人胸腺基质淋巴生成素基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的: 构建含人胸腺基质淋巴生成素基因(TSLP)的重组腺病毒载体并表达, 以研究其免疫学功能。方法: 将由人胚肺细胞扩增得到的TSLP基因, 克隆于真核表达载体pcDNA3. 1中, 再亚克隆至穿梭质粒pShuttle中, 并与腺病毒骨架载体pAdEasy -1共同转化大肠杆菌。以获得的重组质粒线性化后转染HEK293细胞, 并包装成病毒颗粒。采用PCR法对重组腺病毒基因进行鉴定, 并以Westernblot检测TSLP蛋白的表达。结果: 通过细菌内同源重组, 成功构建带有人胸腺基质淋巴生成素基因的重组腺病毒质粒, 转染 293细胞后, 包装的重组病毒经PCR检测表明, 基因组含有目的基因,病毒的滴度可达 1×1011pfu/L。Westernblot证实, 感染的肿瘤细胞中有相应基因产物的表达。结论: 通过菌内重组可高效制备带有特定基因的重组病毒。所制备的Ad -TSLP可成功表达相应基因产物, 为进一步研究这一新型细胞因子的功能奠定了基础。     

异亮氨酸拉链修饰的可溶性CD40L在巴斯德毕赤酵母中的表达

为了获得异亮氨酸拉链修饰的可溶性CD40L（IZ—sCD40L）在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达。首先用PCR和重叠PCR的方法得到了IZ—sCD40L基因片段。然后构建了巴斯德毕赤酵母表达质粒pPICZaA—IZ—sCD40L．核酸测序分析表明IZ—sCD40L的基因片段正确克隆到pPICZaA质粒中。将其线性化后。电转化到巴斯德毕赤酵母GS115中，PCR筛选阳性重组菌株，经表型鉴定后，用甲醇进行诱导表达。经SDS—PAGE和Western blot印迹杂交结果证实了表达产物为重组IZ—sCD40L的融合蛋白。     

人GDF-5重组腺病毒载体的构建及其在人间充质干细胞中的表达

本研究目的在于构建携带GDF-5基因的重组腺病毒表达载体,并用其感染人骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)研究GDF-5的表达。从含有人GDF-5基因核心序列的质粒pCMV-SPORT6上通过PCR扩增GDF-5,将其酶切连接到穿梭质粒pAdtrack-CMV上,在BJ5183中和骨架质粒pAdeasy-1同源重组,筛选阳性克隆并酶切鉴定,线性化后磷酸钙法转染入人胚肾293细胞中包装、扩增,得到含有GDF-5基因的重组腺病毒并测定其滴度。用收集的腺病毒感染靶细胞MSCs,在基因水平检测GDF-5的表达情况。结果表明,成功构建了含有GDF-5基因的重组腺病毒载体,病毒滴度为1×109PFU/ml。重组腺病毒能有效感染MSCs并表达目的基因。通过构建该腺病毒并感染人MSCs可得到能持续一定时间表达GDF-5蛋白的MSCs,为这种转基因的MSCs进一步修复组织奠定了基础。     

共表达IκBα-IRES2-CD40L胞外区双基因的腺病毒载体构建及鉴定

目的:构建含有分泌型人CD40L胞外区(shCD40L)和IκB的双基因共表达的腺病毒载体。方法:分别扩增出目的基因片段shCD40L、IκB和IRES2,将目的基因进行连接,得到IκB-IRES2和shCD40L两个基因片段,将其分别导入pGEMT-easy载体进行亚克隆扩增,测序正确后,再将连接成功地两个目的基因片段与分别与载体pshuttle-CMV连接获得穿梭质pshuttle-CMV-shCD40L和pshuttle-cmv-IκB-IRES2,将穿梭质粒在DH5α感受态细胞中扩增。再与AdEasy-1-BJ5183菌同源重组,得到含有两个目的基因的腺病毒骨架,脂质体法转染293细胞,包装成具有感染能力的共表达IκB-IRES2-shCD40L腺病毒颗粒。PCR法对腺病毒的上清液中的表达差异进行鉴定,检测病毒滴度,并用其感染细胞PK15和293细胞以检验其安全性。结果:所构建的IκB-IRES2-shCD40L基因的重组腺病毒,经酶切和PCR鉴定正确,原代腺病毒的滴度达到6.561×1012pfu/L,PCR法从提取的病毒上清液中分别扩增出了是shCD40L(600bp)和IKBa(700bp)的特异性片段,感染了腺病毒后的PK15细胞形态未见明显异常,但293细胞出现了明显的气球样变。结论:成功构建了共表达IκBα-IRES2-shCD40L双基因的腺病毒载体。     

