甜菜BvM14-CCoAOMT基因的克隆、表达及生物信息学分析

以甜菜M14品系为试验材料,利用反转录PCR(RT-PCR)克隆获得了甜菜M14品系木质素合成相关基因咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因(BvM14-CCoAOMT)的c DNA全长。生物信息学分析结果表明,BvM14-CCoAOMT基因具有咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因家族的典型结构域;系统发育分析表明,BvM14-CCoAOMT基因与松叶菊(Mesembryanthemum crystallinum)CCoAOMT基因亲缘关系较近。荧光定量PCR结果表明,BvM14-CCoAOMT基因在甜菜M14品系的茎中表达量最高,盐胁迫下BvM14-CCoAOMT基因在甜菜M14品系茎和叶中均显著上调表达。亚细胞定位研究发现BvM14-CCoAOMT蛋白在细胞各个亚细胞部位均有分布。本研究为进一步深入研究BvM14-CCoAOMT基因的功能奠定了理论与材料基础。     

甜菜M14品系特异表达基因BvM14-MADSbox启动子的克隆及序列分析

甜菜M14品系是带有白花甜菜染色体的栽培甜菜单体附加系,其染色体组成中除了包含18条栽培甜菜染色体外,还附加有白花甜菜第9号染色体,具有无融合生殖特性,无融合生殖能够固定杂种优势.在前期工作中,通过SSH、RACE等技术获得了甜菜M14品系特异表达基因BvM14-MADSbox的eDNA全长.通过6种限制性内切酶分别酶切M14品系基因组总DNA,再与相应接头连接,构建了6个DNA步移文库.根据基因BvM14-MADSbox cDNA序列设计引物,通过染色体步移技术克隆出该基因的上游DNA序列.经生物信息学分析,推测获得了BvM14-MADSbox基因上游1 718 bp的启动子序列,该序列含有启动子的基本元件TATA-box、CCAAT-box,和ARE、ERE、HSE、ABRE、CGTCA-motif等重要的顺式调控元件及一些光反应相关元件.该结果为今后BvM14-MADSbox基因的时空特异性表达调控机制奠定基础.     

甜菜BvM14-MADSbox基因启动子的组织特异性表达

MADS - box基因在植物的花器官和各种营养器官中均有不同形式的时空表达模式,行使不同功能.实验室前期获得了甜菜M14品系BvM14 - MADS box基因的特异启动子Pbm,并对其进行了瞬时表达.本试验利用含有重组载体pBI121 - Pbm - GUS的农杆菌转化烟草,对报告基因GUS在转基因烟草各组织表达特...     

甜菜M14品系特异表达基因ESTs的生物信息学分析

甜菜M14品系具有无融合生殖特性,为了获得M14品系特异表达的基因,本实验室前期利用抑制消减杂交(SSH)和mRNA差异显示(DDRT-PCR)技术对M14品系和能够进行有性生殖的栽培甜菜A2Y品系进行了基因特异表达研究,获得了298条M14品系特异表达基因的ES-Ts。对这些ESTs进行生物信息学分析并进行了GO分类,筛选出5条可能与基因表达调控和细胞周期调控相关的ESTs,为进一步获得这些基因的全长序列并研究其功能奠定了基础,也为今后能在甜菜M14品系中寻找并克隆与无融合生殖相关的基因提供了可靠的保证。     

利用生物信息学技术构建分析甜菜M14品系盐胁迫下参考转录组数据库

生物信息学(Bioinformatics)是一门计算机科学技术与生命科学的交叉学科,它通过综合利用生物学、计算机科学和信息技术揭示大量生物数据所赋有的生物学意义。目前利用生物信息技术对植物逆境环境下的基因组学、转录组学及蛋白质组学的数据挖掘,已成为功能基因组学的研究热点。甜菜M14品系具有野生白花甜菜(Beta corolliflora Zoss.)的耐盐性优良性状。为了对盐胁迫下的甜菜M14品系进行转录组分析及差异基因筛选,本研究构建了甜菜M14品系盐胁迫参考转录组文库,并对文库进行了测序以及数据的生物信息学分析,在参考转录组中鉴定得到54 843个Unigenes,并对这些Unigenes进行功能注释、GO及COG功能分类,为下一步研究甜菜M14品系耐盐基因资源挖掘奠定了重要基础。     

