ZmPti1基因正义和RNAi表达载体的构建及其转化玉米的研究

构建了ZmPti1基因的正义表达载体和RNAi载体,以bar基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将构建的两个表达载体分别转化到玉米自交系178.收获的种子播种于营养钵中,出苗后,经0.1%的草丁膦筛选得到40株草丁膦抗性植株,进一步用PCR鉴定与PCR-Southern检测得到33株转基因植株,其中15株是转化正义表达载体的转基因植株,18株是转化RNAi表达载体的转基因植株.并对转化方法和ZmPti1基因的功能进行了讨论.     

甘蓝型油菜CONSTANS基因植物过表达载体构建及转基因植株的获得

甘蓝型油菜CONSTANS目的基因的克隆以NCBI上公布的序列设计全长扩增引物进行扩增。对目的基因片段测序并进行酶切位点分析,设计酶切引物(BamHⅠ,SacⅠ),通过BamHⅠ和SacⅠ双酶切将目的基因片段连接在真核表达载体pBI121上,PCR鉴定结果表明PBI121+CONSTANS过表达载体已成功构建。将过表达载体转化感受态EHA105细胞,通过拟南芥花絮侵染T0代种子,用含卡拉霉素(50 mg/L)的MS固体培养基进行筛选,获得阳性植株。通过PCR鉴定,结果表明PBI121+CONSTANS过表达载体已成功导入拟南芥中,获得转基因阳性苗12株,为下一步基因功能分析做好了准备。     

红掌漆酶基因Lac的表达载体构建与剑麻转化

用RT-PCR从红掌品种亚利桑那的cDNA中扩增出漆酶基因Lac并得到的基因的全长.将Lac片段克隆到pMD18-T载体,然后将此基因插入pBI121的CaMV35S启动子后取代原载体中的GUS基因构成表达载体pBI121-Lac.通过冻融法将表达载体导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404,并转化剑麻获得转基因植株.对转化植株进行的基因组PCR分析结果表明,Lac基因已成功的整合到剑麻的基因组中.转漆酶基因植株的获得为剑麻抗性的提高提供了可能性,并且为以后研究漆酶的具体功能提供了方便.     

苏云金芽孢杆菌cry1基因的克隆、植物表达载体的构建及转化大豆

此研究利用醋酸钠-抗生素加热法从土壤中分离获得1株产晶体的苏云金芽孢杆菌菌株（Bacillus thuringiensis）。通过已知cry1基因设计引物,以分离得到的菌株DNA为模板进行PCR扩增,将克隆到的目的片段进行测序。测序结果表明：该序列与cry1基因同源性达到90%~99%。将该基因连接到植物双元表达载体pBI121中,构建了该基因的植物表达载体,并将阳性重组质粒转化根癌农杆菌EHA105,利用农杆菌侵染子叶节的方法进行大豆的转化。通过初步的PCR验证,成功获得了转基因植株,建立了大豆的转化体系。     

水稻质膜H+-ATPase基因对拟南芥遗传转化及其抗盐性分析

RT-PCR扩增得水稻质膜H -ATPase全长cDNA(PM-H -ATPase),构建了植物表达载体获得质粒pBI121-PM-H -ATPase,农杆菌介导、真空渗入法转化PM-H -ATPase基因入拟南芥,得35株T1代卡那抗性植株.抗性植株PCR分析表明,抗性植株整合了目的基因.Northern杂交分析进一步表明T3代转基因拟南芥表达了目的基因.抗盐(NaHCO3和NaC1)性分析表明:转基因植株的耐盐能力明显高于野生型;盐碱胁迫下转基因植株开花优先于野生型植株.     

转Cry1A基因海岛棉的获得和鉴定

进行农杆菌介导转抗虫基因试验，以期选育抗虫性优良的海岛棉新品系(品种)；本实验在海岛棉体细胞胚再生体系的基础上，将携带Cry1A基因的表达载体pBI121通过农杆菌介导法转化到‘新海33号’的胚性愈伤组织中。经培养基筛选、PCR检测、RT-PCR检测、抗虫性鉴定等筛选抗虫后代。经培养基筛选共获得12棵抗性植株。PCR检测结果显示，这12棵抗性植株均能扩增出了大小相符的片段，检测结果呈阳性；RT-PCR结果显示，12棵转基因植株目的基因已经整合入基因组，且能反转录出mRNA；Bt-Cry1Ab/Ac转基因试纸条检测结果表明这12棵转基因植株含有目的蛋白；抗虫性鉴定结果证实了这些转基因植株对棉铃虫幼虫具有一定的抗性。本研究成功将抗虫基因导入至海岛棉的体内，获得了具有抗虫性的植株，其结果对转基因抗虫海岛棉新品种的培育具有一定的参考价值。     