1人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体.方法 以pUCm-TLR4质粒为模板,运用PCR技术扩增TLR4胞外区目的 基因片段,片段回收后经酶切连接穿梭质粒pAdTrack-CMV上,获得重组腺病毒质粒pAdTrack-CMV-TLR4.通过Kpn Ⅰ和HindⅢ双酶切,测序鉴定后,将鉴定正确的质粒经PmeⅠ酶切线性化后,转化到含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态细菌BJ5183中,进行同源重组,卡那抗性筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR技术,Western blot等方法鉴定重组腺病毒,并进行病毒滴度测定.结果 人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体构建正确,病毒滴度为3.2×109pfu/mL.结论 成功构建了人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体,为下一步实验奠定基础.     

CTLA4Ig重组腺病毒载体的构建与体外表达

目的:构建含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体,为下一步在动物模型体内表达和基因治疗提供基础。方法:自行设计一对分别含有BglⅡ及HindⅢ酶切位点的CTLA4Ig基因上下游引物,以质粒PCDNA3.0/CTLA4Ig为模板,通过PCR扩增获得CTLA4Ig基因全部序列。片段回收以后经BglⅡ及HindⅢ双酶切,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV的启动子下游BglⅡ及HindⅢ位点之间,获得重组质粒pAdTrack-CTLA4Ig。通过BglⅡ/HindⅢ双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体pAdTrack-CTLA4Ig与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。结果:成功构建了含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒,病毒滴度为1.65×10¹²PFU/L。结论:该重组腺病毒的构建为下一步研究其在哺乳动物细胞内表达、研究CTLA4Ig的生物学活性及移植排斥、自身免疫病的基因治疗提供了一定的基础。     

腺病毒介导CTLA4Ig基因修饰骨髓间质干细胞体外抑制免疫应答的研究

目的:通过腺病毒载体介导CTLA4Ig在大鼠骨髓间质干细胞(MSC)中的表达,探讨MSC作为基因转移靶细胞的可行性和转染效率,研究其在体外对免疫应答的抑制作用。方法:构建含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体pAd-CTLA4Ig,按照不同的感染倍率(MOI)转染大鼠MSC,用荧光显微镜和流式细胞仪分析转染效率,流式细胞术、Westernblotting等方法检测目的蛋白CTLA4Ig在MSC中的表达。将转基因MSC加入混合淋巴细胞反应(MLR)体系,观察其抑制淋巴细胞增殖的生物学效应。结果:重组腺病毒载体pAd-CTLA4Ig对MSC的最大转染率为80.7%±4.7%,转基因MSC可检测到目的蛋白的表达。基因修饰的MSC能有效抑制MLR体系中淋巴细胞的增殖,4d达到最大抑制效率51.46％;再次MLR证实这种抑制作用是供者特异性的。结论:MSC是一种较理想的基因转移靶细胞,其表达的转基因产物CTLA4Ig可在体外特异性地抑制免疫应答。     

人EPO基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的:制备表达人促红细胞生成素基因(hEPO)的重组腺病毒。方法:将hEPO基因亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带hEPO基因的重组腺病毒载体。获得的重组腺病毒载体线性化后转染HEK293细胞,包装、扩增出重组腺病毒,氯化铯梯度离心法进行纯化,PCR和电镜负染鉴定重组腺病毒,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达并检测重组腺病毒的滴度。继而用纯化的重组腺病毒感染HeLa细胞,测定转染效率,以Western blot检测hEPO蛋白的表达。结果:成功构建了携带hEPO基因的重组腺病毒载体pAd-hEPO,PCR、透射电镜和绿色荧光鉴定证实病毒包装成功,并且具有感染力,病毒的滴度可达1.8×1010pfu/mL。Western blot检测表明RAd-hEPO感染的HeLa细胞中hEPO基因能够有效表达。结论:制备的RAd-hEPO可成功表达hEPO基因,为后续开展RAd-hEPO治疗缺血性心脏病的研究奠定基础。     

