光化学法对血液中病毒的灭活效果研究

目的：筛选并验证全血中脂质包膜病毒灭活的最佳光化学方法.方法：以f2噬菌体为试验病毒,通过噬斑计数法筛选最佳灭活血液中病毒的光化学法,并通过正交试验筛选灭活血液中病毒的最佳作用条件;以HIV-1和日本脑炎病毒为试验病毒,通过细胞感染试验验证最佳光化学法对血液中脂质包膜病毒的灭活作用.结果：与核黄素和金丝桃素相比,亚甲基蓝（MB）所致的光化学效应对血液中f2噬菌体的灭活作用显著（P＜0.05）;在使血液中f2噬菌体下降超过5个对数级时,MB光化学的最佳作用条件分别是：MB终浓度为15 μmol/L,可见光（640 nm）照射强度为40 000 Lux,光照射作用时间40 min;在相同MB加入剂量和光照射强度下,照射10 min,血液中HIV全部灭活（下降5.78个对数级）,照射20 min,血液中日本脑炎病毒全部灭活（下降7.00个对数级）.结论：亚甲基蓝光化学法可高效灭活全血中f2噬菌体、HIV-1与日本脑炎病毒.     

HIV-1B亚型假病毒的制备与鉴定

目的：制备携带增强绿色荧光蛋白（ EGFP）基因和ENV包膜蛋白的HIV-1 B亚型假病毒用于感染研究,并建立可行的鉴定方法。方法双质粒共转染HEK293 T细胞后收获病毒上清, TRIzol法提取病毒基因组并采用RT-PCR进行报告基因扩增,Western印迹和ELISA法检测病毒P24抗原。假病毒感染HIV-1允许细胞,进行报告基因检测、病毒滴度测定以及单轮感染活性实验研究。结果与结论建立了HIV-1假病毒制备与鉴定方法,制备获得了B型HIV-1假病毒,经鉴定具备感染SupT1和TZM-bl细胞能力,为HIV-1与宿主细胞相互作用研究奠定了基础。     

不同参数HMME-PDT对兔耳增生性瘢痕的生物效应

目的观察不同参数的血卟啉单甲醚-光动力学疗法（HMME-PDT）对兔耳增生性瘢痕的生物学效应，为临床应用HMME-PDT防治增生性瘢痕提供实验依据。方法建立兔耳增生性瘢痕模型后，将150个增生性瘢痕块随机分为HMME-PDT治疗组和对照组。PDT治疗组给予HMME10mg／kg，分别在给药后即刻、30min、1和3h行半导体激光照射，波长630nm，能量密度分别为5、10和20J／cm^2。观察瘢痕生长情况，术后28d取材行常规HE染色，计算各组瘢痕增生指数，分析HMME-PDT对瘢痕的影响。结果静脉注射HMME10mg／kg后，以功率密度为20mW／cm^2，能量密度为5J／cm^2的半导体激光在给药后即刻和30min照光时能对瘢痕增生块产生抑制效应，其中以时间间隔为30min时的作用更加显著，而能量密度为20J／cm^2的激光照射瘢痕增生指数仍然较高，甚至超过空白对照组。结论HMME-PDT对兔耳增生性瘢痕的生物学效应与光敏剂的剂量和激光照光时间、给药后至照光的时间间隔和能量密度密切相关。     

瘢痕成纤维细胞对血卟啉单甲醚的吸收特性及其光动力效应

目的探讨增生性瘢痕成纤维细胞（HSF）对光敏剂血卟啉单甲醚（HMME）的吸收特性和光动力疗法（PDT）的杀伤效应。方法取原代培养的HSF,经流式细胞仪（FCM）检测HMME浓度（0～40μg/ml）和孵育时间（0～120 min）对HSF细胞吸收HMME的影响;MTT法检测HMME-PDT对HSF细胞存活率的影响。结果在一定HMME浓度范围内（0～40μg/ml）,HSF细胞对HMME的吸收量随HMME浓度和孵育时间的增加而增大。实验范围内的HMME-PDT对HSF细胞的杀伤效应与HMME浓度和激光能量密度正相关。结论 HSF对HMME的吸收随HMME浓度和孵育时间的增加而增大,HMME-PDT处理HSF时,光敏剂HMME浓度和激光能量密度是影响细胞存活率的重要因素。     

经输血感染的HIV/AIDS患者HIV-1耐药基因突变研究

目的 研究经输血感染的HIV-1遗传基因突变特征,分析其对抗HIV药物的耐药性.方法 经输血感染HIV-1的患者37例,从血浆提取HIV-1 RNA,运用RT-PCR和巢式聚合酶链反应(nested-PCR)扩增HIV-1 pol区基因片段,并对电泳阳性的目的片段进行测序,将结果提交到http://HIVdb.stanford.edu,分析HIV-1的耐药突变情况.结果 37例患者中共20例发生耐药突变,其中19例为病毒学或免疫学失败.3例患者在治疗过程中发生了蛋白酶抑制剂(PIs)位点突变,主要位点突变为V32AV,但未引发PIs耐药.有23例患者发生了反转录酶编码区基因突变,包括M184V、TAMs、Q151M复合体、K103N、Y181C等,其中20例HIV-1遗传基因的突变不同程度地导致了反转录酶抑制剂(RTIs)耐药,发生率为54.1％(20/37).结论 经血液感染HIV-1患者在参加抗病毒治疗后耐药发生率较高,应适时进行耐药监测,及时更新治疗方案.     

