牛膝及川牛膝配方颗粒位点特异性PCR鉴别研究

为建立一种稳定准确鉴定牛膝和川牛膝配方颗粒的方法。该文使用位点特异性PCR技术,根据牛膝和川牛膝ITS序列的SNP位点设计特异性鉴别引物,经过优化DNA提取方法后,使用牛膝特异性引物进行扩增,牛膝基原植物和牛膝配方颗粒均可扩增出187 bp特异性条带,川牛膝及混伪品无条带;使用川牛膝特异性引物进行扩增,川牛膝基原植物和川牛膝配方颗粒均可扩增出162 bp特异性条带。并利用所建立的方法对不同生产企业的牛膝和川牛膝配方颗粒进行鉴别,可以充分弥补传统鉴别方法的局限性。     

特异性PCR方法鉴别鳖甲药材和饮片

鳖甲为临床常用的动物药材,炮制加工后鳖甲药材及饮片形态特征丢失,难以鉴别。为建立高效稳定的鳖甲DNA鉴别方法,该研究将SDS法与柱纯化相结合,使用通用引物进行PCR扩增和测序,并根据鳖甲及其混伪品序列差异,寻找特异性SNP位点设计了鉴别引物,对PCR反应条件进行优化,并进行适用性及准确性考察。当退火温度为62℃,循环次数为35,使用设计的鳖甲特异性鉴别引物Biejia-272.F/R进行PCR扩增,鳖甲药材、饮片及醋鳖甲均扩增获得约300 bp的特异性鉴别条带,混伪品无条带。该方法可作为一种快速准确鉴别鳖甲正伪品的鉴定方法。     

白术、苍术种子位点特异性PCR鉴别方法研究

目的: 筛选白术、苍术鉴别SNP位点,并设计特异性引物,实现白术、苍术种子的快速鉴定。方法: 通过测序及GenBank中下载获得白术、苍术的psbA-trnH序列,通过使用Bioedit软件比对获得SNP位点,设计位点特异性PCR引物,将ITS通用引物加入到特异性引物构建多重PCR体系,并优化PCR条件,对白术、苍术种子进行分子鉴定。结果: 构建了多重PCR鉴别体系,通过一个PCR反应,能扩增出苍术、白术约643 bp 的ITS DNA质控条带,扩增出白术172 bp的特异性鉴别条带,实现白术、苍术鉴别。结论: 使用位点特异性PCR技术可以有效鉴别白术、苍术种子。     

基于ITS2序列SNP位点鉴定白及药材及其混伪品

为建立白及药材的分子标记鉴定方法,该文提取白及及其混伪品药材的基因组DNA,利用PCR技术扩增rDNA ITS2片段,片段经双向测序、排序、比对,构建邻接树,查找SNP位点。结果显示,ITS2序列不仅能够有效地区分白及与其混伪品,而且存在可用作白及、黄花白及与其混伪药材鉴别的SNP位点。针对标记白及药材的SNP位点设计引物,通过筛选引物和优化特异性扩增条件后,获取引物BJ59-412F,BJ59-412R,HHBJ-225R在同一扩增条件下,可有效扩增白及、黄花白及,其产物长度分别约为350,520 bp,而混伪品则无PCR条带产生。该文所述引物和建立的反应条件可成功将白及、黄花白及与其混伪品药材进行同步鉴定,操作快速、简捷,结果可靠,可作为白及药材的快速分子鉴定方法。     

多重位点特异性PCR同时鉴别酸枣仁及其掺伪品

目的：优化并建立多重位点聚合酶链式反应（PCR）体系同时鉴别酸枣仁、枳椇子和理枣仁及不同掺伪量,解决酸枣仁药材商品及其制剂的掺伪难题。方法：通过分析比对酸枣仁及其伪品的内部转录间隔区（ITS）序列差异找到特异性单核苷酸多态性（SNP）位点,设计特异性鉴别引物,通过优化退火温度、循环次数及引物浓度,评估不同聚合酶种类和不同PCR仪等扩增条件对不同来源的酸枣仁、枳椇子及理枣仁样品进行特异性扩增,根据特异性扩增条带大小进行鉴别,并对最低检测限和掺伪检出限进行研究。结果：在退火温度为63℃,循环次数为23次时,酸枣仁、枳椇子和理枣仁分别扩增出549、169、389 bp的特异性条带。该方法对酸枣仁和理枣仁的最低检测限为0.24 ng,枳椇子为1.2 ng,对酸枣仁、枳椇子和理枣仁的掺伪检出限分别为0.5%、2%和2%。结论：该文建立的多重位点特异性PCR鉴别方法能同时准确鉴别酸枣仁、枳椇子和理枣仁,对解决酸枣仁药材掺伪问题提供基础研究,为控制酸枣仁药材质量安全及临床应用提供参考。     

