小干扰RNA对大鼠T淋巴细胞CD28基因表达的抑制作用

目的探讨小干扰RNA(siRNA)对大鼠T淋巴细胞共刺激分子CD28基因表达及干扰后的T细胞的功能的影响。方法设计针对目标基因的siRNA,转染大鼠T淋巴细胞,逆转录-聚合酶链反应((RT_7PCR)方法检测CD28 mRNA水平,MLR检测转染后的T淋巴细胞的增殖能力,ELISA法检测细胞因子水平。结果siRNA转染大鼠T淋巴细胞后,抑制CD28分子的表达,半定量RT-PCR检测显示T淋巴细胞CD28的mRNA均有明显的下降,siRNA转染48 h后,siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4组CD28基因表达均受到抑制,其抑制率最高为(88.56±4.70)%,T细胞增殖能力、IL-2,IFN-γ水平明显低于对照组。结论siRNA可以特异性抑制大鼠T淋巴细胞共刺激分子CD28基因的转录和表达,降低大鼠T细胞的增殖能力,抑制了IL-2,IFN-γ细胞因子的分泌水平。     

RNA干扰抑制大鼠T淋巴细胞CD28基因表达的实验研究

目的：探讨RNA干扰（RNAi）后对大鼠T淋巴细胞共刺激分子CD28基因的表达及其对细胞功能的影响。方法：设计针对目标基因的小干扰RNA（siRNA）,转染大鼠T淋巴细胞。以FCAS检测CD28水平,MTT检测转染后T淋巴细胞对异体淋巴细胞增殖能力的影响。Reahime-PCR及ELISA法检测细胞因子水平。结果：siRNA转染大鼠T淋巴细胞后可抑制CD28的表达,T细胞增殖能力、IL-2、IFN-γ平明显低于空白对照组（P〈O．05）。结论：siRNA可特异性抑制大鼠T淋巴细胞共刺激分子CD28的表达,降低大鼠T细胞的增殖能力,抑制IL-2、IFN-γ细胞因子的基因水平表达和分泌水平．从而产生免疫耐受效应,为器官移植免疫研究提供实验依据。     

CD4+CD25+T细胞联合CD154单抗抑制大鼠肝移植急性排斥反应的研究

目的探讨CD4 CD25 T细胞联合应用CD154单抗在抑制大鼠肝移植急性排斥反应中的作用。方法分离Lewis大鼠脾脏CD4 _CD25 T细胞后与DA大鼠脾细胞单向混合淋巴细胞反应行体外激活。用"二袖套法"行DA到Lewis的原位肝移植48例。A组为对照组;B、C组单独术前回输体外激活的CD4 CD25 T细胞或术后腹腔注射抗CD154单抗;D组联合应用CD4 CD25 T细胞和CD154单抗。每组大鼠12对。术后7 d各组处死6只受体,检测移植肝内T细胞亚群和细胞因子水平。余大鼠观察生存情况,死亡大鼠观察移植肝病理变化。结果D组受体生存期(52.00±10.64)d明显长于B、C组(P<0.01);移植肝内CD4 CD25 T细胞比例(16.43±4.28)%明显高于B、C组(P<0.05、P<0.01),而淋巴细胞浸润数量[(3.47±1.21)%×106]和(CD8 T细胞百分比(14.19±3.02)%明显低于B、C组(P<0.05、P<0.01);移植肝内白细胞介素- 2(IL-2)水平(6.44±1.83)ng/L低于B、C组(P<0.05),IL-10(43.72±7.55)ng/L和转化生长因子-β1(TGF-β1)(270.06±46.91)ng/L明显高于B、C组(P<0.05、P<0.01)。结论联合应用CD154单抗能明显增强CD4 CD25 调节性T细胞对大鼠肝移植急性排斥反应的抑制作用。     

