胞内磷酸化蛋白酪氨酸激酶的流式细胞术检测

目的: 建立流式细胞术检测细胞内磷酸化蛋白酪氨酸激酶(PTKs)的方法。方法: 用佛波醇酯(PMA)及植物血凝素(PHA)刺激Jurkat细胞,用两种不同的固定和透膜方法处理细胞,加磷酸化PTKs特异性单抗P-Tyr-100及FITC标记的二抗,建立胞内磷酸化PTKs的流式细胞检测技术;同时,用免疫印迹方法检测磷酸化PTKs以资对照。用双色荧光技术,对结核杆菌抗原(Mtb-Ag)活化的外周血单个核细胞(PBMC)中的γδT细胞进行胞内PTKs分析。结果: PHA及PMA刺激能够使Jurkat细胞中磷酸化PTKs明显增加,流式细胞术与免疫印迹方法检测的结果一致。通过双色荧光技术检测发现,Mtb-Ag刺激PBMC,可以优先诱导γδT细胞胞内PTKs的活化。结论: 利用流式细胞术可在单细胞水平分析细胞内PTKs的磷酸化状态。     

细胞因子对类风湿关节炎病人滑膜细胞DNA合成和蛋白激酶的影响

类风湿关节炎 (ＲＡ)的发病与关节液中异常增高的细胞因子密切相关 ,高水平的因子持续刺激滑膜细胞 ,引起细胞内蛋白激酶的持续激活和过度的信号传导 ,从而调控相关基因的过量表达。ＲＡ的关节液及滑膜组织中表皮生长因子(ＥＧＦ)和肿瘤坏死因子 (ＴＮＦ) α的含量明显高于骨性关节炎(ＯＡ)。但是 ,两者对ＲＡ滑膜细胞的作用及细胞内相关信号传导分子的活性变化尚少有报道。一、材料和方法1.材料 :滑膜组织取自本院 2 0例手术治疗的ＲＡ病人(均符合 1987年美国风湿病协会诊断标准[1] )。ＴＮＦ α(5 0 0万Ｕ/ｍｌ,第四军医大学惠赠 ) ,ＥＧ…     

磷酸化蛋白酪氨酸激酶在胆脂瘤上皮细胞中的表达

目的：从蛋白酪氨酸激酶(PTKs)信号传递系统的角度来探讨胆脂瘤上皮细胞增殖的分子机制。方法：采用免疫组织化学S-P方法和计算机图像分析系统,观察30例胆脂瘤上皮及19例胆脂瘤患者外耳道皮肤中磷酸化PTKs的表达。并结合炎症浸润、骨质破坏程度作统计学分析。结果：磷酸化PTKs呈棕黄色或棕褐色颗粒胞膜显色。与皮肤相比,胆脂瘤上皮细胞磷酸化PTKs的表达显著增强,且在不同的上皮及同一上皮的不同部位其表达具有不均一性,在重度炎症细胞浸润的上皮细胞磷酸化PTKs表达趋向于增强;不同的骨质破坏程度PTKs的表达差异无统计学意义。结论：胆脂瘤上皮细胞具有过度增殖能力。同时也存在抑制细胞增殖的机制;局部炎症可增强胆脂瘤上皮细胞增殖能力。     

酪氨酸激酶相关蛋白-2(180-188)表位的修饰和初步鉴定

目的修饰人黑色素瘤分化抗原酪氨酸激酶相关蛋白-2的HLA—A2．1限制性的优势表位（180-188)(SVYDFFVWL),提高其与HIA—A2．1分子的结合能力。方法采用MHC主要和次要锚着位的优势氨基酸替换天然表位的相应位点,用多项式方案、量化基序法和QSAR法初步扫描并筛选出与HLA—A2．1亲和力可能较高的多肽,进一步在体外鉴定多肽与HLA—A2．1分子的结合亲和力和结合稳定性。结果与天然肽相比,SML多肽与HLA—A2．1分子的亲和力和结合稳定性较天然表位显著提高。结论SML多肽可能是TRP-2（180-188）天然表位的激动剂。     