利用SSH技术分析盐胁迫下甜菜M14品系的差异基因

甜菜M14品系是利用野生白花甜菜(Beta corolliflora Zoss.)与栽培甜菜(Beta vulgaris L.)进行种间杂交及回交获得的附加有野生白花甜菜第9号染色体的单体附加系,具有野生白花甜菜的一些优良性状。本研究利用抑制消减杂交技术,以未处理的甜菜M14品系叶片作为Driver,以500 mmol·L-1NaCl处理的甜菜M14品系叶片作为Tester,构建了盐胁迫下甜菜M14品系抑制消减cDNA文库;以地高辛为标记物,进行反向Northern Blot杂交筛选并测序,共获得盐胁迫下甜菜M14品系特异ESTs序列449个,组装后共得到58条Unigenes,并将测序所得结果进行了GO分类。该研究为进一步鉴定和挖掘甜菜M14品系新的优质基因资源奠定了基础。     

甜菜氮代谢相关蛋白BvAMT3-3基因的克隆及生物信息学分析

AMT蛋白是一类铵转运蛋白,参与植物对铵态氮的吸收和运输,在植物生长发育、代谢以及胁迫应答等过程中起着重要作用.为进一步探究BvAMT3-3基因(XM_010669058)在甜菜中应答氮胁迫的分子机制,通过RT-PCR方法在甜菜体内克隆获得了Beta vulgaris ammonium transport-er3-3(...     

甜菜硝酸还原酶全长基因的克隆及其在缺氮胁迫下表达与活性分析

用50 mmol·L-1KNO3溶液处理的甜菜幼苗提取总RNA,通过RT-PCR法从甜菜总RNA中分离得到一个硝酸还原酶基因,其cDNA长2 760 bp,包含了完整的基因编码序列,与已公布的硝酸还原酶基因序列相似性达99%.同时利用活体测定法检测了经缺氮胁迫不同时间后甜菜叶中NR活性,并利用NR片段引物进行半定量RT-PCR,检测了基因的表达量.结果表明,随着缺氮处理时间的延长,甜菜叶中的NR活性随诱导时间增加活性逐渐降低,在缺氮处理1 h,其活性便有明显的降低;而NR的mRNA受缺氮胁迫下调表达,暗示着NR基因的表达与氮诱导相关.     

甜菜M14品系Cystatin基因植物蛋白纯化表达载体的构建及转化烟草

植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂是一类具有提高植物对各种生物及非生物胁迫抗逆性的重要蛋白质。利用前期获得的甜菜M14品系半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的编码区序列构建了带有His标签的甜菜M14品系半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的植物蛋白纯化表达载体,并将其转化烟草,获得T0代阳性转基因植株,为下一步利用融合蛋白的His标签从转基因烟草中大量纯化甜菜M14品系半胱氨酸蛋白酶抑制剂奠定了基础。     

2个大豆VOZ转录因子的克隆及非生物胁迫表达分析

为探究大豆维管植物锌指蛋白（VOZ）转录因子的序列特征和非生物胁迫表达模式,采用实时荧光定量PCR对Gm VOZ1-1,Gm VOZ1-2在非生物胁迫下的表达量进行检测,并对其进行克隆及序列分析．Gm VOZ1-1,Gm VOZ1-2对干旱、高盐、低温胁迫均存在响应,且干旱胁迫下表达量升高最明显．Gm VOZ1-1位于大豆6号染色体上,Gm VOZ1-2位于大豆13号染色体上,分别编码含有478,459个氨基酸的蛋白质,它们均含有1个保守的VOZ结构域．Gm VOZ1-1,Gm VOZ1-2均含有1个核定位信号,预测均为细胞核蛋白．Gm VOZ1-1与白羽扇豆La VOZ的亲缘关系最近,GmVOZ1-2与蒺藜苜蓿Mt VOZ的亲缘关系最近．     

斑马鱼HAS2基因的克隆、抗体制备及分析

HAS2是斑马鱼心脏发育的一个标志基因,为了利用斑马鱼动物模型进一步研究HAS2基因在心脏发育中的功能,采用生物信息学结合RT-PCR的方法获得了斑马鱼HAS2基因的片段.将所得的片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,并将重组质粒(pGEX-4T-1-HAS2)转化大肠杆菌(E.coli)BL21,IPTG诱导表达GST-HAS2融合蛋白;通过尿素洗涤沉淀蛋白并切胶回收纯化融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体活性.生物信息学分析结果表明:斑马鱼HAS2基因的开放阅读框含有1658 bp,编码552个氨基酸;SDS-PAGE电泳分析显示,IPTG诱导表达的融合蛋白相对分子质量约为4.5×104;Western blotting分析表明,制备的抗体具有良好的特异性.     