转染IL-12p35siRNA的供者树突状细胞延长大鼠移植小肠的存活时间

目的探讨转染IL-12p35siRNA的供者树突状细胞(DC)对大鼠移植小肠存活时间的影响。方法在体外以IL-12p35siRNA转染Wistar大鼠骨髓来源的DC,用逆转录聚合酶链反应测定转染细胞IL-12p35mRNA的表达,进行混合淋巴细胞反应,观察DC对SD大鼠T淋巴细胞的刺激作用。制作Wistar大鼠到SD大鼠的节段小肠异位移植模型,转染组小肠移植前7 d经阴茎背静脉给受者注射转染IL-12p35siRNA的DC 4×106个/只;未转染组移植前7 d注射未转染的DC 4×106个/只;对照组注射生理盐水。术后观察受者的存活时间,移植小肠进行组织病理学检查,应用酶联免疫吸附试验检测受者血清中白细胞介素2(IL-2)和γ干扰素(IFN-γ)的水平。结果DC转染IL- 12p35siRNA后,IL-12p35mRNA的表达明显降低,其刺激T淋巴细胞增殖的能力降低(P<0.01)。转染组受者小肠移植后的存活时间为(16.63±3.38)d,明显长于对照组和未转染组(P<0.01);转染组移植小肠组织中仅有炎症细胞浸润、黏膜层肿胀,绒毛腺体结构和肌层破坏程度较对照组和未转染组明显减轻;术后第10天,转染组的血清IL-2浓度为(175.8±11.5)ng/L,IFN-γ浓度为(70.6±7.2)ng/L,均显著低于对照组和未转染组(P<0.05)。结论转染IL-12p35siRNA,在体外可减轻DC对T淋巴细胞的刺激作用,在体内可抑制大鼠小肠移植后的排斥反应,延长移植小肠的存活时间。     

利用RNA干扰诱导产生的CD8+CD28-抑制性T淋巴细胞的免疫学特性

目的 探讨通过RNA干扰技术诱导产生的CD8+ CD28-抑制性T淋巴细胞(Ts细胞)的免疫学特性.方法 取SD大鼠骨髓,培养分离树突状细胞(DC),设计、合成主要组织相容性复合物(MHC)Ⅰ类小片段干扰RNA(siRNA),以MHC Ⅰ siRNA转染DC.先以Wistar大鼠肠系膜淋巴组织液刺激转染MHCI siRNA的DC,然后将DC与从SD大鼠脾脏分离得到的CD8+T淋巴细胞共同培养,通过磁珠法分离出Ts细胞.分别在由SD大鼠脾脏淋巴细胞(反应细胞)和Wistar大鼠肠系膜淋巴组织细胞(刺激细胞)组成的混合淋巴细胞培养体系中加入数量不等的Ts细胞,检测反应细胞增殖情况;分别以Wistar大鼠肠系膜淋巴组织细胞和卵白蛋白(OVA)刺激SD大鼠脾脏淋巴细胞,然后再按不同比例加入Ts细胞,检测各组脾脏淋巴细胞的增殖情况;在由SD大鼠脾脏淋巴细胞、Wistar大鼠肠系膜淋巴组织液和Ts细胞组成的混合淋巴细胞培养体系中加入可溶性重组白细胞介素2(rrIL-2),观察IL-2对Ts细胞功能的影响;采用实时定量聚合酶链反应(PCR)测定Ts细胞中转化生长因子β(TGF-β和γ干扰素(IFN-γ)mRNA的表达,流式细胞仪和实时PCR检测Ts细胞上CD25分子的表达.结果 Ts细胞对SD大鼠脾脏淋巴细胞和Wistar大鼠肠系膜淋巴组织细胞之问的混合淋巴细胞反应(MLR)具有抑制作用,但对于SD大鼠脾脏淋巴细胞和OVA之间的MLR则无抑制作用.在SD大鼠脾脏淋巴细胞、Wistar大鼠肠系膜淋巴组织液和Ts细胞组成的混合淋巴细胞培养体系中加入rrIL-2后,SD大鼠脾脏细胞的增殖并无明显增加(P＞0.05).与CD8+CD28+T淋巴细胞和CD8+ T淋巴细胞比较,Ts细胞的TGF-β和IFN-γ mRNA的表达量明显升高(P＜0.01,P＜0.05),而CD25的表达量明显降低(P＜0.05).结论 采用经MHC I siRNA干扰的DC能够诱导CD8+T淋巴细胞产生CD8+ CD28-Ts细胞;Ts细胞在体外具有免疫抑制特性,其免疫抑制作用不被外源性IL-2所逆转,且其免疫调节作用具有抗原特异性.     

