水产品中溶藻弧菌基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱快速鉴定方法建立

目的建立水产品中溶藻弧菌的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的快速鉴定方法。方法以溶藻弧菌标准菌株(CICC 10889)为研究对象,采集不同样品处理方法 (直接涂抹法和甲酸提取法)、激光强度和菌株传代次数的MALDI-TOF MS图谱并加以分析比较,探讨上述因素对方法准确性的影响。将溶藻弧菌标准菌株(CICC 10889)的MALDI-TOF MS图谱主产物(MSP)添加到数据库中,使用36株分离菌株及8株与溶藻弧菌近缘的弧菌标准菌株验证数据库的补充对鉴定结果可信度的影响。结果甲酸提取法处理所得图谱特征峰多、基线平滑、信噪比高,图谱质量优于直接涂抹法;激光强度对MALDI-TOF MS图谱有影响,过高或过低均会导致图谱质量的下降;标准菌株补充数据库后可提高鉴定可信度,分离株的鉴定分值均达到2.300以上;传代次数对鉴定结果没有影响。结论 MALDI-TOF MS方法可将溶藻弧菌准确鉴定到种水平。该方法准确、可靠,可用于溶藻弧菌的快速鉴定。     

基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的 溶藻弧菌鉴定研究

目的建立快速检测和鉴定溶藻弧菌的方法,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDITOF-MS)和SARAMIS分析软件,对来自水产品中的溶藻弧菌进行了检测和鉴定。方法将从样品中分离得到的可疑菌落于37℃纯化培养24、48、72 h后,分别用微生物API生化鉴定系统和MALDI-TOF-MS方法进行分析鉴定,并对MALDI-TOF-MS鉴定方法的稳定性、准确性和重复性进行初步探讨。结果不同的培养时间,24、48和72 h对MALDI-TOF-MS检测的蛋白质谱图影响较小,鉴定值分别为94.10%,93.90%,92.70%;同时用微生物API-20E生化鉴定试剂盒进行辅助分析鉴定,培养24 h后,鉴定值为97.7%,T值为0.47,但培养72 h后,鉴定值为52.4%,T值为0.15。同一样品点样2次,得到的6张图谱显示出峰位置基本一致。用标准菌株大肠埃希菌ATCC 8739和溶藻弧菌ATCC 17749纯化培养24 h后,鉴定值分别为99.90%和97.60%。结论与传统的生化鉴定方法相比,MALDI-TOF-MS和SARAMIS软件分析方法具有较高的稳定性、重复性和准确性,可以快速、准确地鉴定溶藻弧菌,可用于水产品中溶藻弧菌的高通量、低成本的快速检测鉴定。     

海产品中溶藻弧菌的分离及多种方法鉴定效果的比较

目的了解北京市市售海产品中溶藻弧菌的污染情况,并对使用不同方法鉴定溶藻弧菌的效果进行比较。方法样品经碱性蛋白胨水增菌后,分别于硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖(TCBS)琼脂培养基和科玛嘉弧菌显色培养基上划线培养,实时荧光聚合酶链式反应(PCR)法鉴定可疑菌落。以rpoB基因测序方法为参考,比较了实时荧光PCR和VITEK两种方法的鉴定效果。结果对北京市水产品市场随机采集的116份海产品进行了检测,实时荧光PCR法鉴定出溶藻弧菌阳性样品95份,检出率高达82%。使用科玛嘉弧菌显色培养基的检出率高于TCBS培养基,分别为82%(95/116)和72%(83/116)。经rpoB基因核苷酸序列测定确定95株疑似菌株为溶藻弧菌。采用VITEK 2 COMPACT GN鉴定卡对这95株菌株进行鉴定,31株鉴定为溶藻弧菌,其余未能得到准确的鉴定结果。结论北京市市售海产品中溶藻弧菌检出率高。科玛嘉弧菌显色培养基比TCBS琼脂培养基更适于溶藻弧菌的分离,实时荧光PCR法的鉴定效果优于VITEK法。     

副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS检测方法的建立与应用

目的:建立快速检测副溶血性弧菌基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测方法。方法:考察培养基、培养时间、培养温度以及样品前处理方法对图谱质量和鉴定结果的影响,对方法的稳定性、重复性进行研究;采集461株副溶血性弧菌食品分离株MALDI-TOF-MS指纹图谱,并对图谱进行分析。结果:采用2%NaCl-TSA培养基,在37℃,24 h条件下培养,可达到强峰值信号,谱图重现性良好,甲酸-乙腈提取法获得的质谱图特征峰多,信噪比高;461株副溶血性弧菌食品分离株有97.6%的菌株鉴定分值大于2.000。结论:本研究建立的副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS鉴定方法结果准确,可用于实际检测。     

