速冻面米制品中金黄色葡萄球菌和肠毒素A基因三重PMA-qPCR快检方法的建立

为建立准确定量速冻面米制品中金黄色葡萄球菌活菌,筛查肠毒素sea基因并指示PCR反应假阴性的三重PMA-qPCR检测方法。针对金黄色葡萄球菌特异靶基因RpiR和肠毒素基因sea序列保守区,设计引物、探针和构建扩增内标,优化建立三重qPCR检测体系,建立PMA食品前处理方法去除死菌DNA,构建纯培养物和速冻面米制品中污染金黄色葡萄球菌的定量标准曲线,应用三重PMA-qPCR方法检测人工污染金黄色葡萄球菌的速冻面米制品。采用GB4789.10-2016中规定的选择平板计数法,评价三重PMA-qPCR方法的检测性能。结果表明,三重PMA-qPCR检测体系扩增效率高,特异性好。当食品中金黄色葡萄球菌污染量大于10~3CFU/g时,靶基因RpiR可获得有效扩增,污染量在10~3～10~7CFU/g之间时,扩增曲线线性良好(R~2=0.994),PMA-qPCR定量结果与平板计数结果一致性较好。当sea阳性菌株污染量大于10~3CFU/g时,应用PMA-qPCR方法可有效评估食品污染肠毒素A的风险。综上所述,本研究建立的三重PMA-qPCR检测方法操作简便,可快速定量检测速冻面米制品中金黄色葡萄球菌,评估食品污染肠毒素A的风险。     

橙汁中两株条件致病酵母的形态及分子鉴定

目的：为建立更加完善的橙汁酵母菌检测体系,进一步精确监控市售橙汁质量,对市售橙汁中分离的两株酵母菌Y25、Y32进行菌落动态发育和细胞特征的观察。方法：以NL1和NL4为引物,对分离到的两株酵母菌基因组进行26S rDNA D1/D2区域序列扩增。结果：酵母菌的菌落形态随培养时间延长发生变化,菌落发育形态和菌体细胞特征对菌株鉴定具有直观、简洁的优点;PCR扩增后的基因碱基序列经GeneBank公布的同源基因碱基序列比对后,相似度在99%以上。结论：把分离到的Y25、Y32鉴定为汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)和近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)。形态学与分子技术的结合使鉴定结果更为准确可靠,将为橙汁中其他腐败微生物的鉴定与监控提供有价值的借鉴。     

EMA RT-PCR法检测鸡肉中鼠伤寒沙门氏菌活菌

目的:叠氮溴乙锭(Ethidium monoazide bromide,EMA)具有特异性抑制死菌DNAPCR扩增而对活菌细胞无影响的特点,将其应用于鸡肉中鼠伤寒沙门氏菌活菌检测。方法:待测样品中加入EMA至终质量浓度为50μg/m L,卤素灯曝光处理10 min,提取DNA进行RT-PCR反应,根据Ct值和标准曲线计算样品中活菌的数量。结果:相同细胞浓度条件下,活菌经EMA处理后其Ct值与未经EMA处理组的Ct值无显著性差异(P0.05),且细胞浓度与Ct值均呈显著负相关性,相关系数分别是0.9916和0.9832;死菌经EMA处理后其Ct值与活菌经EMA处理后的Ct值有显著性差异(P﹤0.05),而与阴性对照组无显著性差异(P0.05);死/活鼠伤寒沙门氏菌混合菌液污染鸡肉样品检测结果显示,与直接RT-PCR方法相比,EMART-PCR方法的检测结果更接近于平板计数结果。结论:EMA与RT-PCR相结合的方法可以快速、准确地检测鸡肉中鼠伤寒沙门氏菌活菌的数量,避免假阳性结果,具有实用意义。     