大鼠树突状细胞CD86分子小干扰RNA慢病毒载体构建及其功能

目的 观察针对大鼠树突状细胞(DCs)表面共刺激分子CD86的小干扰RNA(siRNA)慢病毒载体转染骨髓来源大鼠DCs后,CD86分子mRNA水平变化及DC刺激T淋巴细胞增殖能力的变化.方法 将针对大鼠DCs表面共刺激分子CD86的siRNA慢病毒载体转染骨髓来源大鼠DCs,逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)方法 检测CD86分子mRNA水平,MLR检测转染后的树突状细胞刺激T淋巴细胞增殖能力的变化.结果 转染组CD86分子mRNA水平较未转染组及阴性对照组有明显下降.MLR中各实验组DC与细胞1:1、1:10、1:50混合72 h后492 nm吸光度值分别为,未转染组:0.876±0.117、0.582±0.085、0.472±0.034;阴性对照组:0.870±0.140、0.541±0.066、0.438±0.067;转染组:0.394±0.143、0.294±0.032、0.218±0.015.表明转染后的DCs刺激T淋巴细胞增殖的能力较未转染组及阴性对照组显著降低.结论 实验所用针对CD86分子的siRNA慢病毒载体,可以特异性的抑制大鼠树突状细胞CD86基因的表达,降低树突状细胞对T淋巴细胞的刺激增殖能力.     

共刺激后淋巴细胞产生Th1/Th2细胞因子的变化及免疫抑制剂的影响

目的 探讨CD28、CD40通路共刺激后淋巴细胞产生Th1(IL-2、IFN-γ、IL-12)及Th2细胞因子(IL-4、IL-10)的变化及免疫抑制剂环孢素(CsA)、雷帕霉素(RPM)及霉酚酸(MPA)对共刺激通路激活后淋巴细胞产生Th1及Th2细胞因子的影响.方法采用单克隆抗体(mAb)与淋巴细胞表面CD3、CD28及CD40L分子结合产生相应刺激信号,单刺激及共刺激组分为:a组,CD3 mAb单刺激;b组,CD3 mAb加CD28 mAb共刺激;c组,CD3 mAb加CD28 mAb加CD40 L mAb共刺激;d组,CD3 mAb加CD28 mAb加CTLA4 mAb共刺激.各mAb的终浓度均为100 ng/ml.干预组分别将终浓度为300 ng/ml的CsA、RPM、MPA加入上述4组.ELISA法测定上述细胞培养上清中的细胞因子值.结果 a、b、c 3组IFN-γ分别为(248.91±11.20)、(555.08±24.42)、(548.19±33.06)ng/ml,IL-2分别为(29.48±8.61)、(1100.82±99.29)、(842.23±29.31)ng/ml,IL-4分别为(32.29±6.76)、(116.02±15.03)、(147.28±18.07)ng/ml,IL-10分别为(147.01±10.47)、(291.79±12.47)、(302.52±35.18)ng/ml.b、c组与a组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01);b、c组IL-2、IL-12、IL-4比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).d组IFN-γ、IL-2及IL-10分别为(497.42±29.03)、(739.77±18.58)及(120.33±13.21)ng/ml,与b组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).CsA、RPM及MPA对共刺激后Th1/Th2细胞因子的产生均有抑制作用,CsA对4种细胞因子产生的抑制作用强于RPM和MPA,其中对IL-2及IL-4的抑制作用更为明显.CsA与CTLA4 mAb有协同作用.共刺激后IL-12产生升高,MPA可抑制单刺激和共刺激后IL-12的产生,CsA和RPM对IL-12的产生无明显抑制作用.结论 CD28、CD40共刺激通路在淋巴细胞活化中起关键作用.CsA、RPM、MPA及CTLA4 mAb对共刺激后Th1/Th2细胞因子的产生均有抑制作用,CsA的抑制作用更为明显.CD40 L mAb使Th1细胞因子及IL-12水平下降,又促进Th2细胞因子(以IL-4为主)产生,该作用可能是抗CD40 L抗体诱导移植物存活期延长的机制之一.     

