不同原代培养方法培养人牙髓细胞的研究

目的：比较并建立一种操作简单方便的人牙髓细胞原代培养方法。方法：选择因正畸拔除的完整无龋双尖牙,无菌条件下取出牙髓,分别采用组织块法、酶消化法和改良组织块法进行人牙髓细胞的体外原代培养,比较观察三种不同培养方法的成活率、细胞形态和数量,测定生长曲线并进行细胞来源鉴定。结果：三种方法均可从人牙髓组织分离培养获得外胚间充质来源的牙髓细胞,呈成纤维细胞样,抗波形丝蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性。组织块法耗时较长,培养成功率26.7%;酶消化法培养成活率较低,且细胞数量较少,培养成功率仅为13.3%;在改良组织块法中未发现有漂浮的组织块,培养成活率较高为80%。结论：改良组织块法解决了传统组织块法中组织块难以贴壁的问题,简化了操作步骤并具有较高的成功率,是一种科学可行的人牙髓细胞原代培养方法。     

组织块法和酶消化法培养人牙周膜细胞

目的：作者分别采用酶消化法和组织块法培养人牙周膜细胞，并对这两种方法进行比较。方法：倒置相差显微镜连续观察体外培养的人牙周膜细胞原代和传代生长情况，从形态学、免疫组化及细胞增殖方面对比两种方法培养细胞的异同。结果：两种方法培养的细胞形态大致相同，来源一致，增殖和生长曲线大体一致。组织块法培养的细胞同源性好，但初代培养时间长；酶消化法培养的细胞一次可获得的细胞量大，但容量污染，且初代培养的细胞混有较多的上皮细胞，需多次传代才能去除。结论：组织块法培养HPLFs适用于细胞纯度要求较高的实验，而酶消化法培养HPLFs适用于短期内获得大量细胞的实验。     

人牙周膜成纤维细胞的细胞培养技术

目的人牙周膜成纤维细胞的细胞培养技术两种方法的比较。方法采用组织块法和酶消化法进行人牙周膜成纤维细胞的原代培养,绘制PDLFs的生长曲线。用Envision免疫组化方法进行细胞来源的鉴定。结论组织块培养方法更适合PDLFs的原代培养。     

昆明种乳鼠肝细胞原代培养方法的比较研究

目的 通过比较3种昆明鼠乳鼠肝细胞原代培养的方法,探索一种更有效、快捷的原代培养方法。方法 取30只1~3日龄昆明种乳鼠,随机分为3组,分别采用组织块培养法、胰酶消化法、组织块联合胰酶消化法进行肝细胞原代培养,用倒置显微镜观察实验过程中肝细胞的形态及生长情况。结果 3种方法均能进行乳鼠肝细胞的原代培养,其中组织块联合胰酶消化法培养的肝细胞形态学和生物学特性优于其他两种方法培养的细胞。结论 组织块联合胰酶消化法是3种方法中最快速和高效的一种方法,获得的乳鼠肝细胞形态及生物学特性好,为体外建立乳鼠肝细胞实验模型奠定了实验基础。     

牙周膜成纤维细胞多种培养法的研究

目的：提高人牙周膜成纤维细胞原代培养的成功率,提高组织块贴壁率,缩短培养时间,加快细胞增殖。方法以高血清结合改良组织块培养法培养原代 HPDLCs 与传统组织块法及改良组织块培养法作比较。通过免疫组化方法鉴定细胞的来源,绘制细胞的生长曲线,对三种方式的培养成功率、组织块贴壁率及细胞增殖速度进行比较。结果三种方法所培养的原代细胞生长均趋于正常,细胞呈长梭形或多角形,波形蛋白鉴定呈阳性,角蛋白鉴定呈阴性,符合正常 HPDLCs 的正常形态及生物学特点。高血清结合改良组织块培养法的成功率为86．67％,明显高于其他两种方法（P ＜0．01）。结论高血清结合改良组织块培养法明显提高了 HPDLCs 原代培养的成功率,适合在临床上运用。     