蒿属外来药用资源中亚苦蒿的特异性PCR鉴别

目的 基于特异性聚合酶链式反应（PCR）建立了一种中亚苦蒿药材的鉴别方法，可以准确、便捷地鉴别中亚苦蒿及其近缘种。方法 利用Chloroplast Genome Information Resource（CGIR）数据库查找中亚苦蒿及其近源种叶绿体基因组序列，并筛选获得中亚苦蒿特异性单核苷酸多态性（SNP）位点，根据SNP位点设计一对中亚苦蒿特异性鉴别引物zykh1-F和zykh1-R。采集中亚苦蒿及其常见近缘种的原植物样本，建立中亚苦蒿特异性PCR鉴别方法并优化反应体系，对该方法进行耐受性和适用性考察。利用该方法对从新疆药材市场购买中亚苦蒿药材样本进行鉴别。结果 中亚苦蒿特异性PCR鉴别方法采用鉴别引物zykh1-F和zykh1-R，退火温度为54 ℃、循环次数为33次。经PCR扩增和凝胶电泳后中亚苦蒿在210 bp处可观察到单一明亮条带，其余近缘种如艾、黄花蒿、白叶蒿、野艾蒿均无条带。结论 该研究所建立的中亚苦蒿特异性PCR鉴别方法可准确鉴别中亚苦蒿及其常见近缘种，具有高度特异性，且该方法节约时间和成本，为中亚苦蒿资源引种和利用提供一种方便快捷的物种鉴别方法。     

基于ITS序列位点特异性PCR的酸枣仁及其混伪品的鉴别

目的:基于ITS序列建立酸枣仁及其市场混伪品的分子鉴定方法。方法:收集酸枣仁及其常见混伪品理枣仁、枳椇子、紫荆子、兵豆,提取总DNA,基于ITS序列设计引物并进行PCR扩增,对扩增产物进行测序,用Bio Edit分析软件进行序列比对,针对变异位点用Primer Premier 5.0设计特异性鉴别引物,进行PCR反应并考察反应条件。结果:ITS序列可以用于酸枣仁及其易混淆品种的鉴别研究,在位点特异性PCR反应条件考察中,DNA模板用量范围应为0.7~2.1 ng·μL-1,退火温度在59℃时特异性最佳,实验建立的方法对不同Taq酶和PCR仪具有普遍适应性。结论:研究设计的位点特异性引物在一定条件下的PCR反应中,酸枣仁能扩增出66 bp的条带,而其他混伪品不能扩增出条带,从而实现了酸枣仁与其混伪品的快速、准确鉴别。     

多重位点特异性PCR鉴别人参、三七、西洋参掺杂

为建立一种能同时鉴别人参、三七、西洋参及其掺杂品的方法。通过分析人参属ITS,18S和matK序列,寻找特异性SNP位点设计引物,建立多重位点特异性PCR法,并对不同来源的人参、三七、西洋参样品进行扩增,根据特异性条带大小进行鉴别。在退火温度为60℃,循环数为35时,人参、三七和西洋参分别出现约250,500,1000 bp的特异性条带。该方法对于人参、三七、西洋参相互掺杂的混合样品,人参中掺杂三七或西洋参以及三七中掺杂西洋参或人参的检出限均为0.5%,对西洋参中掺杂人参的检出限为0.5%,掺杂三七的检出限为1%。表明建立的多重位点特异性PCR可用于人参、西洋参、三七的掺杂鉴定。     