人类风湿性关节炎B型滑膜细胞的分离、培养和纯化

目的 建立一种人类风湿性关节炎滑膜细胞的体外分离、培养和纯化方法.方法 关节镜下钳取膝关节滑膜组织,采用组织块培养法和酶消化法分离滑膜细胞.经台盼蓝拒染计数,将细胞按3.2×106接种于培养瓶,传代培养.从形态学、光镜、细胞免疫化学、生长特性鉴定细胞类型.结果 反复贴壁和多次消化达到形态学上的纯化要求,纯度达96%以上,活性率为98%,成纤维细胞经鼠抗人单克隆抗体染色阳性,符合B型滑膜细胞特征.结论 本研究建立了简单易行的滑膜细胞分离、培养和纯化方法.为类风湿性关节炎致病机制的研究和治疗提供极有意义的体外细胞模型.     

酪氨酸激酶下游蛋白基因与肿瘤关系的研究进展

酪氨酸激酶下游蛋白(DOK)在受体酪氨酸激酶介导的信号通路中起着重要的调节作用。DOK蛋白参与细胞生命活动相关的多种信号通路的调节,其表达异常与多种肿瘤的发生和发展密切相关,但具体作用机制尚不完全清楚。研究DOK基因在肿瘤中的表达与意义对肿瘤的诊断和预后有极其重要的价值,也可为表观遗传学治疗恶性肿瘤提供新的方向和依据。     

用差示PCR法筛选类风湿性关节炎滑膜细胞中的高表达基因

目的 筛选类风湿性关节炎（RA）滑膜细胞中的高表达基因,以探讨RA滑膜细胞发生肿瘤样增殖和侵蚀软骨的分子机理。方法 以骨性关节炎（osteoarthritis,OA)滑膜细胞作对照,采用差示PCR（differentially display PCR)方法,克隆RA滑膜细胞中高表达的cDNAs片段,经反向点杂交排除假阳性克隆后,将阳性克隆进行基因序列分析,结果共回收76仆差异条带,得到42个有插段的克隆,经反向点杂交后得到22个阳性克隆,对其中19个克隆进行基因序列分析表明,最长片段为501bp长,最短片段为145bp长,大部分在300bp,有13个克隆为已知基因,其中包括组织蛋白酶,其它6个克隆为未知序列,这些未知序列中除一个序列外酶,其它6个克隆为未知序列,这些未知序列中除一个序列外都为基因的非编码区,结论 差示PCR方法在筛选差异表达基因方面存在着很大的局限性,组织蛋白酶B可能与RA滑膜细胞的软骨侵蚀性有关。     

和厚朴酚通过上调TRAF3表达对类风湿关节炎滑膜细胞活化的影响

目的 研究和厚朴酚(HNK)对类风湿关节炎滑膜细胞(FLS)活化的抑制作用及其分子机制.方法 将肿瘤坏死因子(TNF)-α处理MH7A细胞建立FLS活化模型,细胞外调节激酶(ERK)抑制剂MK-8353(MK)抑制ERK激活,siRNA干扰抑制肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3)表达.采用CCK-8检测细胞增殖,ELISA检测白细胞介素(IL)-6和CXC趋化因子配体10(CXCL10)分泌情况,Western blot检测基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、TRAF3和p-ERK蛋白表达,Real-time PCR检测TRAF3 mRNA表达.结果 TNF+HNK组细胞增殖较CON组和TNF组明显降低,且IL-6、CXCL10分泌和MMP-2、MMP-9蛋白表达较TNF组明显降低(P<0.05).与CON组和TNF组相比,TNF+HNK组TRAF3 mRNA和蛋白表达均明显升高(P<0.05).si-TRAF3组TRAF3蛋白表达较si-CON组明显降低(P<0.05),TNF+HNK+si-TRAF3组IL-6、CXCL10分泌和MMP-2、MMP-9蛋白表达较TNF+HNK组明显升高(P<0.05).与CON组和TNF组比较,TNF+HNK组p-ERK1/2蛋白表达明显升高(P<0.05),TNF+HNK+MK组p-ERK1/2、TRAF3蛋白表达明显低于TNF+HNK组(P<0.05).结论 HNK可能通过激活ERK信号通路引起TRAF3表达上调,进而抑制FLS活化.     

