谷氨酸对原代培养海马神经细胞兴奋毒作用的研究

为更清楚地了解药物对神经元的损伤和保护作用，在体外对新生大鼠（０－１ｄ）海马神经细胞进行原代培养，建立了谷氨酸对原代培养海马神经细胞兴奋性神经毒损伤模型。通过检测神经细胞乳酸脱氢酶泄漏率和相关显微镜下对神经细胞形态变化的观察，发现只有发育成熟的神经元对谷氨酸兴奋毒损伤最敏感，神经元的兴奋毒损伤对谷氨酸在一定范围内有剂量信赖性或接触时间依赖性关系，提示谷氨酸通过与其受体结合造成神经元兴奋毒损伤。     

天麻素对谷氨酸致培养皮层神经细胞损伤的保护作用

取新生大鼠大脑皮层进行体外神经细胞培养,用谷氨酸建立离体的神经元损害模型,观察天麻素对兴奋性氨基酸神经毒性的影响。结果表明：２００μｍｏｌ／Ｌ谷氨酸作用１０ｍｉｎ能造成培养神经元的大量死亡,培养液中乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）含量明显增高;在培养液中加入天麻素或氯胺酮可明显降低神经细胞死亡率,减少乳酸脱氢酶的漏出。提示天麻素可拮抗兴奋性氨基酸神经毒性。     

藻酸双酯钠对大鼠皮层神经细胞谷氨酸兴奋毒性的保护作用

目的:观察藻酸双酯钠(Polysccharide Su lfate,PSS)对培养神经细胞谷氨酸兴奋毒性的保护作用。方法:体外培养大鼠皮层神经细胞,加入谷氨酸观察谷氨酸对神经细胞的兴奋毒性及PSS的保护作用,以碘化丙啶染色,流式细胞仪定量分析细胞凋亡百分率;以荧光分光光度法测定细胞内游离钙及caspase 3活性的变化。结果:Pss50,100,150ug/m l能显著减少细胞死亡,降低乳酸脱氢酶(LDH)漏出量及丙二醛(MDA)生成,提高超氧歧化酶(SOD)活性,抑制细胞内[Ca2+]i累积以及caspase 3活性,抑制神经细胞凋亡。结论::PSS对培养神经细胞谷氨酸兴奋毒性具有显著的保护作用,其机制可能与PSS抑制细胞内[Ca2+]i累积以及抗脂质过氧化作用有关。     

谷氨酸对培养大鼠皮层神经细胞的毒性作用

目的 探讨谷氨酸对体外培养的大鼠皮层神经细胞的损伤作用。方法 在对体外新生大鼠（0－1d)大脑皮层神经细胞进行原代培养的基础上，分组加入不同浓度的谷氨酸作用10min,24h后测定细胞死亡率、乳酸脱氢酶（LDH）和超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量。结果 大鼠皮层神经细胞在50μmol/L谷氨酸作用10min后，细胞死亡率和LDH活性增加，SOD活性降低，神经细胞MDA含量增高。随着谷氨酸浓度的增加，上述变化更明显。结论 谷氨酸可损伤培养大鼠皮层神经细胞，这种作用在某种程度上由氧自由基介导。     

谷氨酸对大鼠海马损伤的不同时段超微结构的研究

目的 为明确谷氨酸对海马神经细胞有无兴奋性和毒性作用。方法 实验选择具有较多NMDA受体的海马作为研究对象,选用SD大鼠,给予MSG（Monosodium L-glutamate,剂量为18mmol/kg）皮下注射,在不同的时段观察大鼠的行为表现和其涨马神经细胞受损的超微结构的变化。结果 发现大鼠的早期行为表现较为兴奋,而后随时间的延长表现迟钝。神经细胞早期为水肿,后期水肿明显和细胞器的破坏直到细胞核固缩,这些损伤主要表现在CA1区。结论 表明边缘系统的海马结构易受谷氨酸的影响,同时也表明谷氨酸对海马神经细胞有兴奋毒性作用,此可为临床和基础的研究提供一定形态学的依据。     