应用等位基因特异聚核酶链式反应鉴别半夏类药材

 目的建立能区分半夏正、伪品的分子鉴定方法。方法下载GenBank中半夏属、犁头尖属及天南星属相关序列,利用DNAMAN进行比对分析,根据ITS序列中半夏的SNP位点设计引物PtITS178F和PtITS555R,采用等位基因特异PCR进行扩增。结果对半夏5个产地的新鲜样品、10个产地的药材以及5批虎掌、水半夏样品进行PCR检测。引物PtITS178F和PtITS555R只对半夏类药材扩增395 bp片段,虎掌和水半夏均无扩增条带。结论等位基因特异PCR能准确检测半夏的SNP位点,达到准确鉴别半夏正伪品的目的,是一种有前途的中药材分子鉴定方法。     

宽叶山蒿与艾不同部位叶片腺毛和非腺毛形态特征比较研究

采用扫描电子显微镜对宽叶山蒿与北艾、海艾、蕲艾和祁艾的叶表皮腺毛和非腺毛形态、大小进行观察与统计学分析,结果显示宽叶山蒿与四大艾各部位表皮毛特征均存在显著差异,这种差异与化学成分差异密切相关。中部叶非腺毛长度和腺毛面积大小最稳定;腺毛密度可区分宽叶山蒿与艾叶;非腺毛密度和卷曲度可以进一步区分四大艾,宽叶山蒿非腺毛密度最高。四大艾上部叶下表面非腺毛以蕲艾最厚;祁艾中部叶上表面T形非腺毛柄长者易倒伏,顶端细长者呈波浪状分布;海艾非腺毛卷曲度最高。统计学结果表明,海艾下部叶上、下表面的腺毛面积大小和下表面腺毛密度均较其他品种各部位更高;宽叶山蒿上部叶下表面非腺毛密度最高;蕲艾上部叶上表面腺毛密度、非腺毛密度最大。荧光显微镜观察结果表明黄酮类成分与表皮毛大小及密度密切相关。蕲艾、北艾黄酮类显色程度和显色面积均最佳,宽叶山蒿中黄酮类显色最弱。该研究使用扫描电子显微镜和荧光显微镜对艾叶不同叶位叶片表皮毛超微结构进行观测分析,结果为艾叶资源品种及近缘种显微鉴定提供了新的证据,也为结构与成分及功能关系研究提供参考资料。     

基于双向位点特异性PCR的金银花真伪鉴别方法研究

目的:筛选获得金银花真伪鉴别SNP位点并建立双向位点特异性PCR方法,用于鉴别金银花和其常见伪品以及两者的混杂品.方法:通过对GenBank收录的忍冬属植物叶绿体trnL-trnF序列进行对比分析,获得金银花真伪鉴别SNP位点;并依据该SNP位点设计特异性引物,对84份金银花基原植物及其市售饮片、伪品进行双向位点特异性PCR扩增,并根据真伪品的特异性条带进行金银花药材鉴别.结果:退火温度为61℃时,正品均出现468 bp的条带,红腺忍冬、华南忍冬、灰毡毛忍冬、黄褐毛忍冬、水忍冬、金银忍冬、郁香忍冬、新疆忍冬、繁果忍冬等9个伪品均出现324 bp的条带,在正品DNA中掺入5％以上伪品时同时出现正品和伪品条带.结论:双向位点特异性PCR可以鉴别金银花真伪品及两者的混杂样品.     

基于物种特异性PCR方法的鸡内金真伪鉴别

目的:建立鉴别鸡内金及其常见伪品的物种特异性聚合酶链式反应(PCR)方法,对全国中药材及饮片专项抽验任务中所抽取的鸡内金饮片进行真伪鉴别,评价市场上鸡内金的真伪情况。方法:根据鸡、鸭、鹅的12S序列差异,设计或优化物种特异性PCR鉴别引物,对影响PCR结果的主要因素退火温度,PCR循环次数,模板DNA浓度,Taq酶种类等进行方法学考察和优化。使用优化的特异性PCR方法对鸡、鸭、鹅内金样品进行DNA分子鉴别。结果:在进行方法学考察确定最优鉴别条件的基础上,当PCR退火温度为55℃,循环次数为30次的条件下,当使用文中筛选得到的鸡物种特异性鉴别引物时,所测鸡内金饮片均检出约为273 bp的特异性扩增条带,混伪品鸭内金和鹅内金均无相应扩增条带;当使用鸭和鹅鉴别引物时,均未检出相应的扩增条带。结论:位点特异性PCR方法能够快速准确的鉴别出鸡内金真伪品,可用于全国中药材及饮片专项抽验任务中鸡内金的真伪鉴定,目前市场上用鸭内金和鹅内金充鸡内金现象较少,质量评价较好。     