PMA-qPCR定量检测VBNC副溶血弧菌方法的建立与优化

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）在某些不利于生长的自然和食品加工条件下能够进入活的非可培养（viable but non-culturable, VBNC）状态,普通检测方式极易漏检,因此VBNC细菌检测技术的开发与优化对副溶血弧菌感染防控具有重要意义。基于叠氮溴化丙锭结合荧光定量PCR技术（propidium monoazide quantitative PCR,PMA-qPCR）能够利用活细胞的膜完整性区分活菌和死菌的原理,以副溶血弧菌ATCC 17802为对象,通过探讨PMA-qPCR方法中各项因素对活菌计数结果的影响,优化并建立了VBNC副溶血弧菌的定量检测方法。实验结果表明,当添加PMA质量浓度为15 mg/L,黑暗孵育10 min,再进行强光照射15 min后,死细胞的DNA扩增得到有效抑制,此时提取DNA模板进行qPCR扩增准确性更高,活菌数与qPCR扩增循环数呈现显著性线性相关（R²=0.99）。PMA-qPCR法测定副溶血弧菌活菌数的标准曲线显示该方法检测范围为2.90×10¹～2.90×10     

TaqMan-MGB探针荧光定量聚合酶链式反应法检测酸奶制品中动物双歧杆菌BB-12

摘 要：【目的】本研究拟建立一种快速、高灵敏性检测和定量酸奶中动物双歧杆菌BB-12的方法。【方法】设计动物双歧杆菌BB-12的16SrRNA序列的MGB探针,利用荧光定量PCR技术,构建目标序列的过表达载体,提取质粒进行标准曲线的制作,最后进行市售酸奶样品检测,定量酸奶中BB-12菌株的数量。【结果】所有载体标准品均产生显著的荧光增幅,Ct值介于16～20之间;而以其他酸奶制品添加菌以及大肠杆菌样品DNA为模板则无荧光扩增信号。在检测灵敏度方面,BB-12载体可被稳定检出的质量浓度低至0.0000584 ng/μL,Ct值平均数为28.73,即检测灵敏度低至为0.05 pg。制作的标准曲线线性良好,扩增效率E为0.39,判定系数R2=0.9999。市售酸奶样品检测特异性好、灵敏度高及定量结果准确。【结论】通过特异性的TaqMan-MGB探针进行荧光定量PCR检测可实现在酸奶中对BB-12菌种的检测及定量。     

PMA-qPCR方法检测陕西猕猴桃溃疡菌优势病原菌活菌的研究

将叠氮溴化丙啶(PMA)与实时荧光定量(qPCR)相结合定量检测陕西猕猴桃溃疡菌优势病原菌(Psa)活菌的数量。通过优化PMA最佳浓度、暗孵育时间、曝光时间,确定PMA-qPCR区别溃疡菌活、死菌的最佳条件。结果表明,Psa经98.3℃沸水浴处理13min可完全致死,Psa死菌浓度为1×107 CFU/mL时PMA与死菌共价交联的最佳浓度为105μg/mL,最佳暗育时间为8min,最佳曝光时间为20min,在此条件下死菌DNA无扩增,而对活菌DNA扩增无影响;Psa质粒标准品建立的线性回归方程为Y=-3.220 4x+37.73,R2=0.995 5,最低可检出6.39×102拷贝/μL的溃疡菌;建立的PMA-qPCR方法最低可检出2.38×102拷贝/μL的溃疡菌;采用人工染菌枝条样品的最低检出限为6.30×104 CFU/mL,与菌落计数检测结果相符。     

橙汁腐败酵母菌的分子鉴定及其形态特征分析

目的：结合多种酵母菌鉴定方法,分析腐败橙汁中酵母菌的种类,为快速检测和控制商品橙汁中酵母菌污染奠定基础,也为酵母菌种类的快速鉴定提供参考。方法：以分离自腐败橙汁的8株酵母菌株为材料,观察菌落和细胞形态。用引物ITS1/ITS4扩增菌株5.8S rDNA 及其ITS间隔区(5.8S-ITS),对扩增产物用HhaⅠ、Hae Ⅲ 和 HinfⅠ进行限制性酶切片段多态性(RFLP)分析和测序;用引物NL1/NL4扩增26S rDNA D1/D2区并测序。结果：菌落特征观察将菌株初分为6组,细胞学观察粗分为3组,分子方法都分成4组。用限制性内切酶HhaⅠ、Hae Ⅲ和HinfⅠ对5.8S-ITS区产物进行 RFLP分析,观察到4种不同的图谱类型。5.8S-ITS 区和26S rDNA D1/D2区的序列分析结果相似,8株分离菌与GenBank中的4种酵母菌参考菌株序列一致性达99%以上。分离株与参考菌株以两区序列构建的NJ系统树都分成4枝：Y1与克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri),Y12-3、Y18-1与发酵毕赤酵母(Pichia fermentans),Y22、Y23、Y26和Y56与Meyerozyma guilliermondii,Y47与Wickerhamomyces anomalus分别聚为一枝。结论：结合形态分析和核酸分析,将8株腐败橙汁分离菌鉴定为P. kluyveri var. kluyveri、P. fermentans、M. guilliermondii和W. anomalus 4个种,其中M. guilliermondii在腐败橙汁中首见报道;ITS- RFLP分析、26S rDNA D1/D2区测序与菌株形态特征结合能有效鉴定酵母菌,核糖体DNA分析可鉴定酵母到生物学种,菌落形态特征可反映种以下的遗传差异,因此,采用分子方法鉴定时不能忽视形态特征分析的重要性。     