初筛实验室检测HIV抗体以S/CO值进行室内质控的探讨

目前大多数基层医院对艾滋病抗体初筛实验都应用ELISA法检测HIV抗体,但许多检验工作者对如何进行HIV抗体定性质控并不重视。现将我们用S/CO值进行室内质控的体会报告如下。1材料和方法1·1仪器与试剂(1)中国航天工业总公司CF-5000酶标仪。(2)北京普朗新技术有限公司DNX-9620型电脑洗板机。(3)北京金豪制药有限公司产HIV1 2型抗体诊断试剂盒(ELISA法)。1·2方法(1)外部对照的制备:使用同一批号的试剂盒,对同一批号的阳性对照血清积攒混合,然后经3000r/min离心15min去除蛋白沉淀,56℃加热30min灭活处理,强阳性血清对倍稀释后,即可…     

HIV-1gp41NHR序列靶点专一性的荧光共振能转移测定

目的确定并利用荧光共振能转移法(FRET)对以HIV-1 gp41 N端七联重复序列(NHR)为靶点的融合抑制剂进行筛选和作用机制研究。方法 FRET采用金属络合物多肽技术设计针对不同结合位点、结合强度可调、涵盖全部NHR序列的靶点和探针,对HIV融合抑制剂进行高通量筛选。由于HIV在进行膜融合时其gp41的N端NHR和C端CHR可形成稳定的六螺旋结构,因此,利用圆二色谱仪对FRET所使用的靶点/探针对的结合强度进行验证,确定对应的靶点/探针对可形成稳定的六螺旋结构;同时,借助细胞活性测试测定抑制剂的活性,验证FRET是否可用于筛选以HIV-1 gp41 NHR为靶点的抑制剂。结果与结论 FRET中使用的靶点/探针均可形成螺旋度较高的六螺旋结构,其中Fe(Env2.0)3/CP2及Fe(Env5.0)3/CP5形成的α螺旋度分别高达89.6%和84.7%。FRET所使用的靶点/探针对专一性强、结合作用强,可用于进行HIV-1融合抑制剂的筛选和机制研究。     

血卟啉单甲醚光动力疗法对瘢痕成纤维细胞信号通路的影响

<正>目的:观察光动力疗法对TGF-β1及其下游信号蛋白的作用,阐明HMME-PDT在抑制瘢痕成纤维细胞(HSF)增殖的过程中,TGF-β1/Smads信号通路的作用。方法:原代培养增生期瘢痕组织来源的成纤维细胞,取对数生长期的4～6代细胞,分为对照组、光敏剂组、照光组和HMME-PDT组。     

血卟啉单甲醚光动力学疗法对体外培养的人角质形成细胞增生的影响

目的观察人角质形成细胞株Hacat对血卟啉单甲醚(hematoporphyrinmonomethylether,HMME)的吸收特性及HMME-PDT对角质形成细胞增生的影响。方法对数生长期的Hacat细胞分别与浓度为0、10、20和40μg/ml的HMME孵育1h;同时将另一实验组的Hacat细胞与10μg/ml的HMME分别孵育0和30min、1和2h,分别以流式细胞仪检测孵育时间和孵育浓度对Hacat细胞吸收HMME的影响;在此基础上,将Hacat细胞分别与0、2·5、5、10、20和40μg/ml的HMME孵育2h,用532nm的倍频Nd∶YAG激光以20mW/cm2的功率密度分别照射0、2·5、5、10、20min,同时设立完全空白对照组和单纯光敏剂组,24h后以MTT法检测Hacat细胞的存活率。结果Hacat细胞对HMME吸收量随着孵育浓度的增高和孵育时间的增加而增多。单独照光或以高达40μg/ml的HMME孵育对Hacat无明显杀伤(P>0·05)。在激光功率密度相同的情况下,HMME-PDT对Hacat细胞的杀伤呈孵育浓度和激光能量密度相关性。结论Hacat细胞对HMME吸收呈孵育浓度和孵育时间相关性,孵育浓度及激光能量密度是影响HMME-PDT杀伤效应非常重要的影响因素,在实验范围内的HMME-PDT能对Hacat细胞产生明显的杀伤作用。     

