超声预处理辅助酶解玉米胚芽ACE抑制肽的研究

旨在研究不同工作模式的超声预处理对玉米胚芽蛋白酶解制备血管紧张素转换酶(Angiotensin-I Converting Enzyme,ACE)抑制肽的影响。以蛋白转化率和高活性肽占比为指标,利用聚能逆流双频、发散三频和对振双频的超声设备,对玉米胚芽粕进行预处理,得到最优的超声预处理模式;采用单因素逐级优化法来确定最佳超声预处理参数;在最优超声处理条件下,优化酶解反应条件。结果表明分子量在300~1000 Da的多肽ACE抑制活性最高,IC₅₀值为0.78 mg/mL;最优的超声模式为20/40 kHz交替双频,最佳超声预处理参数为功率密度100 W/L、底物浓度为8%、超声时间20 min、超声温度30 ℃,酶解条件为加酶量2000 U/g蛋白、酶解时间2.5 h。在最优条件下,蛋白转化率为85.00%,相比于未超声组的73.01%提高了16.42%;高活性肽占比为29.63%,相比于未超声组的26.00%提高了13.96%。因此,逆流双频超声波辅助酶解法能有效提高蛋白转化率和产物ACE抑制活性,有利于ACE抑制肽的制备。     

超声预处理影响金枪鱼皮胶原酶解工艺及机理初探

以金枪鱼皮为原料,研究超声时间、超声功率、超声料液比等因素对酶解效果的影响;并从鱼皮胶原结构和酶解液分子量分布的角度分析了超声预处理提高酶解效率的原因。结果表明,超声预处理时间为20 min、功率为30%(195 W)、料液比为1∶15(g∶mL)时,水解度(DH)可达14.89%,羟脯氨酸(Hyp)含量为0.046 g,比未处理组DH(4.90%)、Hyp含量(0.015 g)均有明显提高。傅里叶红外光谱(FTIR)结果表明超声通过断裂金枪鱼皮胶原蛋白氢键,松散三螺旋结构,利于蛋白酶与胶原三螺旋区内部酶切位点的接触从而提高酶解效率。酶解液分子量分布对比显示未处理组10 kDa以下小分子量占45.62%,超声预处理后为88.67%,提高了94.36%。因此超声预处理促进了胶原三螺旋区的活性肽段的释放,为金枪鱼皮胶原小分子活性肽的高效开发奠定基础。     

逆流超声辅助酶解法制备大米ACE抑制肽

研究逆流超声预处理大米蛋白对其碱性蛋白酶酶解制备血管紧张素转换酶(Angiotensin-I Converting Enzyme,ACE)抑制肽的影响。首先从米渣中提取大米蛋白,以ACE抑制率为主要指标,水解度为辅助指标,运用单因素逐级优化法对酶解反应的底物浓度、时间、温度、加酶量和pH进行参数优化,在此基础上筛选逆流超声模式的最佳超声参数。结果表明最佳酶解参数为底物浓度30 g/L、加酶量(E/S)7.5%、温度50 ℃、pH8.5和酶解时间60 min,此时酶解产物ACE抑制率为45.59%,水解度为21.49%。最佳超声参数为超声频率20 kHz、功率密度170 W/L、时间12.5 min。此时酶解液ACE抑制率达72.24%,水解度为21.64%,相较于未超声组ACE抑制率提高了57.42%,相较于传统超声组,ACE抑制率提高了11.36%。结果表明逆流超声波辅助酶解法能有效提高酶解效率、减少能耗、促进ACE抑制肽制备。     

球磨辅助酶解制备南瓜籽ACE抑制肽

以南瓜籽蛋白为原料,通过球磨预处理辅助酶解法制备血管紧张素转换酶（ACE）抑制肽。以ACE抑制率和水解度为评价指标,对蛋白酶进行筛选。采用单因素试验研究球磨时间、酶解时间、底物质量浓度、pH和酶解温度对酶解产物ACE抑制率和水解度的影响,在此基础上,以ACE抑制率为考察指标,采用响应面法对球磨辅助酶解工艺条件进行优化。结果表明：球磨预处理可显著提高南瓜籽蛋白的酶解效率;最佳球磨辅助酶解工艺条件为选用碱性蛋白酶、球磨时间6 min、酶解时间10 h、底物质量浓度0.08 g/mL、pH 8.5、酶解温度55 ℃,在此条件下所得ACE抑制肽的ACE抑制率可达(86.65±0.55)%。     