针对OX40小于扰RNA供体转染抗大鼠肝移植排斥反应

目的 观察RNA干扰阻断OX40-OX40L共刺激通路对大鼠移植肝存活时间的影响.方法 制作DA大鼠到Lewis大鼠的原位肝脏移植模型,移植前取预先制备的5 ml含5×109pfu的pLVTHM-OX40-siRNA重组慢病毒,灌注感染移植供肝30 min,术后观察受者存活时间,移植肝脏进行组织病理学检查;采用ELISA法检测大鼠外周血IL-2,IFN-γ,的水平,并进行受者大鼠脾细胞对供者大鼠脾细胞的混合淋巴细胞反应(MLR).结果 转染组受者肝脏移植物的存活时间为(74.00±3.79)d,明显长于对照组和未转染组;转染组移植肝组织炎细胞侵润、间质水肿、肝组织坏死程度较对照组和未转染组减轻,实验组大鼠脾细胞刺激T淋巴细胞增殖的能力降低(P<0.01);移植术后的第7天,转染组血清IL-2浓度为(46.0±8.4)ng/L,IFN-γ浓度为(202.7±14.6)ng/L,均显著低于对照组和未转染组(P<0.05).结论 转染靶向OX40的siRNA,在体内可通过阻断OX40-OX40L共刺激通路,抑制大鼠肝脏移植后的排斥反应,延长大鼠移植肝的存活时间.     

人CD8+CD28-抑制性T淋巴细胞的体外扩增及其抗原特异性调节作用

目的 探讨在体外大量扩增CD8+CD28-抑制性T淋巴细胞(Ts细胞)的方法,并检验其免疫调节作用.方法 分离健康志愿者全血中CD8+T淋巴细胞,在含不同细胞因子和异体抗原提呈细胞(APC)的培养条件下进行体外扩增.应用流式细胞术对扩增过程中CD28 -细胞亚群的比例进行监测.分为3组进行混合淋巴细胞培养,反应细胞均为CD4+T淋巴细胞:B-APc组以来源于原致敏供者的APC作为刺激细胞,I-APC组以HLA-A、B、DR全错配的无关供者的APC作为刺激细胞,Dynabeads组以包被有抗CD3和CD28单克隆抗体的免疫微球Dynabeads作为刺激细胞;扩增后的Ts细胞作为第三方调节细胞加入混合淋巴细胞培养中,测定其对CD4+T淋巴细胞增殖的抑制作用.结果 在含白细胞介素2(IL-2)+ IL-7+ IL-15的培养条件下,CD8+T淋巴细胞培养后CD8+CD28-T淋巴细胞亚群的比例最高(P＜0.05).B-APC组不加入Ts细胞时,增殖的CD4+T淋巴细胞比例为66.7％,当加入的Ts细胞与反应细胞的比例分别为0.5∶1、0.1∶1和0.02∶1时,增殖的CD4+T淋巴细胞比例分别为16.5％、34.1％和62.6％.Ts细胞对CD4+T淋巴细胞的增殖有明显抑制作用,而在I-APC组和Dynabeads组中,此抑制作用不明显.结论 应用含IL-2+ IL-7+ IL-15的培养条件联合异体APC刺激可以在体外大量扩增Ts细胞,扩增所得Ts细胞在体外对供者CD4+T淋巴细胞的增殖有明显抗原特异性抑制作用.     