和厚朴酚通过上调TRAF3表达对类风湿关节炎滑膜细胞活化的影响

目的 研究和厚朴酚(HNK)对类风湿关节炎滑膜细胞(FLS)活化的抑制作用及其分子机制.方法 将肿瘤坏死因子(TNF)-α处理MH7A细胞建立FLS活化模型,细胞外调节激酶(ERK)抑制剂MK-8353(MK)抑制ERK激活,siRNA干扰抑制肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3)表达.采用CCK-8检测细胞增殖,ELISA检测白细胞介素(IL)-6和CXC趋化因子配体10(CXCL10)分泌情况,Western blot检测基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、TRAF3和p-ERK蛋白表达,Real-time PCR检测TRAF3 mRNA表达.结果 TNF+HNK组细胞增殖较CON组和TNF组明显降低,且IL-6、CXCL10分泌和MMP-2、MMP-9蛋白表达较TNF组明显降低(P<0.05).与CON组和TNF组相比,TNF+HNK组TRAF3 mRNA和蛋白表达均明显升高(P<0.05).si-TRAF3组TRAF3蛋白表达较si-CON组明显降低(P<0.05),TNF+HNK+si-TRAF3组IL-6、CXCL10分泌和MMP-2、MMP-9蛋白表达较TNF+HNK组明显升高(P<0.05).与CON组和TNF组比较,TNF+HNK组p-ERK1/2蛋白表达明显升高(P<0.05),TNF+HNK+MK组p-ERK1/2、TRAF3蛋白表达明显低于TNF+HNK组(P<0.05).结论 HNK可能通过激活ERK信号通路引起TRAF3表达上调,进而抑制FLS活化.     

滑膜细胞培养上清液对成纤维细胞增殖反应的影响

采用组织块培养法可获得滑膜成纤维细胞。成纤维细胞增殖反应最适浓度为２×１０８Ｌ－１，亚适浓度为１×１０８Ｌ－１。佐剂性关节炎（ＡＡ）大鼠不同稀释度滑膜细胞培养上清液均可促进亚适浓度成纤维细胞增殖反应，其最适稀释度为１２０。这些结果提示，ＡＡ大鼠关节损伤可能与滑膜细胞分泌炎症介质促进成纤维细胞增殖有关。     

髓样细胞触发受体2在酪氨酸激酶结合蛋白基因敲除小鼠不同脑区的表达

目的比较髓样细胞触发受体2(triggering receptor expressed on myeloid cell 2,TREM2)在不同月龄酪氨酸激酶结合蛋白(tyrosine kinase binding protein,TYROBP)基因敲除小鼠和野生型小鼠不同脑区的表达差异,探讨TREM2、TYROBP与早发型阿尔茨海默病(early onset Alzheimer's disease,EOAD)的关系。方法健康TYROBP基因敲除的小鼠根据基因测序结果分成3组:纯合型(TYROBP-/-)组、杂合型(TYROBP-/+)组和野生型(wild type,WT)组,3组小鼠分别在2、4、6月龄各选10只,运用Western blot和RT-qPCR技术检测TREM2在前额叶、海马中的表达情况。结果(1)在前额叶中:Western blot和RT-qPCR共同显示,与各月龄WT组[2月龄:(0.993±0.048),(1.654±0.033);4月龄:(0.503±0.019),(2.169±0.023);6月龄:(0.600±0.036),(1.468±0.057)]相比,TREM2蛋白和mRNA在2月龄TYROBP-/+组[(0.746±0.062),(1.137±0.067)]和TYROBP-/-组[(0.661±0.028),(0.644±0.012)]的表达均降低,而在4月龄和6月龄TYROBP-/+组[4月龄:(1.140±0.006),(5.483±0.088);6月龄:(0.827±0.043),(3.020±0.082)]和TYROBP-/-组[4月龄:(1.071±0.010),(3.012±0.150);6月龄:(0.627±0.026),(1.633±0.027)]的表达均升高,差异具有统计学意义(F=12.946,134.445;725.318,289.202;12.172,202.791;均P<0.05),且4月龄小鼠升高更明显。(2)在海马中:Western blot显示,与各月龄WT组[2月龄:(1.268±0.036);4月龄:(0.813±0.010);6月龄:(0.312±0.021)]相比,TREM2蛋白在2月龄TYROBP-/+组[(0.804±0.034)]和TYROBP-/-组[(0.534±0.020)]的表达降低,而在4月龄和6月龄TYROBP-/+组[(0.932±0.011);(0.769±0.031)]和TYROBP-/-组[(0.910±0.014);(0.609±0.018)]的表达均升高,差异具有统计学意义(F=142.807,27.884,94.067;均P<0.05),且4月龄小鼠升高更明显。结论TREM2在2月龄TYROBP基因敲除小鼠脑组织中表达降低,在4月龄和6月龄TYROBP基因敲除小鼠脑组织中表达升高,推测TREM2/TYROBP信号通路参与EOAD的病理过程并且在EOAD的不同病理阶段发挥着不同的作用。     