斑马鱼hand2基因的克隆、抗体制备及分析

为利用斑马鱼动物模型进一步研究bHLH转录因子家庭重要成员hand2基因在心脏发育中的功能,采用生物信息学结合RT-PCR的方法获得了斑马鱼hand2基因.将所得片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,并通过IPTG诱导表达出GST-Hand2融合蛋白,经GST亲和层析法纯化后,免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,利用western blotting和免疫组化的方法对抗体进行分析.分析表明:斑马鱼hand2基因成熟肽编码区含有627 bp,编码208个氨基酸,与人Hand2蛋白的同源性达到83%;IPTG诱导表达后,表达的融合蛋白占菌体总蛋白的71%,经GST纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带.融合蛋白相对分子质量约为49 000.分析表明,制备的抗体具有很好的特异性.     

赤眼鳟TRIF基因cDNA克隆及其组织表达分析

为探究诱导β干扰素包含TIR结构域的接头分子(TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β,TRIF)是否参与赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)抗病免疫反应,克隆获得了2 263 bp的赤眼鳟TRIF基因(Sc TRIF)全长c DNA.研究结果显示Sc TRIF具有TIR结构域,Sc TRIF和同属亚罗鱼亚科的草鱼TRIF聚为一支.该基因在赤眼鳟12个组织中均有表达,其中鳃中表达水平最高.感染草鱼呼肠弧病毒后,头肾和脾脏组织中Sc TRIF表达水平均呈现先下降后上调的趋势.研究表明Sc TRIF参与赤眼鳟抗GCRV病毒的免疫应答反应.     

甜菜单体附加系M14与栽培甜菜蛋白质的SDS-PAGE比较分析

利用SDS- PAGE电泳比较分析了甜菜单体附加系M14与栽培甜菜在花蕾期蛋白水平上的差异.对甜菜单体附加系M14与栽培甜菜花蕾期蛋白的SDS-电泳图分析后,样品分别获得41与40条蛋白质条带,以栽培甜菜为对照甜菜单体附加系M14在花蕾期特异表达了3条蛋白质带,表达缺失了2个条带,初步推测其中可能有与M14进行无融合生殖相关蛋白质.     

大鼠睾丸特异表达新基因Lrrc18的克隆及表达谱分析

运用数据库消减杂交(Digital Differential Display,DDD)分析方法,从大鼠睾丸组织中分离出了一个新基因-Lrrc18(GenBank登录号:BC081908).该基因定位于大鼠染色体16p16区带,gDNA在染色体上跨度40 900 bp,含6个外显子,编码一个含256个氨基酸的蛋白,带有4个LRR(leucine-rich repeat domain)结构域.Northern杂交结果显示Lrrc18只在睾丸中表达.对出生后3~56 d不同时期的大鼠睾丸的Lrrc18基因的表达进行检测,结果表明在大鼠出生后21 d时开始在睾丸组织中可检测到Lrrc18的mRNA表达,以后其表达量逐步上升,到42 d时达到最大值.该结果提示:Lrrc18基因在精子的发生过程中可能起重要作用.     

杆状病毒SeMNPV Se29基因的克隆、表达与抗体制备

目的:克隆和表达甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodoptera exigua multieapsid nueleopolyhedrovirus,SeMNPV) ORF29全长基因(Se29),制备SE29蛋白的多克隆抗体,方法:用PCR的方法扩增得到Se29基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌B...     

辣椒疫霉菌PcPLD8基因的克隆和表达分析

为了探究磷脂酶D在辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)致病过程中的作用,从辣椒疫霉菌株LT1534中克隆到1个磷脂酶D基因,命名为PcPLD8.PcPLD8基因开放阅读框(ORF)长1596 bp,编码一个含531个氨基酸的蛋白质,相对分子质量为60689,理论pI为4.85,具有两个保守的HKD基序...     

人HtrA1基因的生物信息学分析

丝氨酸蛋白酶1(High-temperature requirement factor A1,HTRA1)属于HTRA家族的重要成员.为了对人HtrA1基因编码的蛋白质进行结构特征和分子功能分析,运用多种生物信息学数据库分析人HTRA1蛋白的同源性、理化性质、亲/疏水性、信号肽以及亚细胞定位,构建二级/三级蛋白质空间结...