊断方法奠定基础.采用PCR方法从pGEM-T-Easy-Asia Ⅰ型VP1质粒中扩增VP1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFast-BaeHTA-VPl再转入DH10Bae感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Baemid-VPl,然后转染Sf9昆虫细胞.PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到Bacmid中,成功构建了杆状病毒重组质粒Baemid-VP1,SDS-PAGE和West-ern-blotting检测结果表明,VP1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约26.5 ku的VP1蛋白.将可溶性表达的融合蛋白用Ni-NTA亲和层析方法进行纯化,通过ELISA分析,能特异性地检测出Asia Ⅰ型口蹄疫病毒阳性血清.Asia Ⅰ型FMDV VP1基因在杆状病毒表达系统中的成功表达为Asia Ⅰ型FMDV VP1蛋白的抗原性及血清学抗体水平检测研究奠定了基础.     

人血小板因子Ⅳ在家蚕杆状病毒表达载体系统中的表达

将人血小板因子Ⅳ (HumanPlateletFactorⅣ ,简称hPF4)基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK PF4,并与线性化病毒Bm BacPAK6DNA共转染家蚕培养细胞 ,在细胞内发生同源重组 ,获得重组病毒BacPAK PF4。Southern杂交结果表明重组病毒基因组中含有hPF4基因。重组病毒以MOI=10感染家蚕培养细胞 (2× 10 6个细胞 )和家蚕 5龄幼虫 ,表达产物用体外培养的血管内皮细胞测定其生物活性 ,测得表达量在家蚕培养细胞中第 3天达到最高值为 6 0 88μg/ 2× 10 6个细胞 ;在蚕体内表达第 5天达到最高值 ,表达量明显高于家蚕培养细胞     

传染性法氏囊病病毒VP2基因在家蚕中的表达

传染性法氏囊病病毒（IBDV）能引起以淋巴细胞衰竭为特征的抑制性疾病。IBDV的主要结构蛋白VP2蛋白是主要的宿主保护性抗原，在VP2上的点突变是造成IBDV抗原漂变的主要原因。为研究VP2作为IBDV亚单位疫苗的潜力，本实验将IBDV JD1株的VP2基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中，将重组载体pBacPAK-VP2与病毒Bm-Bac-PAK6的线性化DNA共转染家蚕培养细胞，获得重组病毒BacPAK-VP2。DIG点杂交表明重组病毒基因组中含有VP2基因。重组病毒感染家蚕5龄幼虫后，用ELISA、SDS－PAGE和Western blotting检测蚕血淋巴中重组VP2蛋白的相对表达量及免疫反应性。结果表明重组VP2蛋白具有免疫反应性，感染后5－6d在蚕血淋巴中的表达量最高。     

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在家蚕中表达人生长素

人生长素是由腺垂体分泌的一种在人体生长、发育及代谢中发挥重要作用的激素,具有广泛的生理作用。利用家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bac-to-Bac表达系统,将人生长素基因(hgh)克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,通过细菌转座子原理,转化BmDH10Bac细胞,获得重组穿梭载体质粒Bacmid-hgh,并将其转染家蚕BmN细胞,获得含有hgh的重组杆状病毒。将此重组病毒感染家蚕BmN细胞,收集重组病毒液并穿刺接种家蚕5龄起蚕,3 d后观察到家蚕感染了杆状病毒的症状,并通过SDS-PAGE和Western blotting方法在家蚕血液中检测到分子质量约20 kD的目的蛋白,表明人生长素通过Bac-to-Bac系统在家蚕体内获得了表达。     

低分子量尿激酶与Annexin V的融合基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

将低分子量尿激酶与膜联蛋白 (AnnexinV)的融合基因重组到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK UKAV ,并与线性化的病毒Bm PAK6DNA共转染家蚕细胞 ,获得重组病毒BacPAK UKAV。将重组病毒BacPAK UKAV感染家蚕培养细胞 (MOI=10 )和 5龄幼虫 (10 5pfu/头 ) ,Western印迹方法表明表达产物大小约为 6 9kD。用纤维蛋白平板溶圈法测定表达产物的纤溶活性 ,其融合蛋白具有明显的纤溶活性 ,约为 5× 10 -5U/个细胞。用APTT法测定表达产物的抗凝活性 ,比野生病毒Bm PAK6感染表达产物的APTT时间延长了 1倍以上 ,表现出明显的抗凝活性。体外实验表明 ,家蚕培养细胞和幼虫表达的重组低分子量尿激酶与AnnexinV融合蛋白具有溶栓与抗栓双功能。研究结果为今后进一步探索具有溶栓抗栓功能的血栓药物提供了新的方向。     

人白细胞介素-4基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

采用RT-PCR法从经LPS诱导刺激的人外周血淋巴细胞中克隆了人白细胞介素-4(human interleu kjn-4,hIL-4)基因。为高效表达hIL-4,促进其临床应用,将hIL-4插入家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,构建重组载体pBacPAK-hIL-4,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒BacPAK-hIL-4。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫和蚕蛹(1×10~5PFU/头),表达产物以ELISA、SDS-PAGE和Western blotting方法检测,用活化的人外周血T淋巴细胞测定表达产物体外生物活性。ELISA法结果表明hIL-4在感染病毒后96h的蚕血淋巴和120h的蚕蛹中表达量最高,分别达到2．3μg/mL蚕血淋巴和10．2μg/mL体液;SDS-PAGE、Western blotting分析表明表达产物分子量约20kD;表达产物对活化的T淋巴细胞增殖具有明显促进作用。     

轮状病毒结构蛋白VP4在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

轮状病毒(rotavirus,RV)是引起全球婴幼儿及幼畜非细菌性胃肠炎的主要病原体之一,VP4蛋白是轮状病毒的主要中和抗原。利用载体RD-BmBacmid与重组载体pBacPAK8-VP4共转染家蚕细胞BmN获得重组家蚕杆状病毒BmNPV-VP4,并用该病毒感染BmN细胞及家蚕5龄幼虫,从而在BmN细胞及家蚕中表达TB-Chen株轮状病毒的VP4蛋白。Western blotting检测到BmN细胞及家蚕幼虫血淋巴中均出现88 kD的特异性条带,证明VP4蛋白在BmN细胞和家蚕中获得了表达。ELISA检测结果显示,VP4蛋白在BmN细胞和家蚕幼虫血淋巴中的表达分别在感染后4 d和6 d达到最高水平,每个细胞和每mL血淋巴中的表达量分别为4.28 pg和1.61μg。研究结果为轮状病毒口服疫苗的研制奠定了基础。     

猪瘟病毒cF114株E2基因在家蚕杆状病毒表达系统中的融合表达

为进一步利用家蚕杆状病毒表达系统研制猪瘟病毒(CSFV)新型的亚单位疫苗,将猪瘟病毒cF114株囊膜糖蛋白E2基因克隆至带有GST标签的分泌表达杆状病毒转移载体pAcSecG2T的EcoRⅠ和BamHⅡ位点之间,获得了带有杆状病毒囊膜蛋白gp67信号肽-GST-E2元件的重组杆状病毒转移载体pAcSecG2T-E2,与线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,筛选重组病毒(Bm-BacPAK6-E2),PCR证实所分离的重组病毒含有目的片段E2基因。SDS-PAGE图谱显示,感染重组病毒后,在细胞培养液上清和家蚕幼虫、蛹的血淋巴中均可检测到一条分子量为63 kD左右的特异性条带;感染Bm-BacPAK6-E2家蚕蛹的血淋巴可检测到GST活性,接种病毒148 h后重组蛋白的表达水平达到17.11μg/mL。