胰酶联合Ⅱ型胶原酶法体外分离培养软骨细胞的分析

目的 通过原代软骨细胞的体外培养和鉴定,探讨胰酶联合Ⅱ型胶原酶法体外分离培养软骨细胞的可行性.方法 分离出兔鼻中隔软骨组织,用胰酶联合Ⅱ型胶原酶的方法进行消化,获取原代软骨细胞.使用倒置显微镜观察软骨细胞的形态及生长情况,并用甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化及免疫荧光染色进行表型鉴定.结果 软骨细胞原代培养形成单层细胞需要7～8d,传代培养时间约2～3 d,细胞以圆形或类上皮细胞形态为主,甲苯胺蓝染色证实细胞可特异性合成糖胺聚糖,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色及免疫荧光染色可证实细胞可特异性分泌Ⅱ型胶原.结论 本研究成功建立了简单易行的胰酶联合Ⅱ型胶原酶法体外分离培养大量纯净的软骨细胞,提高了消化速率,加大了细胞释放率,为组织工程气管软骨种子细胞的获取提供重要的技术支撑.     

乳腺癌细胞株两种原代培养方法的比较

目的 探讨乳腺癌细胞株原代培养的方法.方法 取“人乳腺-人乳腺”小鼠模型的乳腺癌原位灶,用组织块培养法和细胞培养法分别对其进行原代培养,并对两种培养方法的结果进行比较.结果 两种方法均能得到乳腺癌原代细胞,组织块培养法的成功率为90.0％,细胞培养法的成功率为20.0％.结论 组织块培养法是较好的原代培养方法.     

原代培养冷冻兔角膜缘上皮细胞的增殖活性研究

为探讨低温保存的兔角膜缘上皮细胞体外培养方法和增殖活性，采用不同的冷冻条件保存兔角膜缘上皮组织；通过若丹明B染色方法定量检查体外培养的原代细胞增殖活性，并对含血清培养和无血清培养、消化培养和组织块培养进行比较性研究。结果表明，二甲基亚砜浓度梯度和降温速率对冷冻角膜缘上皮原代细胞的增殖能力均无显著性影响(P&;gt;0．05)。在细胞增殖活性上，血清培养组优于无血清培养组(P&;lt;0．05)；组织块培养组优于消化培养组(P&;lt;0．05)；RPMI1640组优于MEM组和DMEM组(P&;lt;0．05)；3T3细胞滋养层组与巨噬细胞滋养层组结果相似(P&;gt;0．05)。结论：兔角膜缘上皮细胞具有血清依赖性和低温耐受性。     

SD新生大鼠耳蜗螺旋神经元的原代培养

目的建立用自制的鼠尾胶原联合胰酶消化法原代培养SD新生大鼠耳蜗螺旋神经元。方法采用出生3 d内的SD大鼠,取螺旋神经节组织,通过胰酶消化后在自制鼠尾胶原包被的培养皿中进行原代培养,应用神经微丝蛋白进行免疫组化鉴定。结果获得的螺旋神经元细胞在体外能较快地贴壁,可以存活、生长,细胞形态良好。结论自制鼠尾胶原联合胰酶消化的培养方法可获得良好状态的螺旋神经元细胞,为原代培养螺旋神经元提供了新思路。     

人支气管上皮细胞原代培养的护理支持

目的探讨人支气管上皮细胞原代培养中护理配合措施。方法做好我院2012年1～9月接收的34例肺癌患者的术前护理工作,包括人支气管上皮细胞分离前科普宣教和心理护理等,了解人支气管上皮细胞原代培养的各种方法,熟悉操作过程,备齐所需要的物品,并且协助研究人员完成人支气管上皮细胞的原代培养。结果经过有效地护理配合,34例患者均顺利完成支气管上皮细胞的分离,无不良反应发生;并且通过组织贴块法、蛋白酶消化+机械刮刷法、纤支镜刷检法三种不同的分离培养方法中探索出组织贴块法获得的支气管上皮细胞成活率高,纯度高,是一种经济、简便、实用的支气管上皮细胞培养方法。结论在人支气管上皮细胞的原代培养中,配合相应的护理,效果良好,为研究出经济、简便、实用的支气管上皮细胞培养方法奠定了基础,值得在临床中推广应用。     