中国内陆6省(自治区)淡水鱼养殖、销售和餐饮环节常见嗜盐性弧菌污染调查

目的了解内陆6省(自治区)淡水鱼养殖、销售、餐饮环节鱼、水体、水底沉积物等样品中副溶血性弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌的污染状况,明确淡水鱼养殖、销售、餐饮各环节中3种嗜盐性弧菌的分布。方法在广西、河南、湖北、山东、四川、浙江6个省(自治区)的内陆地市设置采样点,采集养殖场、销售场所、餐馆的鱼样及存养鱼的对应水样。采用传统的分离培养技术检测3种嗜盐性弧菌,并进行生化鉴定。结果养殖环节水体和淡水鱼中副溶血性弧菌的检出率分别为1.89%(5/264)、5.81%(14/241),溶藻弧菌检出率分别为1.89%(5/264)、4.98%(12/241),创伤弧菌检出率分别为1.14%(3/264)、0.83%(2/241);3种嗜盐性弧菌的污染率在流通环节增高,存养水体和淡水鱼的检出率分别为副溶血性弧菌18.47%(29/157)、14.93%(40/268),溶藻弧菌10.83%(17/157)、9.70%(26/268),创伤弧菌3.18%(5/157)、3.36%(9/268);餐饮环节淡水鱼中嗜盐性弧菌的检出率与流通环节基本一致。结论传统意义上海水中常见的副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌3种嗜盐性弧菌已经在内陆地区的淡水养殖、流通和餐饮各个环节中检出,尤其是淡水养殖环境中嗜盐性弧菌的出现可能对整个食物链产生的影响值得关注。     

海产品中溶藻弧菌的筛选及其致病因子的研究

溶藻弧菌能引起人类食物中毒.溶血毒素、耐热性肠毒素(ST)和不耐热性肠毒素(LT)是致病性微生物中常见的致病因子.本文对从扇贝、牡蛎、贻贝、沙虾、虾蛄等海产品中筛选的溶藻弧菌的种属和致病因子进行了研究,生化鉴定显示分离到的两株溶藻弧菌来源不同,基因测定显示它们同属于溶藻弧菌(V. alginolyticu s);血琼脂平板法、兔小肠结扎法和乳鼠灌胃法显示来源不同的溶藻弧菌其产毒种类也不同,两株溶藻弧菌都能产生不耐热性肠毒素(LT)和耐热性肠毒素(ST),但只有1株能产生溶血毒素.     

微滴式数字聚合酶链式反应定量检测水产品中溶藻弧菌

目的建立水产品中溶藻弧菌微滴式数字聚合酶链式反应(ddPCR)快速定量检测方法。方法采用SN/T 1870—2016《出口食品中食源性致病菌检测方法实时荧光PCR法》中溶藻弧菌的引物探针,建立优化ddPCR反应体系,梯度稀释溶藻弧菌纯培养液,确定ddPCR方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ);通过人工添加试验,比较ddPCR与实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)方法定量的准确性,以验证ddPCR方法用于检测水产品中溶藻弧菌的可行性。结果所建立的水产品中溶藻弧菌ddPCR检测方法经过溶藻弧菌标准菌株、分离菌株以及其他近源菌株验证,具有良好的特异性;纯培养的LOD和LOQ一致,均为2.2拷贝/反应,相当于110 CFU/ml纯菌液,定值结果与传统平板计数方法相差0.04个对数值。在人工污染模拟试验中ddPCR的定量结果较qPCR更接近理论添加值,检测重复性以及对低浓度样品的检出情况也均优于qPCR。ddPCR对人工污染样品的LOQ可达120拷贝/g。结论溶藻弧菌ddPCR定量检测方法特异性好、灵敏度高、结果准确,可为快速定量检测溶藻弧菌提供参考。     

海水中溶藻弧菌的分离、鉴定及其耐药性分析

用无菌采样器在上海临港海域采集100份海水,经过增菌培养和选择性分离后,进行3种生理生化鉴定和PCR鉴定,共得到33株溶藻弧菌.采用优化的K-B法测定分离菌株对20种抗生素的耐药性,结果表明:溶藻弧菌对四环素的耐药性最高(100.0％),其次是氨苄青霉素(97.0％)和羧苄青霉素(93.9％);对头孢吡肟、安曲南、红霉素、环丙沙星、诺氟沙星和氯霉素敏感.本次分离的溶藻弧菌具有严重的多重耐药性,所有分离菌均对3种及3种以上抗生素多重耐药,同时对6种及6种以上抗生素耐药的有15株(45.5％),同时对8种及8种以上抗生素耐药的有6株(18.2％).本次关于溶藻弧菌对抗生素的耐药性分析结果可以为食源性疾病控制提供参考依据,同时为溶藻弧菌的耐药机制的研究奠定理论基础.     