光动力疗法对H22细胞蛋白酪氨酸激酶及磷酸酶活性的影响

目的探讨光动力作用对肿瘤细胞信号转导系统的影响.方法运用放射免疫及酶联免疫的方法,检测光动力作用后H22细胞胞浆蛋白酪氨酸激酶及磷酸酶活性的动态变化,比较各组有无显著差异.结果光动力作用后,H22细胞蛋白酪氨酸激酶活性随时间的延续而出现先升后降的动态变化,而蛋白酪氨酸磷酸酶活性在光动力作用后则相应伴随有一个先降后升的动态变化.结论光动力作用能够促使H22细胞蛋白酪氨酸激酶和蛋白酪氨酸磷酸酶的活性改变,反映了蛋白酪氨酸残基磷酸化与去磷酸化的即时调节机制,提示胞内信号转导系统的激活.     

类风湿性关节炎滑膜细胞凋亡研究进展

类风湿关节炎（RA）是一种主要累及小关节的慢性自身免疫性疾病。研究表明，RA滑膜细胞与疾病的发展存在着某些相关性。RA来源的滑膜细胞主要是指淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞和内皮细胞以及成纤维细胞，近来研究发现滑膜细胞的凋亡在RA的发病过程中起着十分重要的作用。     

血啉甲醚和血卟啉衍生物在类风湿关节炎滑膜细胞中吸收特性的对比研究

目的：探讨体外培养的类风湿性关节炎（RA）患者的滑膜细胞对光敏剂血淋甲醚（HMME）的吸收特点,并与目前常用的光敏剂血卟啉衍生物（HpD)进行对比。方法：用荧光分光光度计法检测RA滑膜细胞对HMME、HpD的吸收量与孵育时间和孵育浓度的关系。结果：①RA滑膜细胞对HMME、HpD的吸收量随着孵育浓度的增加而增加。当培养液中光敏剂浓度达80μg/ml时,孵育1h细胞内HMME含量达到饱和状态;而HpD的浓度要到140μg/ml时细胞内的吸收量才达到高峰,当两种光敏剂细胞内浓度均达高峰时,HMME的含量为HpD含量的2倍。②细胞对两种光敏剂的吸收量亦随着孵育时间的增加而增加,HMME吸收得更快,第15分钟时吸收量为最大吸收量的52．9％,第60分钟为84．4％,细胞对HpD的吸收第15分钟为49．1％,第60分钟为69．2％。结论：与光敏剂HpD相比,RA滑膜细胞能更多更快地吸收HMME。推测HMME较HpD更适合用于光动力疗法滑膜切除术。     

艾灸对实验性类风湿关节炎滑膜细胞原癌基因 c-fos和c-myc mRNA表达的影响

目的观察艾灸对实验性类风湿关节炎滑膜细胞原癌基因c-fos、c-myc mRNA表达的影响,初步探讨艾灸对RA滑膜细胞内分子信号传导的调控.方法在日本大耳白兔右后足踝关节部皮内注射福氏完全佐剂造模,经过艾灸治疗,通过半定量RT-PCR测定c-fos和c-myc mRNA的表达量.结果治疗组c-fos和c-myc mRNA表达量显著低于造模组(P＜0.01).结论艾灸治疗能够降低c-fos和c-myc mRNA的表达,影响生长因子信号传导系统.     