人胚半月板细胞的优化获取及生物学特性研究

目的 研究作为半月板组织工程应用的纤维软骨细胞的改良酶消化培养法及原代细胞与传代细胞的生物学差异。方法 在胰酶消化的基础上,采用胶原酶阶段消化法消化解离8个月人胚半月板中的纤维软骨细胞,并与胶原酶一次消化法所得的细胞进行对比,同时进行原代培养和传代培养,观察细胞存活率、生长曲线、形态学改变、细胞周期并进行酸性糖胺多糖染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定。结果 胶原酶阶段消化法所得细胞的存活率高于一次消化法;原代细胞贴壁时间和潜伏期较传代细胞长;细胞于第4代即呈现老化趋势。结论 半月板采用胶原酶阶段消化法可减少酶对细胞的毒性,得到细胞活力较高的纤维软骨细胞,原代细胞贴壁时间和潜伏期较长,第2、3代细胞适于作为组织工程用种子细胞。     

家兔主动脉平滑肌细胞原代培养的研究

目的探索高效快速的家兔血管平滑肌细胞体外原代培养技术,为分子生物学实验提供足量可靠的细胞来源。方法取家兔主动脉中层,用刀片切成约1mm3,采用不同浓度的Ⅰ型胶原酶以及不同消化时间对组织块进行预消化,然后将组织块贴在培养瓶上进行培养。结果1.5g.L-1胶原酶消化6h后组织块细胞迁出速度及组织迁出率明显提高(P<0.05),组织块贴壁后24h即可见血管平滑肌细胞从组织块周围游离出来,呈梭形或星形,d4～5即可进行传代培养,传代后d3～4即可融合成致密单层细胞,呈典型的峰谷交错状,经免疫组化SP法鉴定有α-actin的表达,进一步确认其为血管平滑肌细胞。结论经1.5g.L-1胶原酶消化6h后组织块细胞迁出速度且迁出率明显提高,从而大大缩短原代培养的时间。     

肾小管上皮细胞原代培养及鉴定

目的探讨肾小管上皮细胞体外培养及鉴定方法。方法①采用机械分离结合酶消化法获取肾小管,原代培养肾小管上皮细胞。②利用动态观察、细胞化学染色法及细胞的透射电镜扫描进行鉴定。结果①肾小管段不同换液时间24h、48h、72h、96h、120h,贴壁率分别为:0.1378±2.048E-02、0.3300±7.969E-02、0.5411±3.919E-02、0.5344±2.506E-02、0.4389±3.018E-02,以72小时首次换液最佳。②肾小管上皮细胞成功原代培养并于第4～7天处于对数生长期。细胞碱性磷酸酶染色均呈阳性,透射电镜扫描见细胞面向液层的刷状缘有大量微绒毛形成。结论采用机械结合酶消化法可分离到较纯的肾小管,肾小管段培养72h首次换液细胞贴壁最佳,肾小管上皮细胞用化学结合形态学及鉴定。     

雪旺细胞体外培养和纯化的新方法

目的介绍雪旺细胞体外培养、纯化的新方法。方法用0．25％Ⅳ型皎原酶和0．03％胰蛋白酶消化出生3d的SD鼠臂层神经和坐骨神经组织块40min．再将组织块贴壁培养。然后采用组织块反复种植纯化法、低浓度胰酶快速消化和差速贴壁法对雪旺细胞进行纯化。结果雪旺细胞从组织块中“爬出”速度较直接组织贴壁培养方法快，且纯度可达98％以上，细胞所受到的外界因素影响也较少。结论先用酶消化后组织块贴壁培养雪旺细胞的方法和组织块反复种植纯化、低浓度胰酶快速消化和差速贴壁法综合运用是一种简便有效的细胞培养、纯化方法，值得进一步推广。     

人胚胎生殖细胞的传代培养

目的 探求人胚胎生殖细胞最适宜的传代时间及最佳的传代方法.方法 取8周人胚胎的生殖腺嵴和肠背系膜,进行组织块体外培养人胚胎生殖细胞,选择原代培养第8天和第16天的细胞,采用挑取传代法和消化传代法,其中的消化传代法采用三种不同的消化液进行传代培养,记录各代培养的细胞集落数.结果 在原代培养第8天时,挑取传代法传2代后获得的细胞集落数减少;消化传代法传4代后获得的细胞集落数明显增多.原代培养第16天时未能传代培养,但却看到人胚胎生殖细胞集落的分化.结论 人胚胎生殖细胞传代培养最适宜的传代时间为原代培养第8天,最佳的传代方法为消化传代法.     