北京市市售带壳牡蛎致病性弧菌污染状况调查

目的了解北京市市售带壳牡蛎致病性弧菌污染状况。方法 2014年2~11月每月在某水产品批发市场的摊位抽样200只带壳牡蛎,共80份样品(其中腮和肠样品分别为40份)。用常规培养方法检测牡蛎腮和肠(含便)中致病性弧菌,对副溶血性弧菌进行血清学分型,荧光定量PCR检测副溶血性弧菌毒力基因tdh、trh和tlh。结果 80份牡蛎样品中,致病性弧菌阳性样品检出率为62.50%(50/80),副溶血性弧菌阳性菌株检出率为33.75%(27/80),溶藻弧菌阳性菌株检出率为31.25%(25/80);各牡蛎腮和肠样品中,致病性弧菌阳性检出率为67.50%(27/40)和57.50%(23/40);27株副溶血性弧菌共9种血清型;毒力基因检测结果表示,tlh均为阳性,tdh和trh均为阴性。结论北京市市售带壳牡蛎中致病性弧菌污染严重,以副溶血性弧菌和溶藻弧菌检出为主。     

动物性海产品中溶藻弧菌检验方法的初探

试验通过总结国内外动物性海产品中溶藻弧菌的研究进展和监测方法,以10%氯化钠碱胨水(APW)和弧菌显色为培养基,经过分离和培养溶藻弧菌,创建动物海产品溶藻弧菌检验方式,进一步监测动物海产品及食品中毒样本中溶藻弧菌,促使动物海产品安全性和品质的提高。     

副溶血性弧菌鉴定能力验证样品的制备

目的 研制适用于副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus,VP)能力验证(PT)项目的VP菌及干扰菌的冷冻干燥样品,建立有效的样品制备与评估流程.方法 通过不同比例混匀的VP和干扰菌拟态弧菌(Vibrio minicus,VM)经冻干后在鉴定培养基上菌落生长优势比,确定制备PT样品的混合菌VP和VM的浓度比例;通过系统抽样和鉴定以评估样品的均一性;通过观察样品在180 d保存期内菌量的变化情况以评估样品的稳定性;根据188间检测实验室反馈的鏊定结果以评估和计算样品的实际合格率.结果 选择5 000:1比例制备的VP和VM混合PT样品能在鉴定培养基有效分离两种菌落;抽检的40份样品均能有效鉴定,显示PT样品具有较好的一致性;通过保存温度和时间的稳定性实验显示,PT样品在36℃下能稳定保存5d,冻干后PT样品于4℃保存180 d后VP菌仍能检出;188家参与实验室检测结果显示,PT样品合格率为97.3％.结论 本研究制备的冻干PT样品及实验流程控制适用于副溶血性弧菌及类似的微生物鉴定能力验证项目.     

副溶血性弧菌多克隆抗体制备及应用

以热灭活副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP ATCC17802)免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,用间接酶联免疫吸附法测定抗血清效价,纯化后的多克隆抗体效价为512000。该抗体与5株副溶血性弧菌均能特异性结合,但与其他12株非副溶血性弧菌无交叉反应。在此基础之上建立了间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA),并优化了抗原抗体浓度、二抗浓度、封闭液等条件。结果表明,该法的线性范围为5×10^4~107CFU/m L,线性回归方程为y=0.21x-0.74(R2=0.99),IC50为106CFU/m L,最低检出限为1.7×10^4CFU/m L,板内变异系数为2.61%~4.15%,板间变异系数为4.71%~8.74%。用建立的ic-ELISA检测市场中鱼、贝类养殖水和实验室用水中的VP,实验结果与国标检测方法的结果一致。该方法快速便捷,灵敏度高,准确性好,为进一步研究VP的快速检测奠定了基础。     