大鼠海马神经细胞原代培养及塑料孔板原位鉴定

目的 原代培养大鼠海马神经细胞,探讨简单、有效的塑料孔板原位鉴定方法.方法 采用Hiroaki等的方法并做了改良,在塑料孔板里进行胎鼠海马神经细胞原代培养,7 d后分别用传统和改良的甲苯胺蓝(TB)染色法、改良的神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)染色法对海马神经细胞进行鉴定.结果 无血清细胞培养法神经细胞结构特征明显,能形成明显的神经网络结构.传统的TB染色法染色单一,均为淡蓝色;改良的TB染色法红蓝匹配,对比度好;改良的免疫组化NSE染色法胞质阳性.结论 无血清培养法是海马神经细胞培养的理想方法,塑料孔板细胞培养原位染色简单易行,对细胞及分子水平研究有重要意义.     

阿糖胞苷对新生Wistar大鼠海马神经细胞体外培养的影响

目的探讨阿糖胞苷对新生大鼠海马神经细胞培养的影响作用。方法利用高糖DMEM常规培养神经细胞，在不同的培养时间(0d，1d，3d，5d，7d)分别加入一定量(0．8μg/ml)的阿糖胞苷以及在培养一定时间(5d)时加入不同剂量的阿糖胞苷(0μg/ml，0．4μg/ml，0．8μg/ml，1．6μg/ml，3．21μg/ml)。结果一定浓度的阿糖胞苷对神经细胞生长有促进作用，对胶质细胞的生长有抑制作用。结论阿糖胞苷对神经细胞的抑制表现出时间依赖性和剂量依赖性，在诱导剂量下，可诱导神经细胞的分化增殖。     

SD乳鼠海马神经细胞原代培养方法的探讨

目的 寻求一种简单、廉价的原代SD乳鼠海马神经细胞培养方法.方法 采用胰蛋白酶消化法制备游离海马神经细胞悬液,进行培养.结果 通过多次探索、观察、成功的进行了原代海马神经细胞培养.结论 本方法适合一般实验室开展海马神经细胞培养.     

视神经损伤后谷氨酸对视网膜的兴奋毒性作用

视神经损伤是头颅外伤的常见病，也是视力丧失的原因之一。由于视神经损伤的不可复性，在损伤后如何减轻继发性损伤和保护未损伤神经元细胞即成为研究的重点。视神经是由RGC轴突汇聚而成，防治视神经损伤后的RGC继发性损伤是治疗急性视神经损伤的关键。有研究表明，视神经损伤后各种因素可改变RGC生存的微环境，诱导RGC继发性死亡。这些微环境改变，包括血管痉挛、脂质过氧化、缓激肽、钙离子超载、兴奋性递质的释放和蓄积、神经营养因子的剥夺和基因异常等。在众多继发性死亡通道中，谷氨酸（Glu）兴奋性毒性诱导的视网膜神经节细胞死亡日益引起人们的重视。本文对谷氨酸对视网膜的兴奋性毒性作用的机制综述如下。     

胎鼠海马神经细胞的原代培养及鉴定

目的建立较理想的SD大鼠胎鼠海马神经细胞体外原代培养方法。方法孕18 d(E18)SD大鼠的胎鼠,采用胰酶消化和机械分离相结合的方法进行海马神经元的原代无血清培养。结果在体外培养条件下神经细胞结构特征明显化,并能形成典型的神经细胞网络。结论该培养技术是海马神经细胞体外培养的理想方法。     

体外培养新生大鼠海马神经元的图象分析

目的：研究体外培养海马神经元不同时期的形态学变化。方法：用图象分析方法，研究体外培养的新生Wistar大鼠海马神经元在不同时间的形态、细胞数密度、面数密度、长度密度以及分支数密度的发育性变化情况。结果：体外培养的海马神经元呈梭形、锥体形、多角形多形性生长。随着培养时间的延长，细胞数密度和面数密度保持不变，突起长度密度和分支密度逐渐增加，突起上膨体样结构数密度增加。结论：体外培养的新生大鼠海马神经元在离体1-14d，随着培养时间的延长，细胞突起、分支数目以及膨体样结构逐渐增多，细胞间连接增加，呈现形态和功能成熟过程。     

p75NTR在谷氨酸诱导海马神经元兴奋毒性损伤中的表达

目的:观察谷氨酸诱导海马神经元兴奋毒性损伤中神经营养因子受体p75(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)表达水平的变化.方法:建立谷氨酸诱导的新生大鼠海马神经元兴奋毒性损伤模型,RT-PCR和Western blot方法检测p75NTR在mRNA和蛋白质水平的表达变化.结果:谷氨酸刺激后,p75NTR在mRNA(P<0.01)和蛋白质(P<0.05)水平的表达较对照组明显增高;N-甲基-D-门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)的特异性拮抗剂MK-801可明显减弱p75NTR在mRNA和蛋白质水平的表达上调(P<0.05).结论:p75NTR的活化与谷氨酸兴奋毒性神经损伤过程密切相关.     