超声预处理对金枪鱼皮胶原ACE抑制肽消化稳定性的影响及消化产物的分离纯化、鉴定

以金枪鱼皮为原料,超声预处理后酶解制得高血管紧张素转化酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)抑制肽,研究ACE抑制肽的模拟胃肠道消化稳定性,并对消化产物进行分离纯化和鉴定。结果表明,超声处理后不同酶解时间酶解液的ACE抑制活性均有所提高;超声预处理20、40 min后,酶解5 min酶解液的消化产物的ACE抑制活性显著高于其他组(p<0.05)。采用葡聚糖凝胶G-15对E5U20和E5U40进行分离纯化,两组酶解液均可分离为3个组分,其中E5U20组组分2的IC₅₀值最小为0.393 mg/mL。采用半制备高效液相色谱对E5U20组分2进行分离纯化,得到8个组分,其中峰3的IC₅₀值最小为0.102 mg/mL。通过质谱法对峰3进行鉴定,测得峰3序列为GPSGPPGP,来源于α1肽链第842~849的位置,符合高ACE抑制活性的多肽构效特点,目前尚无该氨基酸序列的报道。     

预处理对酶解过程中胶原ACE抑制肽释放的影响

本文探究了酸、碱、热、超声、超高压五种预处理方式对胶原蛋白制备ACE抑制肽的影响。胶原蛋白经预处理后采用碱性蛋白酶酶解制备水解液,对水解液的水解度、ACE抑制率和分子量分布情况进行测定,结果显示碱和超声处理组水解液的水解度、ACE抑制率均高于未处理组,表明这两种预处理方式可能利于胶原三螺旋区位点的暴露;DSC和红外分析预处理后的胶原蛋白结构显示,碱处理改变了胶原蛋白构象特点,影响非共价键的平衡,胶原三螺旋区域的位点被充分暴露,但保持了亚基的完整性,超声处理破坏了胶原螺旋区的共价交联,暴露出更多疏水性位点,利于碱性蛋白酶酶解;而酸、热和超高压处理主要影响胶原非螺旋区,无法在酶解过程中促进胶原ACE抑制活性肽段的释放。     

贻贝中ACE抑制活性肽的酶解制备及表征

以贻贝为原料,制备具有血管紧张素Ⅰ转换酶(ACE)抑制作用的活性肽.采用水解度DH、蛋白质回收率及ACE抑制活性为指标,筛选水解贻贝粗蛋白的最适酶种;通过响应面分析(RSM)对水解贻贝粗蛋白的工艺条件进行优化;探讨水解度(DH)与ACE抑制活性的关系;利用HPLC方法分析活性肤的相对分子质量分布.试验结果表明碱性蛋白酶Alcalase 2.4 L是水解贻贝粗蛋白的最适酶种;碱性蛋白酶在[E]/[S]1.64、pH 9.12、温度57 ℃水解条件下,酶解物的ACE抑制作用最强,其DH26.41%,IC50 34.64g/mL.就贻贝粗蛋白的水解而言,控制水解度为25%～30%为宜.碱性蛋白酶水解贻贝粗蛋白所得活性肤,主要是以相对分子质量较小的短肽组成,其中,相对分子质量在1 000 Da以内的占90.42%.本研究结果表明以贻贝为原料,可以开发具有显著ACE抑制活性的降血压肤.     

酶解脱脂蚕蛹蛋白制备ACE抑制肽

以实验室自制的脱脂蚕蛹蛋白为原料,利用酶工程技术,通过对中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶等的筛选及单因素和响应面优化试验,对ACE抑制肽的制备工艺条件进行较系统的研究。结果表明：选择碱性蛋白酶作为脱脂蚕蛹蛋白制备ACE抑制肽的酶,制备ACE抑制肽的最佳工艺条件为料液比11.88:100、温度50.22℃、pH 9.46、加酶量7.03%、酶解4h。在此条件下制备的ACE抑制肽的ACE抑制率达到41.98%。     

酶解猪血浆蛋白粉制备ACE抑制肽的工艺优化

选用胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶水解猪血浆蛋白粉,通过单因素和正交试验考察其水解产物对ACE的抑制活性,并优选酶解工艺条件。结果显示:胃蛋白酶适宜水解血浆蛋白粉,制备ACE抑制肽;影响胃蛋白酶水解的4个因素主次顺序为底物质量浓度>酶解时间>pH值>酶与底物质量比(m酶:m底物),其中底物质量浓度和酶解时间的影响显著(P<0.05),pH值和m酶:m底物的影响不显著(P>0.05);适宜胃蛋白酶水解的条件为pH2.3、水解时间1.5h、底物质量浓度1g/100mL、m酶:m底物1:6。     