两起副溶血性弧菌食物中毒血清学溯源结果分析

目的 对两起副溶血性弧菌(VP)引起的食物中毒进行血清学溯源,分析可疑食品和病人样品中菌株血清型之间的关系.方法 依据GB/T4789.7-2008方法,对检出的VP做血清分型、溶血素试验;PCR扩增VP直接耐热溶血素基因(tdh)、tdh相关溶血素基因(trh)和毒素调控基因(toxR).结果 通过增加样品中可疑菌落数量的鉴定,两起食物中毒共检出9种VP血清型,主要有O3∶K6型13株,O2∶K28型6株,O1∶K56型2株,其它各1株;两起食物中毒中分离的27株VP有17株tdh基因检测阳性,与溶血试验结果一致.结论 增加可疑菌落数鉴定,有助于VP食物中毒的溯源;虽然O3∶ K6血清型是引起食物中毒的主要病原菌,但不同样品来源的VP血清型呈现多样性;副溶血性弧菌tdh基因检测等同于溶血试验来鉴定VP致病性.     

荧光PCR检测副溶血性弧菌致病基因方法的建立

建立一种准确、快速、特异地检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)致病基因的荧光PCR方法。方法 用7株已知其致病基因的VP标准菌株和检出菌分别对6种VP致病基因荧光PCR检测文献方法和本文建立的方法进行验证比较,并用6种常见食源性病原菌对新建方法的特异性进行检验。结果 所建方法能够同时检测VP的3种溶血素,其检测结果与菌株的溯源结果及普通PCR结果完全一致,且与常见食源性病原菌无交叉反应。结论 本文建立的荧光PCR体系能够准确、快速、特异地检测VP的致病基因,具有较好的实用性。     

食源性副溶血性弧菌的检测方法研究进展

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是一种食源性致病菌,由其引发的食品安全事件已跃居我国食源性致病菌中毒数量首位。目前检测食品中致病微生物的方法主要有:传统生化培养方法、以抗原抗体反应为基础的免疫学检测方法、以PCR为基础的DNA分子检测方法等。本文总结了当前VP主要检测方法,包括免疫磁珠分离、酶联免疫吸附反应、免疫层析测试、免疫传感器、PCR技术、环介导等温扩增技术、DNA适配体传感器、DNA杂交技术等,以期为VP的快速检测方法提供借鉴和参考。     

水产品中副溶血性弧菌实时荧光PCR检测方法

建立了一种特异、灵敏、稳定的副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus,VP)致病基因的检测方法。对已建立的副溶血性弧菌致病基因tdh、trh和tlh荧光PCR方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测,以验证该方法的有效性。该方法与副溶血性弧菌反应良好,与其他弧菌属和非弧菌属的6株常见食源性致病菌无交叉反应;检测了6株副溶血性弧菌标准菌株和分离株,3种致病基因检出限分别为tlh 6～43 CFU/mL,tdh 97～1 700 CFU/mL,trh 1 100～4 000 CFU/mL;3种致病基因20次重复组内变异系数在0.96%～1.50%,组间变异系数在2.70%～4.10%。该方法操作简便,特异性强,灵敏度高,能够准确、快速、灵敏地检测水产品中副溶血性弧菌。     

免疫学方法在食源性副溶血性弧菌检测中的应用研究进展

副溶血性弧菌可污染以海产品为主的各类食品,其引发的食品安全事件数量已经跃升至我国食品中毒事件数首位。相对于传统培养法及现代分子检测技术,基于抗原-抗体特异性识别反应的免疫鉴定及分型策略在检测效率、特异性、现场适用性、前处理简便性等诸多方面显现突出优势。本文在解析当前副溶血性弧菌抗体种类及制备方法的基础上,就免疫磁珠分离、酶联免疫吸附测定、免疫层析测试、免疫传感器、免疫荧光显微术等方法在食源性副溶血性弧菌检测中的应用现状进行综述,以期为该病原菌的快速检测提供借鉴和参考。     

广州市市售动物性淡水产品副溶血性弧菌污染状况分析

目的了解广州市市售动物性淡水产品副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)污染状况。方法2006～2019年,根据国家、省、市食品安全风险监测工作方案,共采集966份动物性淡水产品,开展VP检测。结果VP总体检出率为21.84%(211/966)。不同季节、不同采样地点、不同种类、不同加工售卖方式淡水产品VP检出率差异均有统计学意义。其中,第3季度VP检出率最高,为27.40%;超市VP检出率最高,为32.73%;甲壳类中淡水蟹VP检出率最高,为53.33%;生鲜类VP检出率最高,为27.23%。结论广州市市售动物性淡水产品不同程度受到VP污染,应加强整个产业链综合监管,积极开展健康宣教及食品安全风险预警。