转染ERα基因对MDA-MB-231乳腺癌细胞白细胞介素-8表达的影响

目的 通过转染GFP-C1-ERα质粒建立稳定表达ERα的MDA-MB-23l细胞株,观察ERα对该细胞株白细胞介素(IL)-8表达的影响.方法 pEGFP-C1-ERα质粒经酶切和测序后转染MDA-MB-231细胞,使用G418筛选出稳定表达的克隆并鉴定.使用荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别测定稳定转染ERα的MDA-MB-231细胞、MDA-MB-231细胞及MCF-7细胞的IL-8mRNA的表达,使用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定细胞上清液IL-8的浓度.结果 成功建立ERα阳性表达的MDA-MB-231细胞株,转染ERα的细胞株IL-8 mRNA的合成(105±16)ng/L明显低于MDA-MB-231细胞(195±32)ng/L(P<0.05),但仍然高于MCF-7细胞(32±4)ng/L(P<0.05),转染后细胞上清液IL-8浓度较未转染细胞明显降低,分别为(3499±312)ng/L和(6788±427)ng/L(P<0.05),但仍然高于MCF-7细胞(1846±44)ng/L(P<0.05).结论 稳定转染ERα基因抑制了MDA-MB-231细胞的IL-8的合成和分泌.     

靶向OX40基因的siRNA抑制大鼠肝脏移植排斥反应的研究

目的 探讨RNA干扰阻断OX40-OX40L共刺激通路对大鼠移植肝存活时间的影响.方法 制作原位肝脏移植物大鼠模型,供体DA大鼠,受体Lewis大鼠.移植术毕时将5 ml含5×109pfu的pLVTHM-OX40-siRNA重组慢病毒经阴茎背静脉在10秒内注射受鼠体内,术后观察受鼠存活时间,移植肝脏进行组织病理学检查,采用ELISA法检测大鼠外周血IL-2、IFN-γ的水平,并进行受者大鼠脾细胞对供者大鼠脾细胞的混和淋巴细胞反应(MLR). 结果转染组大鼠肝脏移植物的存活时间为(74.0±9.3)d,明显长于对照组(7.3±0.5)d和未转染组(7.5±0.5)d;转染组移植肝组织炎细胞浸润、间质水肿、肝组织坏死程度较对照组和未转染组减轻;耐受组大鼠脾脏中T淋巴细胞刺激T淋巴细胞增殖的能力较对照组降低(t=25.1,P＜0.01);移植术后第7 d,转染组血清IL-2浓度为(46±8.4)pg/ml,IFN-γ浓度为(202.7±14.6)pg/ml,均显著低于对照组和未转染组(分别t=176.4,45.5,P＜0.01).结论 转染靶向OX40的siRNA,可通过阻断OX40-OX40L共刺激通路,抑制大鼠肝脏移植后的排斥反应,延长大鼠移植肝的存活时间.     

RNA干扰阻断OX40/OX40L共刺激通路对CD4+CD25+T调节细胞的影响

目的 探讨慢病毒介导的RNA干扰技术诱导小鼠树突状细胞OX40L基因沉默对调节性T细胞的影响. 方法 设计针对小鼠OX40L基因的RNA于扰序列,通过外源筛靶筛选出干扰效果最佳的序列.以293T为包装细胞,制备含OX40L的siRNA序列的慢病毒载体OX40L-RNAi-LV和阴性对照载体NC-GFP-LV.采用磁式分选器分离培养骨髓来源的小鼠树突状细胞(DCs),以MOI为25进行转染,分别将转染OX40L-RNAi-LV(实验组)、转染NC-GFP-LV(阴性对照组)和未转染(空白对照组)的DCs与磁式分选器分选得到的CD4+CD25+T调节细胞共培养,6 d后通过流式细胞仪检测T调节细胞的增殖和凋亡情况. 结果外源筛靶筛选出干扰效果最佳的RNA干扰序列(靶序列为GCTCATACAAGAATGAGTA),OX40L蛋白表达的抑制率为73.1%.感染复数为25时,慢病毒载体感染DCs的效率为86.4%.DCs与CD4+CD25+T调节细胞共培养后,实验组的凋亡细胞比例为8.7%,显著低于阴性对照组(20.1%)和空白对照组(19.8%),F=244.22,P=0.000;而增殖细胞前体频率为38.3%,明显高于阴性对照组(24.5%)和空白对照组(22.9%),F=95.40,P=0.000.结论 小鼠OX40L的siRNA慢病毒载体可以有效降低树突状细胞OX40L的表达,对体外培养的CD4+CD25+T调节细胞具有显著地促进增殖、减少凋亡的作用.     