mOX40-Fc的真核表达及其对混合淋巴细胞反应的影响

构建重组pcDNA3.1-mOX40-Fc真核表达载体,在CHO细胞中表达,并初步研究融合蛋白mOX40-Fc对MLR中细胞增殖的影响。克隆编码hIgG1Fc基因片段,与编码小鼠OX40胞外段的基因融合,构建mOX40-Fc融合基因及其分泌型真核表达载体pcDNA3.1-mOX40-Fc;转染CHO细胞构建融合蛋白的稳定真核表达细胞株,用RT-PCR及夹心ELISA检测其表达,纯化后经SDS-PAGE及Western blot法对其进行鉴定,混合淋巴细胞反应(MLR)测定其生物学活性。结果:核苷酸序列测定显示构建的mOX40胞外段和hIgG1Fc段基因序列与GenBank序列一致、阅读框完整;RT-PCR、ELISA和Western blot检测表明转染细胞有分泌型重组蛋白的表达;功能实验提示mOX40-Fc能抑制MLR中的细胞增殖。成功构建mOX40-Fc真核表达载体并获得高效表达,该重组蛋白可在体外通过抑制OX40/OX40L共刺激通路抑制淋巴细胞增殖。     

人KLK1和EGFP双顺反子重组腺病毒构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的：构建携EGFP为报告基因和人组织激肽释放酶1(hKLK1)基因双顺反子的重组腺病毒（Ad-hKLK1-IRES-EGFP）,并观察在自发性高血压大鼠（SHR）血管平滑肌细胞（VSMCs）中的表达变化。方法:通过双酶切质粒pBluescritII KS-hKLK1，将hKLK1基因定向克隆至带有IRES-EGFP的腺病毒穿梭质粒pDC316中，构建成重组穿梭质粒 ，将其与腺病毒骨架质粒BHGloxE1，3Cre共转染293A细胞，经包装并获得重组腺病毒，用PCR、酶切及测序方法对其进行鉴定，测定病毒滴度；用重组腺病毒感染VSMCs，用荧光显微镜下观察到的绿色荧光来测定感染率，用RT－PCR和Western blotting法测定hKLK1基因在VSMCs中的表达。结果:PCR、酶切和测序表明携EGFP的重组穿梭质粒pDC316-hKLK1-IRES-EGFP构建正确，并与骨架质粒在293A细胞中成功包装出重组腺病毒Ad-hKLK1-IRES-EGFP，其滴度为4.5×10¹¹/L。重组腺病毒感染VSMCs后，在荧光显微镜下观察到明亮绿色荧光蛋白表达，感染率高达90％以上，可检测到hKLK1基因的mRNA及蛋白表达，并与感染时间(1 d-7 d) 有显著依赖关系，峰值感染复数为100 MOI。结论:成功构建并包装了携EGFP和hKLK1基因的双顺反子重组腺病毒载体系统Ad-hKLK1-IRES-EGFP；感染VSMCs可检测到基因hKLK1和EGFP的独立共同高表达，该系统为一直观、安全、高效的基因转移系统。     

重组人sCD40L-IZ基因的克隆、原核表达及重组三聚体蛋白的鉴定

目的:克隆并表达有生物学活性的CD40配体(CD40ligand,CD40L)重组蛋白。方法:应用PCR技术克隆CD40L胞外功能区(E107-L261)基因,并在其N端融合异亮氨酸拉链(isoleucinezipper,IZ)促使其形成三聚体活性形式,同时为了后期纯化的需要,在IZ的N端融合6个His,将所融合得到的sCD40L-IZ克隆进入pET30a表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)表达体系进行诱导表达。结果:重组蛋白sCD40L-IZ以包涵体形式在大肠杆菌(BL21)中得到较高水平的表达。通过蛋白的变性、复性和HiTrapTM亲和层析获得了纯度达95%以上的sCD40L-IZ重组蛋白。经凝胶过滤层析和非还原SDS-PAGE分析验证了其确有三聚体形式。激光共聚焦实验结果表明,重组蛋白sCD40L-IZ可与骨髓瘤细胞株XG2表面CD40分子结合,并促使其在膜表面发生聚集。结论:人sCD40L-IZ重组蛋白在大肠杆菌体系得以成功表达,并以三聚体活性形式发挥功能,为今后进一步研究其与凋亡、疾病发病机制的关系及其在临床治疗中的应用奠定了基础。     