马铃薯卷叶病毒外壳蛋白基因克隆转化 及其转基因后代的表达

根据GenBank中的马铃薯卷叶病外壳蛋白基因(PLRV-CP)全序列，设计一对特异性引物，以马铃薯卷叶病毒RNA为模板，克隆了马铃薯卷叶病外壳蛋白基因，在pBI121的基础上构建了植物表达载体。利用PLO(Poly-L-Ornithine)将PLRV-CP基因导入到马铃薯加工型品种大西洋的原生质体中，获得了转基因后代。在5株转化后代中扩增出长度为610bp的目标DNA片断，说明导入的外源PLRV-CP基因已经整合到马铃薯基因组中。Southern blot分析结果进一步证明了PCR结果的正确性。RT-PCR结果表明，在3株转化后代叶片中具有阳性表达。马铃薯卷叶病毒接种实验结果表明，转基因植株比对照有明显的马铃薯卷叶病抗性     

蚜虫基因RNAi载体的构建及其在转基因烟草中dsRNA的表达分析

RNAi机制可以通过dsRNA诱导同源mRNA的降解,从而导致该基因转录后沉默。RNA干扰作用从发现以来就具有了利用转录后基因沉默（PTGS）来进行抗虫的一种潜在可能性。针对dsRNA的这种作用,研究中提取蚜虫RNA,克隆出蚜虫Cathepsin B基因的干扰片段并构建出RNAi载体,转入本氏烟草中,在转基因烟草体内表达dsRNA。成功构建RNAi载体后,通过农杆菌转化和叶盘法将RNAi载体导入烟草中并采用组织培养方法培养出转基因烟草,通过PCR鉴定显示15株生根的转基因烟草中14株显示阳性。提取转基因烟草的RNA进行RT-PCR和Northern表达分析显示转基因烟草植株中dsRNA表达的存在。实验结果说明了在转基因植物体内表达RNAi载体可以产生dsRNA,从而在蚜虫进食植物时达到利用dsRNA抗蚜虫的作用。     

水稻抗旱基因OsbHLH120 RNAi干扰载体的构建及遗传转化

OsbHLH120是一个参与非生物胁迫响应基因,与水稻的抗旱性密切相关。本研究根据RNAi表达载体设计原则,从水稻日本晴基因组DNA扩增OsbHLH120基因片段,将长度400 bp干扰目的片段通过正反两个方向与载体p TCK303连接。从pTCK303载体的启动子、终止子和Rice Itron结构中设计两对检测引物,直接将检测引物的PCR产物测序验证载体是否构建成功。通过农杆菌介导法将构建的OsbHLH120RNAi干扰表达载体导入水稻品种日本晴,获得18株转基因阳性苗。本研究结果将有利于进一步研究OsbHLH120在水稻抗旱过程中的作用。     

农杆菌介导的RNAi CP基因在大豆中的转化

花叶病毒(soybean mosaic virus, SMV)病是大豆主要病害之一,生产上常采用种植抗性品种方法来防治。本研究以RNA干扰花叶病毒衣壳蛋白(coat protein, CP)基因为表达载体,Bar基因作为筛选标记基因,成熟子叶节为外植体,采用农杆菌介导法获得了22株T₀代转基因大豆生根苗,经草丁膦涂抹、Bar试纸条和PCR法鉴定,获得RNAi CP转基因植株18株;对转基因植株T₁代的遗传分析表明,外源基因能够稳定遗传到下一代且符合孟德尔遗传规律;T₁代Southern杂交表明,导入的干扰片段为单拷贝;花叶病毒摩擦接种表明RNAi CP转基因大豆植株具有抗花叶病毒特性;摩擦接种后3周,DAS-ELISA检测进一步表明,RNAi CP转基因植株花叶病毒检出率仅为7.69%,而非转基因植株为100%。这表明RNAi花叶病毒CP基因可用于抗大豆花叶病毒的研究。     