协同信号途径阻断和供体脾细胞输注诱导预存同种记忆性T淋巴细胞大鼠心脏移植物的耐受

目的 联合阻断OX40/OX40L和CD28/B7双协同信号途径和供体特异性脾细胞输注,诱导预存同种反应性记忆T淋巴细胞大鼠对同种心脏移植物的耐受.方法 建立大鼠预存同种反应性记忆T淋巴细胞的移植模型,采用免疫磁珠法分选CD8+CD44-记忆性T细胞;对过继转移供体特异性CD8+记忆性T细胞3 d的Lewis大鼠分别/合并输注AdCTLA4Ig、AdOX40Ig、供体脾细胞(DST),同时移植来至DA大鼠的心脏;48 h后取出心脏进行组织学分析、细胞因子表达分析,同时观察不同处理移植心脏存活时间.结果 AdCTLA4Ig+AdOX40Ig+DST组分别与AdCT-LA4Ig,AdOX40Ig和DST比较,心脏组织病理级别较低,白细胞介素(IL)-2及干扰素(IFN)-γ的表达水平也明显比其他组低很多,而心脏存活时间显著延长.结论 联合阻断OX40/OX40L和CD28/B7和供体特异性脾细胞输注能较好地诱导大鼠心脏移植物耐受.     

抑制记忆性T淋巴细胞共刺激分子OX40延长小鼠胰岛移植物的存活时间

目的 观察抑制记忆性T淋巴细胞共刺激分子OX40延长胰岛移植小鼠存活时间的作用,探讨其作用机制.方法 采用免疫磁珠法制备初始性、类记忆性及记忆性CD8+T淋巴细胞,并采用逆转录聚合酶链反应法检测3种T淋巴细胞上OX40的表达量.将C57BL/6小鼠脾脏T淋巴细胞经尾静脉注射给Rag-/-小鼠.将Rag-/-小鼠分为3组,对照组:给予同型IgG;治疗组:给予抗OX40L单克隆抗体;基因敲除组:输注的T淋巴细胞由OX40基因敲除的C57BL/6小鼠供给.T淋巴细胞输注6周后,使用链脲霉素诱导建立糖尿病模型,然后以DBA/2小鼠为供者,进行胰岛移植,移植后观察和比较3组间胰岛移植物的存活时间.结果 OX40在初始性、类记忆性和记忆性T淋巴细胞上的相对表达量分别为2.87、111.24和146.15,类记忆性和记忆性T淋巴细胞间OX40表达量的差异无统计学意义(P＞0.05),但均显著高于初始性T淋巴细胞(P＜0.01).对照组、治疗组和基因敲除组胰岛移植物的存活时间分别为21、130和125 d,治疗组和基因敲除组间胰岛移植物存活时间的差异无统计学意义(P＞0.05),二者均显著长于对照组(P＜0.05).结论 OX40在记忆性T淋巴细胞表面高表达,且阻断OX40共刺激分子通道可明显延长胰岛移植物的存活时间,抑制OX40/OX40L共刺激通道可能是诱导胰岛移植免疫耐受的关键点之一.