实时荧光定量PCR法测定发酵乳中双歧杆菌

对实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术检测发酵乳中双歧杆菌的DNA提取方法、PCR扩增效率、标准曲线绘制进行探讨,通过比较分析碱式提取法、玻璃珠破碎法和酶解法3种提取方法对发酵乳中总DNA提取效率、4种不同参考菌株的PCR扩增效率以及单一菌株标准曲线与混合菌株标准曲线的计数结果,建立实时荧光定量PCR快速测定发酵乳制品中双歧杆菌数量方法。结果表明：酶解法提取发酵乳中总DNA效果最好,OD260/280比值基本接近1.80,且提取的质量浓度含量最高;不同菌株的PCR扩增效率不同,其中参考菌株1.2213的Ct值与其他3菌株的Ct值存在显著性差异;根据单一菌株绘制标准曲线与混合菌株绘制标准曲线计数结果无显著性差异,后者计数结果更客观、准确。采用酶解法获取样品中的菌体细胞,基于混合菌液绘制标准曲线,采用实时荧光定量PCR技术确定发酵乳中双歧杆菌种属数量,可快速、准确地测定发酵乳中双歧杆菌的数量。     

叠氮溴化丙锭-qPCR法定量检测植物乳杆菌

目的：选取植物乳杆菌单拷贝基因plnF为靶基因,设计引物探针,将叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与实时荧光聚合酶链反应(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)相结合,建立了活性植物乳杆菌定量检测PMA-qPCR方法。方法：优化PMA反应条件,进行特异性验证,建立标准曲线,验证灵敏度,并将该方法用于检测人工添加奶粉、米粉、酸奶样品以及冻干样品中的植物乳杆菌。结果：显示经PMA条件优化,最佳PMA浓度为2μg/mL,最佳曝光时间为10min,所建立的PMA-qPCR方法可以快速、高效地检测植物乳杆菌,利用细菌纯培养物与对应Ct值建立标准曲线,可以看出纯培养物浓度与Ct值之间存在对应线性关系,相关系数(r_² )为 0.9992,最低检测限为15拷贝/反应体系,人工添加样品以及冻干样品检测中PMA-qPCR和平皿计数法结果的对数值进行配对t检验,结果显示两者结果在不同的人工添加样本以及冻干样品中均无显著性差异(P＞0.05)。结论：本研究建立的PMA-qPCR检测方法能快速准确、特异、灵敏地定量检测植物乳杆菌。     

PMA-qPCR方法快速检测Lactobacillus paracasei N1115活菌的初步研究

目的:建立快速准确的副干酪乳杆菌N1115(Lactobacillus Paracasei N1115)活菌的荧光定量检测方法并应用于菌粉的活菌计数。方法:根据副干酪乳杆菌N1115的苯丙氨酰-tRNA合成酶α亚基基因(phe S)设计特异性引物;使用叠氮溴化丙锭(Propidium monoazide PMA)抑制死菌DNA扩增,然后通过q PCR的方法检测菌粉中的N1115的活菌数。结果:经验证得到一对N1115特异引物:C15F、C15R;副干酪乳杆菌N1115在90℃水浴条件下热损伤时间为8 min;PMA对于N1115死菌DNA的扩增有明显的抑制效果;PMA-q PCR能够快速准确的测得菌粉中N1115活菌数。结论:建立了一种快速、准确的副干酪乳杆菌N1115活菌的荧光定量检测方法。     