分子标记在天花粉鉴定中的应用价值研究

目的探讨特异性PCR方法在鉴定天花粉中的应用价值。方法选取16份天花粉正品和7份天花粉易混淆品,提取基因组DNA,按照天花粉核糖体RNA中ITS保守区域设计的3个引物进行PCR扩增,1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。结果引物P1(5'-TTCGTTTGAGTTCCTTGGCG-3')扩增效果最好,最佳退火温度为45℃;560bp和960bp条带为天花粉特征鉴定条带,不同栝楼亚种的其他条带略有不同,可将其作为栝楼鉴定的辅助条带。结论锚定引物扩增多态性DNA技术(APAPD)是一种极有发展前景的中药材分子鉴定方法,可为中药材DNA指纹图谱提供更多信息。     

乌头霜霉病病原物分子检测方法的建立

目的:建立乌头霜霉病病原菌快速分子检测方法,为乌头种苗检疫及栽培环境土壤安全性评价提供依据。方法:使用真菌DNA提取试剂盒提取病原菌DNA,采用真菌核糖体内转录间隔区(ITS)通用引物ITS1/ITS4,对病原菌的r DNA-ITS区间序列进行扩增,将聚合酶链式反应(PCR)产物回收纯化并进行序列测定,并将测得的ITS序列同Gene Bank中搜索到的相关ITS序列进行比较,运用DNAMAN比对出特异序列片段,利用特异序列片段通过Primer Premier 5.0设计并筛选特异性引物,建立乌头霜霉病病原菌快速PCR检测方法。结果:从Primer Premier 5.0设计的8对引物中筛选出了灵敏度高、特异性强的引物对L1A/L1B,该引物能够从乌头霜霉病病原菌DNA扩增出670 bp的具有检测价值的明亮条带,利用该引物也能够检测出乌头种苗、成株以及栽培土壤是否存在乌头霜霉病原菌。结论:筛选出的引物对L1A/L1B能够快速、简便、有效地检测出乌头霜霉病病原菌,建立的方法能用于对乌头种苗霜霉病的提前检测或检疫。     

位点特异性PCR鉴别桃仁中掺入苦杏仁的方法分析

目的 由于中药材传统真伪鉴别方法的局限性,本研究拟通过位点特异性聚合酶链式反应（PCR）建立一种能够快速鉴别桃仁中掺有苦杏仁的方法。方法 通过比对苦杏仁与桃仁的核糖体DNA内转录间隔区（ITS）基因序列,寻找单核苷酸多态性（SNP）位点并设计特异性鉴别引物。利用不同的苦杏仁和桃仁样品进行PCR扩增,对影响PCR反应体系的退火温度、引物浓度、循环数等条件进行优化,并对该方法的专属性和检出限进行了考察。另外,利用建立的PCR鉴别方法对不同来源和不同产地桃仁中掺有不同比例苦杏仁的样品进行检测,以验证该方法的稳定性和准确性。结果 建立了桃仁中掺混苦杏仁的特异性PCR鉴别方法,在退火温度63 ℃和引物循环数30个时仅有苦杏仁能扩增得到432 bp的特异性条带,桃仁样品则无此条带。该方法对苦杏仁的最低检出限为0.2 ng,其对桃仁中掺入苦杏仁的检出限为1%,可用于日常桃仁中掺混苦杏仁的检测。结论 建立的位点特异性PCR方法能够准确地检测桃仁中是否掺有苦杏仁,可为桃仁的质量控制提供实验依据,以保障其临床用药安全。     

浙贝母特异性PCR鉴定方法研究

目的利用特异性引物对浙贝母Fritillaria thunbergii进行特异性PCR鉴定。方法回收RAPD扩增筛选到的浙贝母分子标记ZB1基因,将其连接进入T-载体克隆并测序。根据测序结果设计一对特异性引物P2/P3,以贝母基因组DNA为模板进行特异性PCR扩增。结果特异性PCR鉴定结果为浙贝母在约750 bp处出现特异性条带,其他贝母品种则未出现条带。结论浙贝母特异性PCR鉴定方法操作简单,准确、灵敏、重复性好,具有较好的应用前景。     