植物蛋白MAP30体外抗HIV-1的实验研究

体外观察苦瓜子抗HIV植物蛋白 30 (MAP30 )以及齐多夫足 (AZT)、阿昔洛韦 (ACV)、干扰素 α2a(IFN α2a)抗HIV 1的作用。以MT4为靶细胞 ,采用ELISA法测定药物对细胞培养上清HIV 1P2 4抗原的抑制作用 ,并观察药物对HIV 1致细胞病变效应的抑制效果。结果显示 ,MAP30具有明显的抗HIV 1作用 ,与一线抗HIV药物AZT作用相近 ,二者对HIV 1P2 4抗原的 5 0 %抑制浓度 (IC50 )分别为 0 .9μmol/L和 0 .7μmol/L ,它们对HIV 1的致细胞病变效应也有抑制作用。ACV及IFN α2a在所取浓度范围内对HIV 1无抑制作用。证实植物蛋白MAP30具有体外抑制HIV 1的作用。     

人淋巴细胞H9体外感染HIV-1后APOBEC3G mRNA水平的监测

目的：观察人淋巴细胞H9体外感染HIV-1后,在其细胞内APOBEC3G蛋白水平降低的同时,APOBEC3GmRNA的水平是否也下降,阐明HIV-1抵抗APOBEC3G蛋白抗病毒作用的机制。方法：H9细胞感染HIV-1后,在不同时间点收集细胞和培养上清,提取细胞总RNA,应用实时定量PCR检测APOBEC3G mRNA的水平。检测上清液的HIV-1 p24抗原含量验证H9细胞是否感染了HIV-1。结果：（1）采用？？CT相对定量PCR方法检测APOBEC3G mRNA水平,其准确性高于94%。（2）在体外水平,H9细胞在感染HIV后,APOBEC3G mRNA水平没有显著变化（P＆gt;0.05）。结论：HIV-1可能主要通过降低APOBEC3G蛋白的水平而抵抗其抗病毒作用,这比通过降低mRNA水平来抵抗APOBEC3G的抗病毒作用更为快速、有效。     

与HIV-1共感染的HHV-6毒株的分离、传代培养与鉴定

目的：对一株从中国河南省一名艾滋病患者体内分离的、可在MT4细胞上稳定传代的未知病毒29A进行鉴定，确定该病毒种类及型别。方法：用从该患者外周血单核细胞中分离的病毒株感染MT4细胞，获得可在该细胞上稳定传代的病毒株29A。通过细胞病变特征、电镜观察结果、HIV-1 p24抗原检测以及HIV-1 pol区基因扩增结果，对该毒株是否为HIV-1进行鉴别。在电镜下对病毒感染细胞的超薄切片进行观察，发现该病毒呈现疱疹病毒形态特征，因此设计人类疱疹病毒6型（HHV-6）U69、U16／U17、U60／U66三个不同基因片段的特异性引物并进行巢式PCR扩增，对扩增产物进行序列测定和结果分析。结果：该毒株HIV-1 p24抗原检测为阴性；用HIV-1 pol区特异性引物未扩增出目的片段；细胞病变形态不同于HIV-1引起的病变；电镜观察该病毒直径为160～200nm，明显大于HIV—1，表明该传代株不是HIV-1。用人类疱疹病毒6型（HHV-6）U69、U16／U17、U60／U66等基因的特异性引物均扩增出了目的片段，序列分析的结果表明该毒株为HHV-6病毒B亚型。结论：在国内首次从艾滋病患者的外周血淋巴细胞中分离出HHV-6，为进一步研究HHV-6和HIV-1的相互作用奠定了基础。     

HIV-1整合酶及其抑制剂研究进展

人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus-1,HIV-1)复制周期中的整合过程,是将HIV-1 DNA整合人宿主DNA的过程,也是HIV-1复制周期的不可缺少的过程。HIV-1整合酶(integrase,IN)参与整合全过程,催化整个整合反应,是HIV-1复制过程必不可少的酶,也是病毒稳定感染必不可缺的酶。抑制该酶活性将能有效的抗HIV-1。以前,由于HIV-1 IN溶解等困难、技术理论的滞后,限制了我们对此酶的了解。近年来,由于分析、分子生物学新技术新方法的应用,使它的结构信息、作用机理一步步被揭开。现IN已成为抗HIV-1研究中非常有吸引力的新的靶点。本文阐述了HIV-1整合酶的生化性质包括其结构、作用的分子机理、可能的抑制部位,以及近年来研究发现的整合酶抑制剂。     