桂枝挥发油对LPS致急性肺损伤大鼠模型蛋白酪氨酸激酶活性的影响

目的探讨桂枝挥发油对LPS致大鼠急性肺损伤模型蛋白酪氨酸激酶活性的影响;方法采用LPS 1 mg/kg尾静脉注射构建大鼠急性肺损伤模型,取肺组织,采用ELISA方法检测不同干预组肺组织中PTK含量,比较组间差异;结果研究表明,SD大鼠正常肺组织中PTK含量为(44.21±31.51)pmol/mL;模型组含量为(173.58±97.95)pmol/mL,较空白组显著增高,具有极显著的统计学意义(P＜0.001);VORC高、中、低3个剂量组PTK含量均较模型组显著降低(P＜0.05),有一定的量效关系.结论桂枝挥发油能够抑制LPS所致大鼠急性肺损伤肺组织中PTK的异常增高,对PTK活性的抑制可能是桂枝挥发油发挥抗炎作用的主要机制之一.     

酪氨酸激酶Etk的表达与鼻咽癌细胞凋亡之间的关系

目的:观察酪氨酸激酶Etk的表达与放射引起的鼻咽癌细胞株凋亡之间的关系,探讨Etk对放射引起的鼻咽癌细胞凋亡的调节机制.方法:运用免疫荧光技术和流式细胞术检测4株鼻咽癌细胞Etk的表达情况;直线加速器6MV-X射线2 Gy单次剂量照射细胞后,用流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化,以及与Etk,凋亡相关蛋白Bcl-2及Bak表达的关系.结果:流式细胞仪检测显示4株鼻咽癌细胞Etk表达水平分别为:5-8F(73.3±3.4)%, 6-10B(50.5±6.1)%,CNE-1(47.7±1.9)%,CNE-2(29.5±1.7)%.免疫荧光显示,Etk蛋白主要在鼻咽癌细胞胞质中表达,胞核中表达微弱.统计分析表明,放射线照射后,鼻咽癌细胞株Etk的表达降低,并与细胞的凋亡率及Bak蛋白的表达呈负相关,与Bcl-2的表达无关.结论:Etk蛋白与放射引起的鼻咽癌细胞凋亡有关,它可能通过调节凋亡蛋白Bak的表达参与了放射后鼻咽癌细胞的凋亡.     

黏着斑激酶酪氨酸磷酸化在牵拉依赖的细胞形态改变中的作用

【目的】探讨黏着斑激酶 (FAK) 397和 92 5位酪氨酸残基 (Y397,Y92 5 )酪氨酸磷酸化在单轴周期性牵拉引起的细胞形态改变 (垂直于牵拉轴方向排列和伸长 )中的作用。【方法】用含 10 0mL/L胎牛血清的DMEM培养大鼠成纤维细胞3Y1。利用PCR法从人的脐静脉内皮细胞获得FAKcDNA。通过直接点突变 ,利用重叠PCR制成突变的FAK(F397Y ,F92 5Y)。将FAK突变转染到细胞内 ,使细胞遭受牵拉 ,牵拉 0min为对照组 ,牵拉 5、10、2 0、30、6 0min为牵拉组 ,实验重复 3次 ,实验数据利用方差分析和多重比较进行分析。然后利用FAKY397和Y92 5磷酸化的特殊抗体进行了免疫印迹实验 ,采用信息分析程序 (Mocha ,JandelScientific)测定免疫印迹的密度 ,比较对照组与牵拉组 ,检测FAK酪氨酸磷酸化 ,分析细胞形态改变。【结果】在牵拉反应中 ,FAKY397和Y92 5的酪氨酸磷酸化水平比对照组明显增高 (P <0 0 5 ) ,并且峰值分别在牵拉后 5min(2 75± 0 5 1倍 ,n =3)和 2 0min(2 98± 0 5 8倍 ,n =3)。另一方面 ,在突变FAK转染的细胞中 ,牵拉引起的细胞形态改变被有意义的阻滞了。【结论】牵拉引起的FAK酪氨酸磷酸化在牵拉依赖的细胞形态改变中起着重要作用。