Abstract：

Objective To investigate the role of OX40 in the mechanisms of memory T cells in islet transplant tolerance.Methods The expression of OX40 on native, like memory and memory CD8+T cells was detected by RT-PCR. Splenic T cells from B6 mice were injected into Rag-/- mice via the tail vein, and the Rag-/- mice were divided into three groups (n=8 each): control group, given IgG; treatment group, given anti-OX40L; and OX40 knock-out group, given T cells from OX40 knock-out B6 mice spleen. All recipients were induced into diabetes mellitus model after adoptive transfer. Islet transplantation was performed on all Rag-/- mice as recipients. The mean survival time of islet was observed.Results The expression of OX40 in native T cells, like memory T cells and memory T cells was 2.87, 111.24 and 146.15 respectively. The expression of OX40 in like memory and memory T cells was higher than in native T cells (P<0.05). Comparison with control group , The mean survival time of the DBA/2 islet allografts in treatment group (130 days) and OX40 knock-out group (125 days) was significantly longer than in control group (21 days, P<0.05).Conclusion The OX40 expression is high in memory T cells. The mean survival time of the islet allografts can be prolonged by blocking OX40/OX40L pathway. OX40/OX40L pathway may be the key point of transplant tolerance.     

siRNA干扰OX40/OX40L通路对小鼠移植心脏的免疫保护作用

目的 观察真核表达载体介导siRNA对小鼠移植心脏的免疫保护作用.方法 在C57/BL6J→BALB/C组合[主要组织相容性复合体(MHC)不合]、DBA/2→BALB/C组合[次要组织相容性复合体(mHC)不合]中分别于小鼠心脏移植术后第1、4天胸腺注射生理盐水,pRNAT-CTL阴性对照载体和pRNAT-OX40 siRNA,观察移植心脏存活情况.术后第7天取移植心脏行病理学检查,取血清检测心肌酶谱,取脾脏行逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测OX40mRNA表达和OX40膜蛋白表达.结果 在C57/BL6J→BALB/C组合中(MHC不合),pRNAT-OX40siRNA组移植心脏生存时间较生理盐水组和阴性对照组无明显延长,移植心脏病理学检查无明显改善.而在DBA/2→BALB/C组合中(mHC不合),pRNAT-OX40 siRNA组小鼠移植心脏生存时间较生理盐水组和阴性对照组显著延长,病理改变显著减轻,乳酸脱氢酶(LDH)、谷草转氨酶(AST)、肌钙蛋白(Tn)以及脾脏OX40 mRNA表达和OX40膜蛋白表达与空白对照组和阴性对照组比较明显下降.结论 在DBA/2→BALB/C组合中(mHC不合),单独阻断OXdO/OX40L通路对小鼠移植心脏有保护作用.在C57/BL6J→BALB/C的组合中(MHC不合),单独阻断OX40/OX40L通路未发现对移植心脏的保护作用.     

黄芪多糖对分泌白细胞介素12树突细胞亚群的免疫调控效应与机制

目的 观察黄芪多糖(APS)对分泌IL-12树突细胞(DC)亚群CD11chighCD45RBlowDC功能的影响.方法磁珠分选技术获得BALB/c小鼠脾脏CD11chighCD45RBlowDC和CD4+T淋巴细胞.在CD11 chighCD45RBlowDC中加入不同浓度APS(50、100、200μg/mL)处理,以不加APS的细胞作为对照,应用ELISA法检测细胞培养上清液中IL-12水平,流式细胞仪检测细胞表面分子CD40、CD80、CD86、I-A/E及Toll样受体4(TLR4)的表达.将CD4+T淋巴细胞分为正常对照组(未行任何处理)、未刺激组(加入未经APS处理的CD11chighCD45RBlowDC与CD4+T淋巴细胞混合培养)、高浓度APS刺激组(加入经200μg/mL APS处理后的CD11chighCD45RBlowDC与CD4+T淋巴细胞混合培养)、高浓度APS刺激+抗体1组(加入经200μg/mL APS处理后的CD11chighCD45RBlowDC、IL-12抗体与CD4+T淋巴细胞混合培养)和高浓度APS刺激+抗体2组(加入经200 μg/mL APS处理后的CD11chighCD45RBlowDC、IL-12同型对照抗体与CD4+T淋巴细胞混合培养).采用噻唑蓝法测定CD4+T淋巴细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞培养液中IL-4和γ干扰素水平.对数据行多组间单因素方差分析.结果与未加APS刺激相比,3种浓度APS均显著增强CD11chighCD45RBlowDC表面分子CD40、CD80、I-A/E及TLR4表达及IL-12分泌,其中IL-12分泌呈APS浓度依赖性;CD86表达无明显变化.高浓度APS刺激组CD4+T淋巴细胞增殖能力高于未刺激组(F=13.438,P＜0.05);高浓度APS刺激组细胞γ干扰素水平为(2784±137)pg/mL,高于未刺激组[(1952±101)pg/mL,F=12.177,P＜0.05];高浓度APS刺激组细胞IL-4水平为(172±20)pg/mL,明显低于未刺激组[(193±19)pg/mL,F=11.963,P＜0.05].高浓度APS刺激+抗体1组前述3项指标表达水平较未刺激组明显改善,高浓度APS刺激+抗体2组前述3项指标表达水平与高浓度APS刺激组接近.结论 APS能够通过促进CD11chighCD45RBlowDC中IL-12的表达,诱导CD4+T淋巴细胞向Th1型反应分化,通过激活CD11chighCD45RBlowDC增强免疫活性.