广西首例HIV-1G亚型毒株的发现和近似全长基因组序列分析

目的获得广西首例HIV-1 G亚型毒株全长基因组序列并分析其来源。方法采集1例广西HIV感染者血浆,提取病毒RNA,利用逆转录巢式-PCR技术,分两段扩增病毒近似全长基因序列,对PCR产物进行核苷酸序列测定,利用MEGA软件对全长序列进行系统进化分析。结果获得了8800 bp长度的近似全长基因组序列,系统发育分析结果显示该毒株与HV-1 G亚型参考株成簇,Bootstrap值为99%,通过与世界上其他地区流行的HIV-1 G亚型毒株进行亲缘分析,该毒株与喀麦隆流行毒株的关系最近。结论在广西发现了首例HIV-1 G亚型感染者,推测该毒株是由境外传入的,应对广西地区流行的HIV-1毒株的来源和变异进行密切监测。     

广西首例HIV-1G亚型毒株的发现和近似全长基因组序列分析

目的获得广西首例HIV-1 G亚型毒株全长基因组序列并分析其来源。方法采集1例广西HIV感染者血浆,提取病毒RNA,利用逆转录巢式-PCR技术,分两段扩增病毒近似全长基因序列,对PCR产物进行核苷酸序列测定,利用MEGA软件对全长序列进行系统进化分析。结果获得了8800 bp长度的近似全长基因组序列,系统发育分析结果显示该毒株与HV-1 G亚型参考株成簇,Bootstrap值为99%,通过与世界上其他地区流行的HIV-1 G亚型毒株进行亲缘分析,该毒株与喀麦隆流行毒株的关系最近。结论在广西发现了首例HIV-1 G亚型感染者,推测该毒株是由境外传入的,应对广西地区流行的HIV-1毒株的来源和变异进行密切监测。     

不同临床分期的HIV患者的全脑弥散张量分析

目的:据报道HIV-1感染的患者,尤其在晚期患者中,脑白质的改变是主要的神经病理特征。本研究对照相应年龄的健康志愿者的正常脑白质图谱,对不同临床分期的HIV患者进行全脑的各向异性(FA)及表观扩散系数(ADC)值的统计学分析。方法:经书面同意后,征集22位健康志愿者(年龄40．8± 6．3岁)及29位HIV患者(年龄41．2±7．4岁)。根据临床标准,将HIV患者分为如下3期:HIV伴随痴呆(HAD)、轻度认知运动功能障碍(MCMD)及亚临床轻度认知运动功能障碍。使用单次激发平面回波扩散张量成像(EPI-DTI)序列及施加6 个方向的扩散梯度得到DTI图像。使用Siemens Allegra 3T MR系统。利用Tukey’s检验,对正常组及不同分期的患者组     

CXCR4 HIV-1抑制剂的设计合成及活性研究

目的设计、合成一系列新型四氢喹啉-苄基或苯并咪唑多胺类化合物,作为潜在的靶向CXCR4辅助受体的新型抑制剂,并测定其抗HIV-1活性。方法组合HIV-1辅助受体CXCR4抑制剂三氮构效团与CCR5部分药效团,设计并合成一系列新化合物并经1H-NMR、MS表征,用HIV-1ⅢB病毒测定化合物抑制活性。结果与结论设计合成的10个目标化合物未见文献报道。活性测试结果显示,四氢喹啉-苯并咪唑多胺类化合物具有较好的抗HIV活性（IC50〈1μmol/L）,四氢喹啉-苄基多胺类化合物活性较差（IC50〉8μmol/L）。     

新型治疗性疫苗能暂时抑制人类免疫缺陷病毒生长

西班牙研究小组的研究人员称,他们开发出了一种治疗性疫苗,能够暂时地抑制感染患者体内的人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)生长。这种疫苗是利用接触热灭活HIV的免疫细胞研制而成。研究人员针对36例HIV携带者进行测试,获得了这类治疗最好的记录结果。经过12周的临床试验,在22例接种疫苗的患者中,有12例HIV病毒载量降低了90%以上。11例接受对照     

血液制品病毒灭活／去除技术平台的建立与应用

目的：建立血液制品病毒灭活／去除技术并应用于血液制品的病毒灭活／去除工艺验证。方法建立指示病毒库以及S／D处理法、低pH孵放法、干热法、巴氏消毒法、纳米膜过滤法等血液制品病毒灭活／去除技术,采用细胞病变法测定病毒滴度,Spearman和Karber法计算病毒滴度,病毒滴度降低量（ LRV）≥4判为有效,对企业的血液制品样品进行病毒灭活／去除验证。结果 S／D处理法和低pH孵放法可有效灭活有包膜指示病毒,干热法和巴氏消毒法可有效灭活有、无包膜指示病毒,纳米膜过滤法可在一定过滤量范围内去除PPV指示病毒。结论所建立的血液制品病毒灭活／去除技术可用于血液制品的病毒灭活／去除工艺验证,以提高血液制品的病毒安全性。