Molecular Identification of Yeasts Associated with Traditional Egyptian Dairy Products

ABSTRACT:  This study aimed to examine the diversity and ecology of yeasts associated with traditional Egyptian dairy products employing molecular techniques in yeast identification. A total of 120 samples of fresh and stored Domiati cheese, kariesh cheese, and "Matared" cream were collected from local markets and examined. Forty yeast isolates were cultured from these samples and identified using the restriction-fragment length polymorphism (RFLPs) of 5.8S-ITS rDNA region and sequencing of the domains D1 and D2 of the 26S rRNA gene. Yeasts were identified as  Issatchenkia orientalis  (13 isolates),  Candida albicans  (4 isolates),  Clavispora lusitaniae  ( Candida lusitaniae ) (9 isolates),  Kodamaea ohmeri  ( Pichia ohmeri ) (1 isolate),  Kluyveromyces marxianus  (6 isolates), and  Candida catenulata  (7 isolates). With the exception of  C. lusitaniae , the D1/D2 26S rRNA gene sequences were 100% identical for the yeast isolates within the same species. Phylogenetic reconstruction of  C. lusitaniae  isolates grouped them into 3 distinguished clusters. Kariesh cheese was found to be the most diverse in its yeast floras and contained the highest total yeast count compared with other examined dairy products. This was linked to the acidic pH and lower salt content of this cheese, which favor the growth and survival of yeasts in foodstuffs. Stored Domiati cheese also contained diverse yeast species involving isolates of the pathogenic yeast  C. albicans . This raises the possibility of dairy products being vehicles of transmission of pathogenic yeasts.     

Enumeration of yeasts in dairy products: a comparison of immunological and genetic techniques

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and PCR techniques have been developed for the detection of spoilage yeast species in dairy products. Polyclonal antibodies against live yeast cells (AY) were raised in rabbits by inoculation of a mixture of 10 yeast species frequently associated with dairy products spoilage. AY antibodies were used for the development of two ELISA formats (indirect and double-antibody sandwich ELISA) for the detection of yeast species in milk and yogurt. A PCR assay was also developed for yeast detection in dairy products, using primers designed to amplify a conserved 250-base pair fragment of the 18S rRNA of the yeast species. The results obtained in this work show that ELISA techniques using polyclonal antibodies against viable yeast cells are of limited value for the detection and enumeration of spoilage yeast species in dairy products. On the contrary, PCR amplification of a conserved region of the 18S rRNA of the yeast species allows the homogeneous detection of all the yeast species tested and, combined with an overnight enrichment of samples, could be used for the detection of low levels of viable spoilage yeast species in dairy products.     

乳制品中活双歧杆菌检测试剂盒的研制及应用

在EMAReal-Time PCR检测方法的基础上,组装检测乳制品中活双歧杆菌的荧光定量PCR试剂盒。建立了EMAReal-Time PCR检测乳制品中活双歧杆菌的标准曲线。组装出检测乳制品中活双歧杆菌的荧光定量PCR试剂盒。该试剂盒批内及批间变异系数(CV)均小于5%;对乳制品中常见乳酸菌无交叉反应;最低检测限为2×104CFU/mL。该试剂盒在-20℃下,至少可保存6个月,4℃可保存3个月。分别采用研究所获得的试剂盒和平板菌落计数法检测12份市售酸乳中的活双歧杆菌的数量,2种检测方法计数结果差异不显著(P>0.05)。该方法所建立的标准曲线相关系数大于98%。所研制的试剂盒重复性较好、特异性较强、灵敏度较高,可以准确地定量检测乳制品中的活双歧杆菌。     

实时荧光PCR定量检测肉制品中猪源性成分

为了准确可靠地对肉制品中猪源性成分进行定量检测,通过生物信息学方法筛选到猪细胞核单拷贝基因(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 2-like,CACA).以CACA基因为扩增靶标,设计了特异性引物、TaqMan探针,建立了基于实时荧光定量PCR...     