Abstract：

Objective To investigate immunomodulatory effect of Astragalus polysaccharides (APS) on IL-12-secreting dendritic cell (DC) subset CD11chigh CD45RBlow DC. Methods Spleen CD11chighCD45RBlow DC and CD4 +T lymphocytes in BALB/c mice were purified by magnetic beads sorting,and were treated with 0 (as control), 50, 100, 200 μg/mL APS. Immunofluorescence staining and flow cytometry were used to determine expressions of CD11chighCD45RBlow DC surface molecules, including CD40,CD80, CD86, I-A/E, and Toll-like receptor (TLR) 4. IL-12 level in CD11chighCD45RBlow DC culture supernatant was determined by ELISA. The CD4+ T lymphocytes were divided into: normal control group,non-stimulation group ( CD4 + T lymphocytes cocultured with APS-unstimulated CD11 chigh CD45RBlow DC ) ,high-dose APS stimulation group (CD4+T lymphocytes cocultured with 200 μg/mL APS-stimulated CD11ch'ghCD45RBlow DC) , high-dose APS stimulation + antibody 1 group ( CD4 + T lymphocytes cocultured with 200 μg/mL APS-stimulated CD11chighCD45RBlow DC and IL-12 antibody), high-dose APS stimulation +antibody 2 group (CD4 +T lymphocytes cocultured with 200 μg/mL APS-stimulated CD11chigh CD45RBlow DC and IL-12 antibody isotype). Proliferation ability of CD4 + T lymphocytes was determined with MTT method.IL-4 level as well as IFN-γ level in CD4 + T lymphocyte culture supernatant was determined by flow cytometry. Data were processed with one-way analysis of variance. Results Compared with those in control, the expressions of CD 11 chigh CD45 RBlow DC surface molecules ( except for CD86 ) on CD 11 chigh CD45RBlow DC surface, as well as IL-12-secreting level with dose-dependence were increased in cells stimulated with 50,100, 200 μg/mL APS. Proliferation ability of CD4 +T lymphocytes in high-dose APS stimulation group was higher as compared with that in non-stimulation group ( F = 13. 438, P ＜0.05). IFN-γlevel in high-dose APS stimulation group [(2784 ± 137 ) pg/mL] was higher than that in non-stimulation group [(1952 ±101 ) pg/mL, F = 12. 177, P ＜0.05]. IL-4 level in high-dose APS stimulation group was (172 t 20) pg/mL,which was lower than that in non-stimulation group [( 193 ± 19) pg/mL, F = 11.963, P ＜0.05]. Proliferation ability of CD4+ T lymphocytes, IFN-γ level, and IL-4 level in high-dose APS stimulation + antibody 1 group were all ameliorated when compared with those in non-stimulation group; while levels of the 3 indexes in high-dose APS stimulation + antibody 2 group were similar to those in high-dose APS stimulation group.Conclusions APS can activate IL-12-producing CD11 chighCD45RBlowDC, and further induce the activation of immune function of T lymphocyte with shifting of Th2 to Th1 in vitro. APS can enhance the immune response via promoting the phenotypic and functional maturation of CD11 chighCD45RBlow DC.