腺病毒介导重组人单链IL-27融合基因在肝癌细胞的表达及活性鉴定

目的:利用腺病毒表达系统在肝癌细胞表达有生物活性的单链重组人白细胞介素-27(rhscIL-27)并检测其生物学活性。方法:将rhscIL-27基因片段从pcDNA3.1载体克隆到腺病毒载体pAdTrack-CMV,然后在细菌内与pAdEasy同源重组构建AdIL-27腺病毒载体并转染293细胞包装、扩增腺病毒颗粒。将重组腺病毒感染肝癌细胞株HepG2,荧光显微镜、RT-PCR及ELISA等方法进行检测蛋白表达情况,IFN-γ诱生实验检测rhscIL-27的生物学活性。结果:成功构建AdIL-27腺病毒载体,经293细胞包装扩增后感染HepG2细胞观察到有GFP表达,RT-PCR及ELISA检测到细胞有rhscIL-27表达,IFN-γ诱生实验证实表达的rhscIL-27具有诱导产生IFN-γ的生物学活性。结论:利用腺病毒表达系统成功在肝癌细胞表达有生物活性的重组人单链IL-27(rhscIL-27),并具有诱导产生IFN-γ的生物学活性,为研究IL-27的生物学功能及其对肝癌的基因治疗奠定了基础。     

人OX40转基因细胞株的建立及其对树突状细胞的促分化作用

应用RT PCR方法 ,从PHA活化的扁桃体T细胞的mRNA中 ,扩增获得编码人OX4 0分子的cDNA ,并将其克隆到pMD18 T载体 ,经PCR、酶切和测序鉴定确证。进而构建pcDNA3 1 OX4 0重组真核表达载体 ,脂质体法转染L92 9细胞 ,经G4 18筛选 ,获得能稳定高表达OX4 0分子的细胞株。经OX4 0 FITC单抗标记和FCM检测 ,阳性表达率为 89 1%。转基因细胞在可溶性CD4 0L共存条件下 ,与未成熟DC共育 ,能促进DC的进一步分化成熟 ,使DC膜分子CD4 0、CD86和CD83呈上调性表达。     

肝癌靶向性SEA-CD80基因共表达重组腺病毒载体的构建及表达鉴定

目的:构建肝癌靶向性葡萄球菌肠毒素A(SEA)和CD80基因共表达重组腺病毒载体。方法:首先利用现有的腺病毒穿梭质粒pShuttle和pShuttleCMV,构建新的不带CMV增强子/启动子而带有polyA加尾信号穿梭质粒,命名为pShuttle2。将AFP增强子、启动子、SEA及CD80基因分别从已构建的pKSEP载体和pMD18TBIS载体上,分别亚克隆至pShuttle2中,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy1共转化E.coliBJ5183。以获得的重组子转染HEK293细胞后制备重组腺病毒,然后感染高表达AFP的肝癌细胞系Hepa16和不表达AFP的黑色素瘤细胞系B16、成纤维细胞系NIH3T3。采用间接免疫荧光法,激光共聚焦显微镜观察和流式细胞术检测SEA和CD80在细胞膜表面的表达。采用3H掺入法检测膜表达的SEA诱导淋巴细胞增殖的活性。结果:以制备的重组腺病毒感染肿瘤细胞后,SEA和CD80能够靶向性地共表达在高表达AFP的Hepa16细胞膜上,而在不表达AFP的B16、NIH3T3细胞膜上不表达。结论:成功地构建肝癌靶向性SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体,为进一步研究SEA和CD80在肝癌靶向基因治疗中的联合应用及其抗肿瘤免疫机制奠定了基础。     

人微小RNA-133a(miR-133a)重组腺病毒的构建和鉴定

目的: 构建人miR-133a重组腺病毒,研究其在人骨髓间充质干细胞(hMSCs)中的表达。方法: 从人基因组DNA中扩增包含miR-133a的PCR产物，并定向插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV。将经pmeⅠ线性化的重组穿梭载体与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化感受态大肠杆菌BJ5183，通过同源重组获得重组腺病毒质粒rAd-mir-133a。将rAd-mir-133a在人胚肾293细胞（HEK293）中包装并扩增出miR-133a的重组腺病毒。将重组腺病毒感染hMSCs，利用RT-PCR和实时定量PCR分别检测初级miR-133a和成熟miR-133a的表达。结果: 限制性内切酶分析和DNA测序结果显示，重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-miR-133a构建正确。在HEK293细胞中成功包装并扩增出重组腺病毒rAd-miR-133a。rAd-miR-133a感染的hMSCs中初级miR-133a转录子和成熟miR-133a表达显著增强。结论: 成功构建了人miR-133a 重组腺病毒，并在hMSCs中高效表达出miR-133a，为进行miR-133a的功能研究创造条件。     