超声波预处理酶解制备茶渣蛋白ACE抑制肽及其活性分析

血管紧张素转换酶（Angiotensin-I Converting Enzyme,ACE）在血压调节中扮演重要角色,抑制其活性有利于维持血压平衡。食源性ACE抑制肽具有安全、易吸收的特点,受到广泛关注。本研究旨在从茶渣蛋白中获得一种具有高ACE抑制活性的新肽。以ACE抑制率为指标,通过对三种超声方式的比较,确定最佳超声方式;以单因素实验为基础,进行响应面优化确定最佳超声波预处理参数;酶解液分离纯化运用超滤的方法,并对截留分子量小于3 kDa组分进行稳定性分析。结果表明,超声波预处理为最佳处理方式,得最优条件为超声功率300 W、超声温度45 ℃、超声时间25 min。在最佳超声波预处理条件下,ACE抑制率为64.8%,相比于未超声组54.1%提高了10.7%;当截留分子量小于3 kDa时,ACE抑制肽的抑制率为82.3%,相比于原始酶解液提高了17.5%。当温度30 ℃升温至90 ℃,ACE抑制肽的抑制率从82.3%降低至78.3%,减少了4.3%;酸碱度、盐溶液变化其对ACE抑制率表现稳定;模拟消化环境中8 h后,ACE抑制率从82.3%降为62.3%。     

具ACE抑制活性的大豆肽的制备及精制研究

采用酶解技术制备具ACE抑制活性的大豆肽混合物。选择了最佳水解用酶,优化了反应条件。确定碱性蛋白酶解最佳条件为:pH9.0,温度50℃,底物浓度6%,酶用量([E]/[S])3%,作用时间4h。选择D3520型大孔树脂对水解产物进行脱盐精制,脱盐率91.2%,肽回收率89.3%,ACE抑制活性提高了28.5%,大豆分离蛋白ACE抑制肽混合物分子质量主要分布为200-720,在pH3-10,溶解性达98.1%以上,且稳定性好。     

酶解条浒苔蛋白制备ACE 抑制肽

为了开发利用绿潮藻类条浒苔中含量丰富的蛋白质,采用可见分光光度法测定酶解物对ACE的抑制作用,考察碱性蛋白酶、Alcalase和胰蛋白酶对条浒苔蛋白的水解作用及其水解产物的ACE抑制活性,筛选出Alcalase作为酶解条浒苔蛋白制备具有降血压活性酶解物的适宜水解酶。在单因素试验的基础上,采用响应面分析法对该酶的酶解条件进行优化。结果表明,最佳酶解条件为：料液比1:50、加酶量2982U/g pro、温度47.9℃、pH7.53、酶解时间90min,在该条件下,酶解物的ACE抑制率IC50值为0.66mg/mL。不同截留分子质量的组分中,分子质量范围在1～5kD,平均肽链长度为16的组分ACE抑制活性最强,模拟体外消化实验结果表明,分子质量小于10kD的组分具有一定的对消化酶的抗性。     

酶法制备联合Plastein反应修饰牡蛎ACE抑制肽工艺优化

以牡蛎为原料,采用酶解联合Plastein反应修饰的方法,获得高活性血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制肽。以ACE抑制率和水解度为指标,对比胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶这5种蛋白酶对牡蛎肉的酶解效果,筛选出木瓜蛋白酶最佳。通过单因素试验和正交试验对酶解工艺进行优化,得到最佳酶解工艺为料液比1∶8(g/m L)、加酶量2.0%、温度65℃、时间1.0 h、pH6.0,此条件下酶解产物的ACE抑制率可达到63.30%,在此基础上采用Plastein反应对酶解产物进行修饰,以游离氨基酸减少量和ACE抑制率为指标,考察反应过程中酶种类、底物质量分数、加酶量、时间和温度对修饰结果产生的影响。通过该反应的修饰,得到选用中性蛋白酶、底物质量分数40%、加酶量1.0%、温度30℃、时间2.5h、pH7.0时,ACE抑制率最高可达82.31%,比修饰前提高了19%。     

猪皮胶原ACE抑制肽的纯化与鉴定

采用超声协同稀碱对猪皮实施预处理后,酶解30 min制得的高血管紧张素转化酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)抑制活性水解液为原料,采用Sephadex G-15、半制备高效液相色谱分离纯化其中胶原ACE抑制肽并对其序列进行鉴定。结果表明,Sephadex G-15分离胶原ACE抑制肽的最佳分离条件为:样品浓度100 mg/m L;上样量2 m L;流速2 m L/min;洗脱剂为蒸馏水;层析柱为1 m×10 mm的层析柱。在该分离条件下,混合肽被分成AP-I、AP-II两个组分,IC50值分别为19.50、1.01 mg/m L。对抑制活性较强的AP-II进一步采用半制备高效液相色谱进行分离,得到8个组分峰,其中峰2、峰5和峰6的IC50值最小,分别为0.73、0.44和0.4 mg/m L。结合IC50值的大小及半制备收集到样品的量,对峰2和峰6采用LC-MS/MS进行序列分析。结果显示峰2的多肽序列为QGPPGPAGPR(P为Hyp),峰6的序列为AGPPGPPGPA,这两个序列位于胶原蛋白α1链中526?535、730?739位。     