山西老陈醋酿造过程中产酯酵母的筛选及产香特性分析

为选育山西老陈醋用微生物发酵剂,从传统发酵工艺的酒醅中分离筛选到3 株产酯酵母菌。结合形态学和酵母菌26S rDNA Dl/D2区序列分析,初步鉴定2 株菌为乙醇假丝酵母,1 株菌为毕赤酵母。将这3 株酵母应用于山西老陈醋生产,采用顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用技术分析醋中的酯类成分,并综合感官评价,结果表明,本研究筛选出的Pichia manshurica Y14与大曲混合发酵,酿制的山西老陈醋中的总酯含量比对照组提高40.5%,乙酸乙酯含量提高1.3 倍。添加Y14的成品醋中酯类物质更为丰富,香味更浓郁,有望将其开发成为山西老陈醋新型发酵剂。     

清香风味导向的酿酒酵母Y2的分离鉴定及生物学特性研究

通过嗅觉和气相色谱分析,分离筛选得到一株高产乙酸乙酯的酵母菌株Y2。该酵母菌株在发酵液中28℃培养7 d,产乙酸乙酯量可达653 mg/L,酒精度达10.5%。通过菌落菌体形态观察、生理生化试验、26S rDNA D1/D2区域序列测序和genbank序列比对,初步确定菌株Y2为酿酒酵母。该菌株对发酵环境的耐受性较强,最高耐受温度39℃,pH 2.0,酒精度14%,糖度18%,是实际生产中理想的产香酿酒酵母。利用该菌株发酵的白酒具有清香、糟香、酯香,带酱感,落口酸爽、醇厚、绵柔,乙酸乙酯香突出,可用作清香白酒调香酒。     

牛奶发酵过程中阪崎克罗诺杆菌可形成活的非可培养状态

该研究以保加利亚乳杆菌为牛奶发酵剂,研究了牛奶发酵过程中阪崎克罗诺杆菌与保加利亚乳杆菌的相互作用以及阪崎克罗诺杆菌存活量的变化情况,并结合16S rDNA高通量测序技术和PMA-qPCR方法分析阪崎克罗诺杆菌在牛奶发酵过程中是否形成“活的非可培养”状态。结果显示,保加利亚乳杆菌在牛奶中发酵48 h后pH值可达到3.40,酸度值可达212.00。在发酵前期接种阪崎克罗诺杆菌,48 h后pH值和酸度值分别为3.50和193.30;在发酵中期接种阪崎克罗诺杆菌,48 h后pH值和酸度值分别为3.47和214.30。发酵前期阪崎克罗诺杆菌的污染对保加利亚乳杆菌发酵结果的影响更大。阪崎克罗诺杆菌在牛奶中生长48 h后菌浓度可稳定在9.08 lg(CFU/mL);不论在牛奶经发酵前期或中期接种阪崎克罗诺杆菌,发酵后期平板计数法均检测不到阪崎克罗诺杆菌,但16s rDNA和PMA-qPCR技术均可检测到阪崎克罗诺杆菌活菌的存在。该研究结果说明,阪崎克罗诺杆菌在牛奶发酵后进入了“活的非可培养”状态,该状态的存在会导致该菌检测时活菌数量的低估,从而引发乳及乳制品的安全隐患。     

酸乳发酵中优良共生酵母菌的筛选

为了筛选酸乳发酵中与保加利亚乳杆菌优良共生的酵母菌。以保加利亚乳杆菌单菌发酵酸乳为对照,将前期从新疆、西藏和青海等地区传统自制乳制品中分离的27株酵母菌株分别和保加利亚乳杆菌混菌发酵制备酸乳,通过比较凝乳时间、感官特性、质地特性、后酸度、粘度、持水力、乙醛和双乙酰含量等特征,筛选酸乳发酵中与保加利亚乳杆菌优良共生的酵母菌株;基于26S D1/D2区和ITS1序列鉴定菌株。结果显示:27株酵母菌株均没有明显促进凝乳作用,9株菌混菌发酵酸乳在感官评价得分较高(80分以上),其中菌株"XS1"混菌发酵的酸乳质地特性表现优良,后酸度为4°T、持水力为100%、双乙酰含量12.65 μg/mL、乙醛含量7.19%,分子生物学方法鉴定"XS1"为马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。结论:菌株"XS1"可以为开发新型酸乳提供参考。