农杆菌介导的hIL-12基因转化马铃薯的研究

构建CaMv35S启动子驱动人白细胞介素12基因(hIL-12)的植物表达载体pBI121-hIL-12,通过三亲杂交法将重组载体导入根癌农杆菌菌株EHA105,农杆菌介导法转化马铃薯茎段,经卡那霉素抗性筛选,获得28株抗性植株。通过PCR检测,22株为阳性,从PCR阳性植株中随机选取5株,ELISA法检测茎和叶中hIL-12的表达量,其中2株与对照组相比有显著性差异(p<0.001),hIL-12的表达量分别为(3 714.0±48.8)pg/g和(3 465.0±185.0)pg/g,初步表明外源基因hIL-12已经整合进马铃薯基因组中并得到了表达,为进一步研究重组hIL-12的分离纯化和生物学活性奠定了试验基础。     

牡丹ACS基因片段的克隆及反义植物表达载体构建

根据GenBank登录的牡丹ACS基因DNA全长序列(FJ769773),设计一对特异性引物,在优化的PCR扩增体系的基础上,应用高保真DNA聚合酶KOD-Plus从洛阳红牡丹叶片总DNA中扩增出牡丹ACC合成酶基因片段PsACS-4。测序结果表明:克隆序列长970 bp,不包含牡丹ACS基因内含子序列,与目标序列同源性达100%;用SacI和SmaI对重组质粒和空载体pBI121双酶切、连接,将PsACS-4基因片段反身插入到植物表达载体pBI121的35S启动子下游,成功构建了牡丹ACS反义基因植物表达载体。     

花粉管通道法转化大豆的分子表征

采用花粉管通道技术将含有gus基因的pBI121质粒DNA导入辽豆14，从处理的100朵花中获得53粒种子。经PCR检测53粒种子的幼苗，共检测出6株阳性植株。采用RT—PCR和GUS组织化学染色法对所获得阳性植株进行检测，其中2株幼苗(T0代17号和33号)均出现阳性结果，进一步对这2株阳性植株进行Southern blot检测，同样获得了阳性结果。上述检测结果表明，gus基因已整合到染色体上并得到了表达。对转基因植株后代进行了PCR跟踪检测，结果从17号株系的28株中检测出19株阳性植株，33号株系的35株幼苗中检测出17株阳性植株，表明gus基因可以在转基因植株后代遗传。本研究结果为大豆花粉管通道转化技术提供了比较充分的分子生物学证据。     

拟南芥AtZFN3基因RNA干扰载体的构建与表达

为了构建具有发夹结构的RNAi表达载体来研究拟南芥AtZFN3基因表达的效果。根据拟南芥(Arabidopsis thaliana)锌指蛋白AtZFN3基因序列,设计含有酶切位点的两对特异性引物。以拟南芥cDNA为模板,分别合成用于构建干扰载体的正、反义DNA片段,将正、反义片段分别插入表达载体pART27的相应位置上,构建含有发夹结构的RNAi载体pART-ZFN3。利用农杆菌介导法,将pART-ZFN3转化到拟南芥中,PCR检测证实获得了5株转基因植株,经荧光定量PCR检测,证明了转基因植株中AtZFN3基因表达量显著低于未转基因的植株。结果表明:具有发夹结构的RNAi载体pART-ZFN3已构建成功,它对拟南芥AtZFN3基因的表达具有抑制作用,为深入分析拟南芥AtZFN3基因功能提供了基础。     

苹果抗ASPV病毒RNAi载体构建及转化砧木M26的研究

为获得抗病毒的转基因植物新材料,采用同源重组法构建了抗苹果茎痘病毒的植物表达载体,并对苹果砧木材料M26进行了遗传转化,成功获得了转基因阳性植株。首先以感病的皇家嘎拉叶片为材料,反转录合成c DNA第一链,采用PCR方法克隆获得了489 bp的ASPV外壳蛋白基因的保守片段,通过TOPO克隆技术将该基因片段连接进入载体p ENTR/SD/D,构建了入门克隆载体p EN-ASPV,再通过LR反应置换该片段连接进入目标载体p Hellsgate12,构建了RNAi植物表达载体Phe-ASPV,并采用冻融法转入根癌农杆菌菌株EHA105中,获得了可用于植物遗传转化的工程菌EH-ASPV。采用农杆菌介导的方法转化苹果砧木M26叶盘,经抗生素筛选和脱菌培养获得了Kan抗性芽,进一步进行生根培养后获得了完整的Kan抗性植株,对生根植株提取总RNA后RT-PCR检测结果显示,RNAi表达载体上携带的外源基因片段(489 bp)已成功转入苹果砧木材料M26中,并在转基因植株内RNA水平上得到表达。获得的转基因新材料,为进一步通过病毒接种进行抗病性评价及抗病毒分子育种奠定了基础。     