海马神经元谷氨酸损伤研究

目的:本研究通过观察体外培养的大鼠胚胎海马神经元在谷氨酸损伤后,细胞活力变化及细胞损伤的方式,初步探讨谷氨酸对神经元的损伤机制。方法:通过MTT,观察不同浓度(62.5μM、125μM、250μM、500μM)的谷氨酸损伤后不同时间(6 h、12 h、18 h、24 h)海马神经元活力的变化。经相差显微镜观察谷氨酸对海马神经元胞体及突起的影响。通过TUNEL、Hoechst染色比较正常培养组和损伤组的凋亡率,分析谷氨酸对海马神经元的损伤作用。结果:MTT结果显示,谷氨酸对体外培养的胎鼠海马神经元有兴奋毒性,在所观察的剂量范围内,随着谷氨酸浓度的增加,作用逐步增强,至500μM达峰值,随着损伤后孵育时间的延长,海马神经元活力逐渐下降。TUNEL和Hoechst染色结果也显示,125μM谷氨酸对体外培养的胎鼠海马神经元有兴奋毒性,主要引起海马神经元的凋亡。结论:谷氨酸对体外培养的胎鼠海马神经元有兴奋毒性,且这种作用呈现剂量相关性。中等剂量(125μM)谷氨酸损伤主要引起海马神经元的凋亡。     

氧化槐定碱对氧糖剥夺再灌注损伤后大鼠海马神经元Glu含量及NMDA受体亚单位NR1表达的影响

目的研究氧化槐定碱（OSR）对原代培养新生大鼠海马神经元氧糖剥夺再灌注损伤后Glu含量与NR1表达的影响。方法以原代培养的新生大鼠海马神经元为研究对象,建立氧糖剥夺再灌注损伤模型。采用化学比色法测定神经细胞培养液中谷氨酸（Glu）的含量,Western blot方法和实时荧光定量PCR技术检测大鼠海马神经细胞NMDA受体NR1亚基蛋白和mRNA的表达。结果与氧糖剥夺再灌注损伤组比较,OSR治疗组（20、5、1.25 mg·L-1）可减少神经细胞培养液中Glu的含量（P〈0.05）;OSR治疗组（20μg·L-1）可明显抑制NMDA受体NR1亚基蛋白和mRNA的表达（P〈0.05）。结论 OSR通过降低Glu含量和减少NR1表达,减轻兴奋性氨基酸毒性,对新生大鼠海马神经元缺氧损伤具有明显的保护作用。     

EGb761对谷氨酸诱导海马神经元兴奋毒性损伤中p75NTR表达的影响

目的：观察谷氨酸诱导海马神经元兴奋毒性损伤中神经营养因子受体p75（p75neurotrophin receptor,p75NTR）表达水平的变化,探讨银杏叶提取物（EGb761）抗兴奋毒性神经保护作用与p75NTR的相关性.方法：建立谷氨酸诱导的新生大鼠海马神经元兴奋毒性损伤模型,观察25200mg/L剂量下EGb761的神经保护作用;RT-PCR,Western Blot及细胞免疫荧光染色方法检测p75NTR的表达变化.结果：100mg/LEGb761预处理给药的神经保护效果最明显;谷氨酸刺激后,p75NTR在mRNA和蛋白质水平的表达较对照组明显增高（P〈0.01）;EGb761本身对p75NTR表达无影响,而EGb761预处理组p75NTR在mRNA和蛋白质水平的表达较谷氨酸组均显著降低（P〈0.05）.结论：p75NTR在谷氨酸诱导兴奋毒性神经损伤中起着重要作用,EGb761抗兴奋毒性神经保护作用可能与抑制p75NTR的表达有关.     