预处理对胶原蛋白水解和血管紧张素转化酶抑制肽段释放的影响

以胰蛋白酶为工具酶,研究短时热处理、超高压处理对胶原蛋白水解和血管紧张素转化酶（angiotensinconverting enzyme,ACE）抑制肽段释放的影响。结果表明：热处理可显著促进胰蛋白酶对胶原蛋白的水解和ACE抑制活性肽段释放,超高压处理组水解物水解度（degree of hydrolysis,DH）与无处理组无显著差异,ACE抑制活性显著低于无处理组。水解物DH和ACE抑制活性关系研究显示,胰蛋白酶水解胶原蛋白过程中,水解度小于5%时,ACE抑制率随水解度呈明显上升趋势,水解度大于5%后,其上升趋势不再明显。肽谱分析进一步证明热处理可有效促进胶原蛋白的水解,超高压处理可改变胰蛋白酶作用位点。热处理组水解物序列分析显示,获得序列均来源于胶原蛋白三螺旋区域,且大部分序列都具有潜在的ACE抑制活性。说明短时热处理可以有效破坏胶原蛋白的三螺旋结构,促进ACE抑制肽段的释放。     

深海鲑鱼皮来源ACE抑制肽的分离及鉴定

为了考察海洋胶原低聚肽中ACE抑制肽的活性和结构,本文以深海鲑鱼皮为原料,采用两步酶解法制备出海洋胶原低聚肽,在对其分子量分布进行分析的基础上,测定了其血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性。结果表明,海洋胶原低聚肽中分子量小于1000 u的组分高达90.79%,主要分布在132~576 u范围内,其ACE抑制活性的IC50为1.18±0.12 mg/m L。然后利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对海洋胶原低聚肽进行分离纯化,收集11个组分峰,对其ACE抑制活性进行了测定。结果表明,有7个组分的ACE抑制活性比海洋胶原低聚肽高。最后利用Q-TOF质谱仪对收集的11个组分进行了结构鉴定,并对鉴定出的15个肽段进行了ACE抑制活性测定。结果表明,15个肽段均有一定的ACE抑制活性,其中Ala-Pro(AP)、Val-Arg(VR)、Gly-Arg(GR)的ACE抑制率比海洋胶原低聚肽高,IC50值分别为0.07±0.01 mg/m L、0.35±0.03 mg/m L、0.92±0.85 mg/m L,活性大约是海洋胶原低聚肽的16.86、3.37、1.28倍,是具有较高ACE抑制活性的肽段。     

响应面法优化猪血红蛋白制备ACE抑制肽的酶解工艺条件

以猪血红蛋白为原料,采用胃蛋白酶水解猪血红蛋白制备ACE抑制肽。以体外ACE抑制率和水解度为指标,通过单因素试验对酶解温度、酶解pH值、底物质量浓度、加酶量、酶解时间等酶解工艺参数进行研究,并用响应面法优化酶解工艺,建立二次多项数学模型。结果表明,胃蛋白酶水解猪血红蛋白制备ACE抑制肽的最佳工艺参数为酶解温度37.60℃、酶解pH 1.98、底物质量浓度4.98g/100mL、加酶量3.04%、酶解时间4h,酶解产物的最大ACE抑制率为70.09%。     

贻贝盐溶蛋白特性分析及其ACE抑制肽的酶法制备

以贻贝为原料提取盐溶性蛋白,首先研究盐溶性蛋白的分子质量分布、粒度分布和变性温度等性质,然后比较其3?种蛋白酶（胰蛋白酶、中性蛋白酶和胰酶）酶解产物的血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme,ACE）抑制活性,筛选出ACE抑制活性较高的胰蛋白酶酶解物,其IC50值为215.96?μg/mL。利用质谱对胰蛋白酶酶解物中的多肽氨基酸序列进行鉴定,利用多肽序列与ACE的对接分数初步筛选出11?个分值大于180?分的多肽序列,通过氨基酸组成结合情况和两者间氢键等相互作用,进一步筛选活性肽并阐述抑制活性机理,最终推测出LYDIDVAK和WIAEEADK是活性较高的抑制肽。