种子特异表达启动子的克隆分析及其植物表达载体的构建

根据GenBank已公布的种子特异性的Oleosin蛋白基因启动子序列设计合成引物,利用PCR技术从油菜总基因组DNA中扩增出Oleosin基因启动子序列(SOP),将该序列克隆到pGM-T载体中,经鉴定获得pGM-T-SOP重组载体。测序和序列分析表明,该启动子序列由899 bp核苷酸组成,其核苷酸序列与GenBank中的Oleosin基因启动子序列同源性高达95.6%。分别用限制性内切酶HindⅢ和BamH I双酶切重组质粒pGMT-SOP和双元植物表达载体pBI121,分别回收pGMT-SOP重组质粒中的SOP小片段和pBI121植物表达载体中去掉CaMV35S组成型启动子的大片段,经连接、转化和鉴定,获得由SOP驱动报告基因GUS的新型植物表达载体pBI121-SOP,为外源基因在油菜种子中的定位表达研究奠定基础。     

CspB基因植物表达载体的构建及转化玉米自交系的研究

利用来自Bacillus subtilis细菌的CspB基因(Gene ID:936224)构建了Ubiquitin启动子驱动的CspB基因植物表达载体PBPC-CspB-bar,以bar基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将构建的表达载体转化到玉米自交系京501、京517和吉444,通过喷洒除草剂筛选得到60株草丁膦抗性植株,用PCR检测得到48株bar基因阳性植株,将获得的转基因植株进行CspB基因PCR鉴定,获得13株同时整合CspB和bar的转基因株系。     

紫花苜蓿锌指蛋白基因RNAi表达载体的构建及在苜蓿的转化

根据紫花苜蓿锌指蛋白MsZFN基因(GenBank登录号为EU624138)序列,设计两对含有酶切位点的特异性引物,以紫花苜蓿cDNA为模板,分别合成用于构建干扰载体的正反义片段,将正反义片段分别插入表达载体pART27的相应位置,构建成含有发夹结构的RNAi载体pART-F-R。利用农杆菌介导方法,将pART-F-R转化到紫花苜蓿中,经过PCR检测,获得了3株转基因植株。经过RT-PCR检测,证明转基因植株中MsZFN基因表达量明显低于未转基因的植株。结果表明,已构建成功具有发夹结构的RNAi载体pART-F-R,它可有效的抑制紫花苜蓿MsZFN基因。     

pBAR载体构建及其转化罗汉果的分析

为了创制可免除人工授粉的转基因罗汉果雌性品系,利用植物双元表达载体pBI121-Gus,构建幼果实特异启动子2A11与单性结实相关基因rolB的嵌合基因表达载体pBAR (pBI121-2A11-rolB)。以罗汉果雌株叶盘为材料,以EHA105农杆菌介导遗传转化,经PCR扩增,鉴定出阳性植株,对阳性雌株进行扩繁、生根,最后移栽大田,并观察转基因植株的单性结实性状表现。结果显示,成功构建了单性结实相关基因的pBAR嵌合双元表达载体;转化感受态根癌农杆菌EHA105后,进一步转化雌株叶片,经过对叶片分化苗的检测,得到7株阳性植株,转化率为14.29%。为提高成活率,扩繁7株阳性植株,获得37株转基因单性结实植株株系,其中有8株正常开花,占总数的21.62%,正常开花的植株,未经人工授粉,发育成幼果,表现出单性结实性状。本实验在克隆单性结实相关基因和果实特异启动子的基础上,构建嵌合基因载体,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法,获得了转基因罗汉果单性结实雌株系,为后续研究罗汉果单性结实性的遗传、生理、品种综合改良和深入利用提供了基础。