重组hFGF-10腺病毒促进角质形成细胞增殖

目的： 构建重组人成纤维细胞生长因子10（hFGF-10）腺病毒，并观察其对角质形成细胞增殖的影响，为探索新的皮肤组织工程种子细胞的来源奠定基础。方法: 用PCR方法扩增得到人成纤维细胞生长因子10（hFGF-10）基因片段，与穿梭载体pAdTrack-CMV连接，获得的重组质粒pAdTrack-CMV-hFGF-10经Pme I线性化后，通过电转法导入含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，获得重组腺病毒质粒pAdEasy-hFGF-10，经酶切鉴定后转染HEK-293细胞，在HEK-293细胞中包装并扩增腺病毒。用重组腺病毒感染HaCat细胞，Western blotting检测培养上清中的重组hFGF-10。MTT法检测重组腺病毒对角质形成细胞增殖的影响。结果: 成功构建了含hFGF-10基因的重组腺病毒，可高效感染HaCat细胞，培养上清与hFGF-10抗体呈阳性反应。重组腺病毒对角质形成细胞的增殖具有促进作用。结论: 制备出的重组腺病毒感染HaCat细胞后分泌表达hFGF-10，并可促进HaCat细胞的增殖。     

人端粒酶催化亚基反义RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定*

背景：人端粒酶催化亚基与c-myc在喉鳞状细胞癌中有密切的相关性。 目的：构建含有c-myc启动子的人端粒酶催化亚基的重组腺病毒载体,观察人端粒酶催化亚基在细胞中表达后对细胞增长的影响。 方法：按照人工合成中反向转录的方法设计基因合成引物,用复式PCR获得目的片段ashTERT(322 bp)。将片段ashTERT克隆到pUC57(2.7 kb)克隆载体,然后热激转化到E.coli感受态细胞中,菌检、PCR、鉴定阳性克隆后,菌液放大培养,提取质粒pUC57-ashTERT,然后对质粒进行测序。将目的基因片段亚克隆到穿梭载体pshuttle-CMVneo上,然后构建重组腺病毒质粒pAd-ashTERT。转入293细胞中进行病毒包装、鉴定和滴度测定。 结果与结论：提取质粒pUC57-ashTERT,测序符合序列要求。质粒pUC57-ashTERT转入293细胞后,成功构建了有较强感染能力的含人端粒酶催化亚基基因的重组腺病毒载体。     

稳定表达膜结合型 CD40L 配体 CHO 细胞系的建立和鉴定

 目的 建立稳定表达膜结合型 CD40 配体（CD40L）的 CHO 细胞系。 方法 将编码膜结合型 CD40L 的重组质粒 pcDNA3.1- fCD40L 用 BgI Ⅱ 和 XhoⅠ 酶进行双酶切鉴定。电穿孔法向 CHO 细胞转染该重组质粒，G418 筛选抗性克隆，有限稀释法获取单克隆阳性细胞后扩大培养，获得 2 个整合了 fCD40L 基因的 CHO 细胞（CHO-fCD40L）克隆。用 RT-PCR、流式细胞仪分别从 RNA 和蛋白质水平对 2 个CHO-fCD40L 克隆细胞中膜结合型 CD40L 的表达进行检测；ELISA 法检测 2 个 CHO-fCD40L 克隆细胞培养上清液中可溶性 CD40L（sCD40L）的含量。 结果 重组质粒 pcDNA3.1-fCD40L 经双酶切和电泳检测到符合预期大小的基因片段。该重组质粒转染 CHO 细胞后经克隆化培养获得 2 个 CHO-fCD40L 克隆，分别命名为 C10、E11。RT-PCR 检测显示 C10、E11 细胞中有膜结合型 CD40L mRNA 的转录；流式细胞仪检测显示 C10、E11 细胞表达 CD40L 蛋白达 90% 以上；ELISA 法检测到显示 C10、E11 细胞培养液上清中有 sCD40L 蛋白表达。 结论 成功获得稳定表达膜结合型 CD40L 的 CHO 细胞系，为比较膜结合型 CD40L 与 sCD40L 的生物学功能奠定了良好基础。