草珊瑚与金粟兰叶片双位点特异性PCR鉴别方法研究

筛选获得草珊瑚与金粟兰鉴别的特异位点并建立双位点特异性PCR方法,用于鉴别草珊瑚与金粟兰叶片以及两者的混杂品。采集不同产地的草珊瑚18份、金粟兰6份,所有样品提取总DNA,并对草珊瑚与金粟兰干燥叶片进行DNA提取。通过对其ITS片段进行扩增、测序,并搜索GenBank数据库中收录的草珊瑚与金粟兰的ITS序列,进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物,构建多重PCR体系,并优化PCR条件,对草珊瑚与金粟兰叶片进行快速分子鉴定。构建了多重PCR鉴别体系,只经一个PCR反应,能扩增出草珊瑚580 bp的特异性鉴别条带及金粟兰470 bp的特异性片段,可快速鉴别草珊瑚与金粟兰叶片,并可判断相互是否混杂。使用双位点特异性PCR技术可以有效快速鉴别草珊瑚与金粟兰叶片,并可判断相互是否混杂。     

基于ITS序列位点特异性PCR鉴别桃仁与苦杏仁

目的:对桃仁和苦杏仁进行分子鉴定研究,建立基于ITS序列位点特异性的PCR鉴定方法。方法:收集桃仁、苦杏仁样品,提取基因组总DNA,用ITS通用引物进行测序,通过Bio Edit软件进行序列比对,根据特异位点设计鉴别引物进行特异性PCR反应,并对PCR反应条件进行了优化。结果:基于ITS序列设计的特异性鉴别引物G4-7可以用于桃仁和苦杏仁的鉴别研究,在位点特异性PCR反应条件考察中,25μL反应体系DNA模板用量适宜范围为0.05~1 ng,退火温度在59℃时特异性最佳,实验建立的方法对不同DNA聚合酶和PCR仪均具有普适性。结论:该研究设计的位点特异性引物在一定条件下的PCR反应中,桃仁能够扩增出333 bp清晰条带,而苦杏仁没有该条带,从而实现了桃仁与苦杏仁的快速、准确鉴别。     

龟甲的特异性PCR及高分辨率熔解曲线技术鉴别方法研究

目的:建立高效、稳定的龟甲Testudinis Carapax et Plastrum DNA鉴别方法。方法:利用龟甲的特异性聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)鉴别方法和高分辨率熔解曲线(HRM)鉴别方法,根据龟甲及其混伪品COI序列差异,寻找特异性单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点设计鉴别引物,并对PCR反应条件进行优化;并使用通用引物扩增COI区域,产物直接进行HRM分析。结果:当退火温度为60℃,循环次数为35,使用设计的龟甲特异性鉴别引物GJ-360.F/R进行PCR扩增,经扩增均获得约360 bp特异性鉴别条带,混伪品皆无条带;使用通用引物RonM-tl和Vl-tl进行PCR扩增,产物使用HRM分析,龟甲药材在模板DNA质量浓度为3.5～87.9 ng·μL~(-1)、引物浓度为0.2μmol·L~(-1)、镁离子浓度为2.0 mmol·L~(-1)的条件下,龟甲药材标准熔解曲线为双峰,其T_m均值分别为(83.15±0.76)、(87.53±0.69)℃。结论:特异性PCR和HRM均可作为一种快速准确鉴别龟甲正伪品的鉴定方法。     

基于ITS2序列位点特异性PCR鉴别广藿香及其混伪品

目的建立一种简便、准确鉴别广藿香及其混伪品的方法。方法通过对GenBank数据库收录的广藿香及其混伪品的ITS2序列进行对比分析,根据差异位点设计位点特异性鉴别引物,并优化PCR条件,对广藿香新鲜植物、干燥药材、含广藿香中成药及其混伪品进行扩增和检测。结果广藿香新鲜植物、干燥药材及含广藿香中成药均扩增出162 bp条带,而广藿香的混伪品均无条带,且该方法灵敏度高,检出限可达0.3 g·L~(-1)。结论所建立的位点特异性PCR方法可实现广藿香的准确鉴别,具有操作简便、稳定可靠、应用范围广的优点。