Influence of calcium influx on intracellular pH of neocortical and hippocampal neurons in primary culture

研究钙内流对原代培养的皮质和海马神经元内ｐＨ（ｐＨｉ）的影响。为了达到此目的，暴露单个神经元于谷氨酸（Ｇｌｕ，１００μｍｏｌ／Ｌ）或氯化钾（ＫＣｌ，５０ｍｍｏｌ／Ｌ）。用微荧光法测定细胞内游离钙（〔Ｃａ２＋〕ｉ）和ｐＨｉ。结果表明，Ｇｌｕ暴露或Ｋ＋－诱导的去极化可导致海马神经元明显酸化（△ｐＨ～０．４）。在无钙溶液中，这一ｐＨ降低被显著减少（Ｇｌｕ暴露）或转化成增高（Ｋ＋－诱导的去极化）。相反，皮质神经元对Ｇｌｕ的反应很弱，只有轻微的酸化。实际上，去极化诱导的ｐＨｉ在两种细胞中呈反方向变化。由上述结果得出结论：海马与皮质神经元的不同是海马神经元在钙通道激活后允许更大量的钙离子从细胞外液流入。     

原代海马神经细胞体外培养的纯化与鉴定

目的 建立原代海马神经细胞体外培养纯化及鉴定的优选方法.方法 取新生Wistar乳鼠,分离海马后在体外采用含血清结合无血清法进行培养,并用NSE、GAP-43、MAP2等海马神经细胞特异抗体经免疫细胞化学方法鉴定细胞性质及纯度.结果 接种24 h后细胞全部贴壁,并长出突起,随时间增加,突起延长并交错形成网络,至第7～8天神经元形态最为成熟饱满,随后逐渐出现细胞老化,神经元最长可生存4周.经鉴定,海马神经元纯度达96%以上.结论 体外采用含血清和无血清法相结合进行原代海马神经细胞培养,细胞纯度高,杂细胞少,可为神经疾病体外研究提供必要细胞基础.     

Egb761抑制谷氨酸受体拮抗大鼠海马神经元兴奋毒损伤

目的 观察银杏叶提取物Egb761对海马神经元谷氨酸(Glu)兴奋毒性损伤的保护作用及其机制。方法 采用DAPI染色和TUNEL法检测Glu诱导的海马神经元细胞凋亡及Egb761的保护作用,采用全细胞膜片钳技术记录Egb761对大鼠海马神经元Glu受体电流的抑制作用。结果 Egb761拮抗Glu孵育诱导的海马神经元凋亡样死亡,其分子机制可能是抑制N 甲基-D-天冬氨酸(NMDA)型和海人酸(KA)型Glu受体。结论 银杏叶提取物Egb761通过抑制Glu离子通道而拮抗Glu对海马神经元的兴奋毒作用。     

褪黑激素对新生大鼠海马神经元延迟整流钾电流的影响

目的 用膜片钳技术观察褪黑激素对电压门控性延迟整流钾电流(Ik)的影响,探讨褪黑激素在中枢神经系统的作用机制及其生物学意义.方法 选择7～12 d原代培养的新生Wistar大鼠海马锥体神经元,用膜片钳电压钳全细胞记录模式观察Ik的基本电生理特点,并观察不同浓度褪黑激素,包括1、10、100 nmol/L、1、10、100 μmol/L和1 mmol/L对Ik的幅度及动力学特性的影响.结果 利用海马锥体神经元的钾电流对4-AP、TEA的敏感性及电生理特性的不同可分离出激活、失活缓慢,具有强烈外向整流特性的延迟整流钾电流.褪黑激素对海马锥体神经元Ik的影响是快速、可逆、呈电压依赖性的,但对其激活曲线没有影响.褪黑激素对Ik的作用具有浓度依赖性.1～100nmoI/L的褪黑激素可逐渐递增地增加Ik幅度;1～100 μmol/L褪黑激素对Ik的增加程度随浓度增加而增大,而1 mmol/L褪黑激素的增加程度却减小.结论 褪黑激素可逆地增强体外培养新生大鼠海马神经元的Ik电流,这或许参与了神经元损伤和记忆损害的某些环节.