两种方法分离培养类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞的比较

目的比较体外分离培养成纤维样滑膜细胞（FLS）的方法。方法滑膜组织来自关节镜清洗术的活动期类风湿关节炎患者,分别采用消化酶培养法、组织块培养法分离培养FLS。采用倒置相差显微镜以及流式细胞术对第3～4代FLS进行鉴定。结果 2种原代分离培养的方法均可成功培养出FLS。传代可使FLS达到形态学上的纯化要求,倒置相差显微镜观察均符合FLS的形态结构特征,流式细胞术检测示CD44以及CD90呈强阳性,CD55呈弱阳性。组织块法培养法FLS成功率较高,细胞游出时间较早,细胞损伤小。结论组织块培养法适合于FLS的培养,第3～4代细胞的数目、活性及纯度符合进一步实验的要求。     

人皮肤成纤维细胞库的构建

目的建立成纤维细胞系及细胞库。方法采用体外细胞培养技术进行皮肤成纤维细胞的分离、培养、传代、冻存、复苏及鉴定。结果人皮肤成纤维细胞传代至23代以上,此时的细胞数是原代培养的细胞数的数十万倍,经冻存、复苏后,人皮肤成纤维细胞仍具有增殖能力,生长状态与原代培养的人皮肤成纤维细胞相类似。结论酶消化法是培养人皮肤成纤维细胞简便、快捷的方法。     

体外培养人眼结膜上皮细胞

目的探索体外分离培养人眼结膜上皮细胞的方法。方法用组织块培养法培养人眼结膜上皮组织，分别种植于培养皿及处理过的羊膜上，培养2周，观察结膜上皮细胞的生长特性。结果接种在培养皿的结膜上皮约6 d组织块之间可融合成膜状，细胞为单层上皮细胞。接种在羊膜上的结膜组织生长较慢，约2周组织块之间可互相连接，融合成膜状，细胞为复层上皮细胞。免疫组化鉴定，结膜上皮细胞CK13染色阳性。结论组织块培养法是人眼结膜上皮细胞培养的较好方法，种植在羊膜上可获得复层上皮细胞。     

人脑膜瘤细胞的原代培养

目的 建立一种人脑膜瘤细胞原代培养简单有效的方法.方法 新鲜脑膜瘤组织取自福建协和医院神经外科25例连续治疗的脑膜瘤手术病人,以胰蛋白酶消化法分离细胞,用含10%胎牛血清的DMEM培养液进行培养并传代,显微镜下观察脑膜瘤细胞生长状况.上皮膜抗原(EMA)、波形蛋白(Vimentin)对脑膜瘤细胞进行免疫组化鉴定.结果 用胰酶消化法培养脑膜瘤细胞,方法简单,细胞形态典型;EMA、Vimentin表达阳性,鉴定为脑膜瘤细胞.结论 单一的胰蛋白酶消化法是一种简单有效的脑膜瘤细胞原代培养的方法.     

成人及成年大鼠雪旺细胞的体外培养

目的 探讨体外培养成人及大鼠雪旺细胞以获得高纯度细胞的方法.方法 分别用双酶分步消化法、预变性消化法及组织块反复接种法体外培养和纯化大鼠雪旺细胞,比较各种方法的纯度差异.结果 组织块反复接种法所获雪旺细胞纯度为(92.7±8.1)%,高于双酶分步消化法的(35.4±3.6)%及预变性消化法的(37.2±4.5)%(P＜0.01).结论 组织块反复接种法可获得高纯度的雪旺细胞.